Lékařská fakulta, Masarykova Univerzita

Ke skutečnému nastavení léčby na míru každého pacienta by mohly napomoci další biologické charakteristiky nádoru včetně reakce na chemoterapii in vitro.
*II-1. Biologický profil nádoru vč. předpovědi reakce na léčbu, Význam testů chemorezistence in vitro (MTT)
Doposud celá diagnostika nádoru končila určením typu, stagingem a gradingem. Nicméně na základě mnoha studií, kde rozdíly efektu v léčbě mezi jednotlivými stadii nebo grady nádoru nebyl významný, anebo rozptyly v rámci jedné takto vybrané skupiny byly příliš velké ukazují, že toto členění nádorů je zcela nedostatečné. Jednak není na základě současných diagnostických metod některý z těchto parametrů určen správně, jednak jistě existují i jiné skryté faktory ovlivňující chování nádoru a průběh léčby. Do budoucna je nezbytné k těmto charakteristikám přidat ještě další, a to genetický profil nádoru, či testování biologického chování in vitro tak, aby byla vybrána ideální léčba a dispenzarizační schéma pro konkrétního pacienta. Potenciálně je možné určit genetiku nádoru (viz výše) a citlivost na cytostatickou nebo jinou léčbu (in vitro testy chemorezistence). K tomu je nutno přidat detekci onkogenů, detekci exprese specifických metaloproteináz, exprese p53, genové polymorfizmy – neboli různé funkční varianty téhož genu, které hrají významnou roli jednak v biologické charakteristice nádoru, jednak v jeho odpovědi na léčbu. Dnes lze detekovat:

1. expresi genů souvisejících přímo s nádorovým bujením – promotory, overexprese CDC genů, včetně FGFR,VEGFR, CD117, nebo naopak defekty v kvalitě nebo kvantitě exprimovaných supresorových genů – p53.

2. expresi a polymorfismy genů souvisejících s odpovědí na léčbu : K-RAS polymorfismy, Multidrug-rezistence gen, atd.

3. povrchové antigeny – ICAM, VCAM, MMP, receptory pro růstové faktory, BRCA, CD117, EGFR.

4.globální reakci na různou léčbu ve tkáňových kulturách, například testy chemorezistence in vitro. V tomto případě je samozřejmě vhodné do budoucna provádět imuno-selekci izolovaných buněk a testovat specificky každou subpopulaci zvlášť.

5. Do budoucna bude nutné určit procento nádorových „kmenových buněk“ a jejich vlastnosti, tj. CD 133, CD44, a CD 117 pozitivních a cytokeratin-20 negativních buněk. Je potřeba identifikovat ještě další markery této privilegované skupiny buněk. Např. testováním v kultuře rezistentních buněk s detekcí nových CD antigenů.

Význam rozšířené diagnostiky je zřejmý. Pacienti s metastazujícím kolorektálním karcinomem s mutací k-ras genu (až 40% pacientů), nemají při použití anti EGFR protilátky (panitumumab, cetuximab) blokovánu nitrobuněčnou kaskádu tohoto receptoru (tabulka II-1)(Khambata-Ford 2007).

Tabulka II-1: výsledek léčby panitumumabem u pacientů s kolorektálním karcinomem v závislosti na přítomnosti mutací k-ras genu

Výsledek	k-ras mutace ANO	k-ras mutace NE
Response rate %	0	17
Stabilní choroba %	12	34
Medián doby do progrese v týdnech	7,4	12,3

Že dochází k patologické aktivaci druhých poslů níže než na úrovni EGFR dokládají i podobné výsledky při léčbě blokátory přímo tyrozin-kinázové aktivity EGFR (erlotinib, gefitinib) u pacientů s plicním karcinomem.

Existuje také geneticky podmíněná konkurence mezi některými cytostatiky. Například nádorové kultury citlivé na pemetrexed jsou rezistentní k cisplatině a naopak (Duke 2007). Důležitý je ale klinicky pozorovaný fakt, že pokud se léčí buňky citlivé na pemetrexed nejprve cisplatinou, stanou se na pemetrexed rezistentní. Efekt vyžaduje další zkoumání, ilustruje však význam volby správného cytostatika.

V praxi je využití genomiky pro předpověď reakce na léčbu relativně nákladné, navíc ne vždy se podaří odhalit všechny možné biologické charakteristiky relevantní pro předpověď léčebné odpovědi. Ty se liší mechanismem i typem cytostatika. Může to být exprese p-glykoproteinu, membránové ATP pumpy, která odstraňuje z buněčného nitra různé škodlivé molekuly, nebo to může být syntéza glutathion-S-transferázy, která detoxikuje jedy jejich konjugací s glutathionem. Mohou to být ale také mutace v cílových proteinech (u inhibitorů thymidylátsyntázy nebo topoizomerázy II), aktivace mechanismů opravujících poškozenou DNA (u alkylačních činidel), změny ve stavbě buněčných membrán znesnadňující pronikání cytostatik do buněk, vyřazení mechanismů apoptózy a další. Všechny molekulární mechanismy však umožňuje obejít globální testování chemorezistence nádorů in-vitro. Smyslem testování je eliminace neúčinných preparátů. Z čerstvě odebrané nádorové tkáně je připravena suspenze buněk a rozdělena na malé alikvoty. Ty jsou následně inkubovány s testovanými cytostatiky a pro jednotlivé alikvoty je za těchto podmínek vyhodnocena míra proliferace a viability buněk. K tomuto účelu lze využít tzv. MTT test. Jeho podstatou je měření celkové aktivity mitochondriálních dehydrogenáz, která koreluje s počtem metabolicky aktivních buněk v kultuře. Ke kultuře se přidá některý typ tetrazoliových solí (např. MTT, WST-1), které jsou dehydrogenázami štěpeny na barevný formazan, jehož množství v daném vzorku lze vyhodnotit spektrofotometricky. Koncentrace formazanu je nepřímo úměrná účinnosti cytostatika.

Materiál a metodika: V letech 2000-2005 jsme prospektivně sledovali korelaci mezi výsledkem in-vitro stanovení chemorezistence s odpovědí na léčbu u 92 pacientů s kolorektálním karcinomem. U 58 byl vzorek odebrán z metastázy (48x z jaterní) a u 34 pacientů z primárního nádoru. Ze 48 pacientů s jaterní metastázou bylo 31 odresekováno a u 17ti rozsah onemocnění kurativní resekci metastáz znemožnil. U žádného pacienta nebylo provedeno simultánní stanovení chemorezistence jak z primárního nádoru, tak ze synchronní metastázy. Postup samotného testu viz Dodatek 4.

U sledovaných pacientů s metastatickým postižením jater nebyla nikdy změněna chemoterapie I. linie na základě výsledku testů chemorezistence. Bylo tak možno srovnávat prediktivní hodnotu výsledku testů chemorezistence in vitro u našich pacientů. Ne vždy stačilo množství vzorku na testování všech cytostatik. Pokud již byli pacienti přeléčeni nějakou chemoterapií a byli klinicky rezistentní k léčbě, byla primárně testovaná rezervní cytostatika. Standardně byl testován převážně 5-fluorouracil a cisplatina. Křivky se vyhodnocují podle jednoduchého pravidla. Pokud je koncentrace cytostatika, při níž přežívá 50% buněk, nižší než 1/16 nejvyšší koncentrace, která se bere jako toxická, jde o citlivou tkáň. Pokud leží mezi 1/16 a 1/4, jde o tkáň spíše rezistentní, pokud je ještě výše, stupňuje se i rezistence tkáně (a naopak s nižším EC50 roste její citlivost). Druhým kritériem je podíl rezistentních buněk, které přežívají i při toxické koncentraci cytostatika. Ideální je stav, kdy nepřežije žádná buňka, ale obvykle jich přežívá od 0 do 100 %. Procento přeživších zkresluje metabolická aktivace některých rezistentních buněčných klonů, ale přibližně platí, že čím více buněk přežije vystavení toxické koncentraci, tím je prognóza pro pacienta horší. Byl také sledován vliv velikosti odebraného vzorku nádoru a lokalizace na úspěšnost kultivace. Objem odebraného vzorku byl měřen jako zvětšení objemu transportního média po vložení tkáně. Ve sledování významu testování chemorezistence in vitro na odpověď na léčbu a na dobu do progrese bylo využito 48 pacientů s metastázou kolorektálního karcinomu do jater (31 resekovaných a 17 neresekovaných). Ti byli rozděleni do skupin podle citlivosti na cytostatika v in vitro-testu (5-FU byl otestován vždy) na skupiny s dobrou, střední citlivostí k alespoň jednomu podávanému cytostatiku a skupinu rezistentní k podávanému cytostatiku. U pacientů, kde byla prokázána dobrá citlivost na podávané cytostatikum bylo provedeno rozdělení na skupinu s méně než 5% rezistencí k maximální koncentraci cytostatika a na pacienty s vyšším zastoupením rezistentních buněk. Odpověď na léčbu u neresekovaných pacientů byla hodnocena kombinací RECIST kritérií + PET a/nebo UZ vyšetřením s i.v. kontrastem, a nebo konsensem onkologické indikační komise s využitím hladin onkomarkerů a klinického stavu pacienta. Byl porovnán disease free interval v závislosti na shodě citlivosti in vitro s použitým cytostatikem. K porovnání disease free intervalů, případně přežití a doby do progrese bylo využito Kaplan-Meier analýzy a případně logrank testu. Kategorické parametry byly srovnávány testem dobré shody (² testem).

Výsledky: Pokud rozdělíme vzorky podle velikosti, pak vydatnost vzorku – tj. kolik různých cytostatik bylo možno testovat (0-4 a více) udávají následující tabulky (Tabulky II-2, Tabulka II-3 a II-4):

Tabulka II-2: Úspěšnost kultivací u vzorku z metastáz v závislosti na objemu vzorku:

58 pacientů	0-1cm^3	1-2cm^3	2-3cm^3	nad 3cm^3
neúspěšná MTT	2	1	1	1
1 cytostatikum	0	1	2	0
2 cytostatika	2	5	4	1
3 cytostatika	1	2	1	0
4 a více	3	8	13	4
Celkem	8	17	21	6

Tabulka II-3: Úspěšnost kultivací u vzorku z primárního nádoru v závislosti na objemu vzorku:

34 pacientů	0-1cm^3	1-2cm^3	2-3cm^3	nad 3cm^3
neúspěšná MTT	2	3	1	0
1 cytostatikum	0	2	0	0
2 cytostatika	2	1	1	0
3 cytostatika	1	0	0	0
4 a více	3	8	6	2
Celkem	7	14	8	2

Tabulka II-4: Úspěšnost kultivací u všech vzorků v závislosti na objemu vzorku:

92 Pacientů	0-1cm^3	1-2cm^3	2-3cm^3	nad 3cm^3
neúspěšná MTT	4	4	2	1
1 cytostatikum	0	3	2	0
2 cytostatika	4	6	5	1
3 cytostatika	2	2	1	0
4 a více	6	16	19	6
Celkem	15	31	29	8

Z tabulek je zřejmé, že dostatečná velikost odebraného vzorku k testování chemorezistence in vitro je nad 1cm³. Vzorek větší než 3 cm³ pak nezaručí lepší výtěžnost testů chemorezistence, naopak se může zvýšit riziko přerůstání bakteriemi zvláště při odběru z primárního nádoru střeva při snaze získat co největší vzorek.

Pro přerůstání kultury bakteriemi nebylo možno vzorek vyhodnotit u 5 vzorků z primárního nádoru a žádného vzorku z metastázy. Z důvodu malého množství buněk v izolátu nebylo možno určit citlivost k ani jedinému cytostatiku u 5 vzorků z metastázy a u 6 vzorků z primárního nádoru.

Při rozdělení pacientů s metastatickým onemocněním jater na pacienty bez odstranění metastáz, a pacienty po chirurgicky radikálním odstranění metastáz i nádoru bylo možno sledovat odpověď na léčbu v závislosti na výsledku MTT testu. Ze 31 resekovaných pacientů bylo úspěšně testováno 30 pacientů, ze 17 neresekovaných pak byl výsledek chemorezistence in vitro k dispozici u 16 pacientů. Následující tabulka II-5 ukazuje podíl pacientů s různou citlivostí k cytostatikům v těchto skupinách.

Tabulka II-5: Citlivost na alespoň jedno podávané cytostatikum ve skupině pacientů s  jaterními metastázami:

Citlivost	dobrá	střední	rezistentní	celkem
resekovaní	16 (53%)	9 (30%)	5 (17%)	30 (100%)
neresekovaní	9 (56%)	4 (25%)	3 (19%)	16 (100%)
CELKEM	25 (54%)	13 (28%)	8 (17%)	46 (100%)

V zastoupení citlivostí není významný rozdíl mezi jednotlivými skupinami (p > 0,05). Další tabulka II-6 ukazuje odpověď na léčbu u neresekovaných pacientů v závislosti na citlivosti k cytostatikům .

Tabulka II-6: Odpověď na systémovou chemoterapii ve 3 měsících v závislosti na predikované citlivosti na podané cytostatikum

odpověď	úplná	částečná	stable disease	progrese	celkem
dobrá	1 (6%)	5 (31%)	2 (13%)	1(6%)	9 (56%)
střední	0	2 (13%)	1 (6%)	1 (6%)	4 (25%)
rezistentní	0	0	1 (6%)	2 (13%)	3 (19%)
celkem	1 (6%)	7 (44%)	4 (25%)	4 (25%)	16 (100%)

Následující graf II-1 ukazuje dobu do relapsu onemocnění u 23 resekovaných pacientů kteří nebyli dle testu chemorezistence rezistentní k podávanému cytostatiku. Pacienti jsou rozdělení do skupin podle podílu buněk přežívajících i maximální koncentraci cytostatika ( do 5%, 5% a více).
Graf II-1: Kumulativní podíl pacientů bez relapsu onemocnění po resekci v závislosti na množství buněk přežívajících i maximální koncentraci cytostatika.

Nejspíše vzhledem k množství pacientů nebylo možno posoudit statistickou významnost rozdílu (p_LogRank > 0,05). Včasné recidivy onemocnění jsou v obou skupinách stejné, a liší se pouze pozdními recidivami, jak je zřejmé z kubické regrese (hladké křivky) proložené oběmi Kaplan-Meierovými křivkami (schodovité křivky).

Následující graf (Graf II-2) pak srovnává skupinu pacientů po kurativní resekci z hlediska prokázané citlivosti na cytostatika.
Graf II-2: Kumulativní podíl pacientů bez známek recidivy onemocnění v závislosti na prokázané citlivosti k použitému cytostatiku.

Tentokrát je rozdíl statisticky významný (p_LogRank < 0,05). Pacienti s prokázanou dobrou citlivostí k použitému cytostatiku recidivují později. Po 80 měsíci od resekce však je počet recidivujících pacientů stejný.

Diskuse: Tkáň určená k testování musí splňovat některé požadavky. (1) Musí se skutečně jednat o tkáň nádorovou, s minimální „kontaminací“ nenádorovými a stromálními buňkami. Tento požadavek je zajištěn tak, že do laboratoře vstupuje až materiál přesně vybraný, označený a vyšetřený patologem. (2) Musí se jednat o tkáň viabilní. Zachování co nejvyšší viability buněk musí mít na paměti každý pracovník, který se na přípravě tkáně podílí, a tento zájem musí být zohledněn v každém kroku zpracování. Počínaje chirurgem a tedy vyjmutím a prvním ošetřením tkáně (a jejím uložení v bezsérovém kultivačním médiu s antibiotiky – viz níže), přes rychlou a šetrnou přepravu tkáně na oddělení patologie pro její okamžité vyšetření a rozdělení až po její rychlé zpracování v laboratoři. (3) Po celou dobu zpracování musí být zohledněn další požadavek na kvalitu tkáně, a to její sterilita. V případě kontaminace tkáně by totiž mohlo dojít k tomu, že v závěrečné fázi testu by se měřila aktivita dehydrogenáz jiného původu než odvozených z buněk studovaného vzorku.

Pokud je vzorek z primárního nádoru, je možné, že se jedná o jinou subpopulaci než metastatický nádor s jinou citlivostí k léčbě, a naopak. Nicméně v našem souboru nebylo možno vyšetřit synchronně vzorek z jaterní metastázy a z primárního nádoru u žádného pacienta. Při tomto typu kultivací zůstává také otázkou, jaké buňky se ve skutečnosti kultivují. V několika případech, kdy jsme získali přebytek buněk v kultuře jsme při paralelním vyšetření cytospinů ze vzorku zjistili, že jsou případy, kdy kultivované buňky jsou například lymfocyty. Bohužel toto nebylo možno provézt u dostatečného množství vzorků, a tak nemohlo být vyhodnoceno, u kolika pacientů nebyla vlastně testována populace nádorových buněk. Nadále probíhají intenzivní práce na protokolu se snahou o selekci nádorových buněk.

V této studii byli všichni pacienti v iniciálních fázích léčeni FUFA režimem. Podle našich dalších předběžných výsledků u pacientů s režimem FOLFOX případně FOLFIRI se zdá, že význam testování cytostatik by mohl být větší (především s ohledem na volbu režimu FOLFOX vs FOLFIRI, kde by v případě vzniku rezistence mohlo záležet na pořadí podávaných cytostatik). Podání cytostatika, na které je pacient rezistentní sebou mimo nežádoucích účinků bez pozitivního efektu nese i riziko indukce rezistence k jinému cytostatiku, na které by byl nádor primárně původně citlivý (Duke 2007).

Grafy II-1 a II-2 velmi dobře zapadají do teorie o kmenových buňkách nádoru. Dobrá citlivost k cytostatikům (nízká EC 50) znamená dobrý efekt na běžnou většinovou populaci nádoru a tak na časné recidivy. Efekt na kmenové buňky, které by tak mohly být odpovědné za pozdní recidivy, je však stejný. Naopak nízký podíl buněk přežívajících i maximální koncentraci cytostatika může znamenat efekt léčby právě na kmenové buňky zodpovědné za dlouhodobé výsledky léčby. Tento závěr je však nutno potvrdit jednak na větším množství pacientů, jednak skutečnou identifikací kmenových nádorových buněk.

Výhledy do budoucna:

1. 
   Vývoj metodiky kultivace a pomnožení buněk nádoru in vitro z minimálního odběru tkáně nádoru – FNA v ideálním případě – a následné testování cytostatik. V principu je možno ze suspenze buněk pro chemorezistenci in vitro imunoselekcí/adhezí izolovat CD 133 nebo CD 117 či CD 44 buňky, které by se pak expandovaly a kultivovaly v kultuře s přidáním cytostatik. Paralelně by probíhala vyšetření chemorezistence in vitro u ostatní buněčné populace. Léčba by pak mohla být cílena jak na masu tumoru, tak na mateřské kmenové buňky.
   
2. 
   Výzkum cytoskeletu a jaderného cytoskeletu nádorových buněk vůbec s možnou korelací mezi agresivitou nádoru a semikvantitativním zhodnocením rozložení cytoskeletu.
   

III. Současné možnosti farmakologické léčby CRC
Neintervenční léčba nádorů zahrnuje jak genoterapii, tak farmokoterapii a biologickou léčbu nebo vakcíny (TroVax). Na poli farmakoterapie došlo díky zavedení nových cytostatik jako je irinotekan nebo cisplatina a biologické léčby k prodloužení mediánu přežití u neresekabilního stádia IV kolorektálního karcinomu v posledních 7 letech z 9-12 měsíců na dvojnásobek – 10-24 měsíců (důvody a výsledky viz Příloha V). Naopak vzhledem k nízké efektivitě genetické léčby a velice závažným nežádoucím účinkům vektorů bylo mnoho klinických studií genové terapie pozastaveno (Sadelain 2004, Marshall 2002) viz také Příloha IV. Neoadiuvantní chemoterapie před resekcí jaterních metatáz je také podrobována neustálé diskuzi (Garufi 2004, Bilchik 2004) včetně určitých prblémů při použití Bevacizumabu.

Málokdo si uvědomuje, že již dnes využíváme k léčbě pacientů s nádory nanotechnologií (Doxil). Ty mohou pomoci v syntéze nových komplexních léčiv či v obejití rezistence k cytostatikům, ale i v diagnostice (SPIONy pro MRI). Mají také významné imunomodulační vlastnosti (podrobně viz příloha VI).

*IV. Lokoregionální intravaskulární léčba

Myšlenka selektivního léčení nádoru se šetřením ostatního organismu není nová. Chirurg se vlastně nesnaží dělat nic jiného. U chemoterapie nám zatím chyběl způsob jak lék dopravit cíleně jen do nemocné tkáně a tam jej udržet. Nástroj do rukou nám dal až rozvoj endovaskulárních metod, pokroky v nových materiálech a technologiích. Nicméně, stále se jedná o makroskopicky cílené léčení, které na jedné straně nevylučuje zcela efekt na celý organismus (stresová zánětlivá reakce po RFA, vyplavování cytostatika při lokální chemoterapii) a jednak nezaručuje ošetření všech mikrometastáz, které mohou být i mimo cílová ložiska.