Projeto de Pesquisa



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Edital FACEPE N° 20/2014 (APQ)

FACEPE – Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco


Projeto de Pesquisa: Plantas da Caatinga com potencial bioativo no controle de fitopatógenos radiculares do feijoeiro

Recife


2015

Identificação da Proposta: Plantas da Caatinga com potencial bioativo no controle de fitopatógenos radiculares do feijoeiro
Proponente: Dr. Antonio Félix da Costa
Resumo

O feijão, dentre inúmeras culturas exploradas economicamente, destaca-se pela grande importância econômica e social no Brasil, em especial na região Nordeste, sendo uma das principais fontes de proteína vegetal e ferro na alimentação humana. Sabe-se que o feijoeiro é considerado sensível, ao déficit, bem como ao excesso de água no solo, e sua produtividade é afetada por diversos fatores, como as doenças, com destaque para as causadas por fungos do solo, que podem causar prejuízos severos. Os fungos habitantes do solo causam sérias doenças e, dependendo do patógeno, ocasionam lesões nos órgãos de reserva, no caule, nas raízes, no sistema vascular, tombam plântulas ou plantas bem desenvolvidas e, dependendo da intensidade da doença, levam as plantas à morte. Essas doenças propiciam queda de produção e prejuízos financeiros para os produtores. Exemplos de fungos de solo de importância para a cultura do feijão são: Sclerotium rolfsii, Fusarium solani, Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, Macrophomina phaseolina, Sclerotinia sclerotiorum, etc. O controle de doenças radiculares é muito difícil, pois os patógenos coevoluíram com as plantas por milhões de anos e estão altamente adaptados ao ambiente subterrâneo, em associação com o hospedeiro. Entretanto, a utilização do controle químico é uma realidade e seu uso inadequado pode ocasionar grande impacto no meio ambiente, contaminando lençóis freáticos, causando desequilíbrios nas populações microbianas no solo, acarretando o surgimento de novas raças de patógenos ou a aparição de outros que se mantinham em equilíbrio. A necessidade de métodos mais seguros, eficientes, econômicos e não poluentes tem estimulado a busca por opções de controle de doenças de plantas cultivadas por meio do controle biológico, da indução de resistência em plantas e do uso de produtos alternativos ao controle químico. O Nordeste do Brasil tem 70% de seu território ocupado por uma vegetação xerófila denominada “caatinga.” Plantas endêmicas são potencialmente boas fontes de novos compostos com atividade biológica por serem únicas naquele ambiente e por apresentarem metabolismo diferenciado das demais similares. Trabalhos desenvolvidos com extratos brutos, obtidos a partir de plantas medicinais conhecidas, têm indicado o potencial das mesmas no controle de fitopatógenos, tanto por sua ação fungitóxica direta, inibindo o crescimento micelial, germinação de esporos e a esporulação, quanto pela indução de fitoalexinas, indicando a presença de composto (s) 3 com característica de elicitor (es). O fracionamento dos metabólitos secundários dessas plantas, bem como a determinação da atividade biológica dessas moléculas, com respeito à atividade elicitora ou antimicrobiana poderá contribuir para a aquisição de maiores conhecimentos que reforcem sua possível utilização como um método alternativo de controle de doenças de plantas causadas por patógenos radiculares.


Palavras-chave: Compostos bioativos; controle alternativo; Phaseolus vulgaris; Vigna unguiculata


Qualificação do principal problema a ser abordado

O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) e o feijão-caupi (Vigna unguiculata (L.). Walp.) são leguminosas de extrema importância social e econômica, consumidas em grandes quantidades, no Brasil e no mundo, por todas as classes sociais, sendo muitas vezes a principal fonte de proteínas, minerais, vitaminas e fibras (YOKOYAMA, 2002; DEL PINO; E LAJOLO, 2003). Fornecem de 10 a 20% dos nutrientes necessários para um adulto, com teor de proteína de 20 a 25%, chegando até a 30% de proteína (BASSINELLO, 2001), que constitui um valioso complemento dos cereais, principalmente onde a população tem limitado acesso à proteína animal (QUINTANA et al., 2002; SERRANO; GOÑI, 2004).

Além da importância do feijão na alimentação da população, toda a cadeia produtiva, incluindo o beneficiamento e a comercialização, gera ocupação e renda, principalmente para a classe de menor poder aquisitivo (GRANGEIRO et al., 2005; FACHINI et al., 2006). De acordo com Aidar (2007), pelo fato dessa leguminosa apresentar um ciclo que varia de 61 a 110 dias, pode ser considerada uma cultura apropriada para compor, desde sistemas agrícolas intensivos irrigados, altamente tecnificados, até aqueles com baixo uso tecnológico, principalmente de subsistência.

A Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO), aponta que a produção mundial de feijão tem se concentrado em países que são os maiores produtores e, ao mesmo tempo, também são os maiores consumidores. Os principais produtores mundiais de feijão são o Myanmar (3.900.000,00 t caupi), a Índia (3.630.000,00 t mistura), o Brasil (2.794.854,00 t - 2/3 Phaseolus), os Estados Unidos (1.448.090,00 t), a China (1.460.698,00 t) e o México (1.080.857,00 t) (FAO/Faostat, 2012), ressaltando-se que esta produção diz respeito a feijão, não necessariamente de Phaseolus vulgaris, mas da ampla variedade de espécies vegetais que recebem esta denominação.

O feijão é cultivado, praticamente em todo território brasileiro, com um rendimento médio de 910 kg ha-1 (CONAB, 2014). A produção de feijão no país, na safra de 2012/2013, ultrapassou 2,8 milhões de toneladas, em uma área plantada total de 3,1 milhões de hectares, valores referentes à soma das três épocas de plantio (CONAB, 2014).

O feijão-caupi apresenta ampla distribuição mundial e encontra-se, principalmente, nas regiões tropicais, cujas características edafoclimáticas assemelham-se às do seu provável centro de origem, a África (FREIRE FILHO et al., 2011). Aproximadamente 14,5 milhões de hectares constituem a área ocupada com feijão-caupi no mundo (MOHAMMED et al., 2010). Segundo Freire Filho et al. (2011), estima-se que, no período de 2005 a 2009, a produção mundial de caupi foi de 5.641.762 toneladas, numa área de 12.218.774 hectares.

No Brasil, o feijão-caupi é mais cultivado nas regiões Norte e Nordeste, sendo neste último uma importante fonte geradora de emprego e renda e constitui-se em um dos principais componentes da alimentação humana nos Estados desta região, estando entre as principais culturas de subsistência, em virtude do elevado teor proteico e energético, constituindo-se numa cultura de valor atual e estratégico (FREIRE FILHO et al., 2011). Segundo Neves et al. (2011), o feijoeiro-caupi é uma planta que apresenta tolerância à seca e pode ser cultivada em diferentes condições de clima e solo, podendo-se inferir que esta é uma cultura fundamental na região Nordeste, por este motivo, constitui-se numa cultura estratégica. Além disso, o caupi também é utilizado como forragem verde, feno, ensilagem, farinha para alimentação animal e adubação verde para proteção do solo (ANDRADE JÚNIOR et al., 2003).

Diversos fatores são responsáveis pela baixa produtividade de feijão no Brasil, entre eles: uso de cultivares pouco adaptadas aos diversos sistemas de produção, baixa utilização de sementes certificadas, cultivo em sistemas de consórcio, manejo inadequado da cultura, deficiência hídrica no florescimento ou na fase de enchimento de grãos, pragas e doenças (CARVALHO et al., 2005; WARWICK et al., 2005; FAO, 2008).

Um dos principais problemas é a ocorrência de doenças, com destaque para as ocasionadas por fungos do solo, que podem causar prejuízos severos, com perdas de 5 até 100%, com diminuição das qualidades fisiológicas, nutricionais e sanitárias do produto colhido, afetando, também, o preço e, por consequência, sua comercialização (BIAZON, 2003). Os fitopatógenos de solo apresentam estruturas de resistência que facilitam sua sobrevivência por vários anos. Esse grupo de patógenos se caracteriza por causar doença no sistema radicular ou até mesmo na parte aérea das plantas (SARTORATO, 2007).

As doenças radiculares, como são conhecidas, estão entre as principais causas de redução na produtividade de culturas de interesse alimentar mundial, entretanto essas doenças têm recebido pouca atenção quando comparadas às doenças foliares, principalmente quando os sintomas são confinados às raízes.

Dentre os fungos que ocasionam doenças no feijoeiro e que estão presentes no solo, podem-se destacar: Scleorotium rolfsii Sacc., Fusarium oxysporum Schlecht. f.sp. phaseoli Kendrick & Snyder, Fusarium solani (Mart.) Sacc. f. sp. phaseoli (Burk.) Snyder & Hansen, Rhizoctonia solani Kuhn [Thanatephorus cucumeris (A.B. Frank) Donk], Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid., Sclerotinia sclerotiorum (Libert) de Bary, Thielaviopsis basicola (Berk. & Broome), Phymatotrichum omnivorum Duggar, e várias espécies de Phytium (SARTORATO, 2007).

As principais doenças do feijoeiro causadas por fungos habitantes do solo são podridão do colo, podridão radicular seca, murcha-de-fusarium, podridão radicular de rizoctonia, murcha da teia micélica (mela), podridão cinzenta do caule, mofo branco e podridão por pitium.

A podridão do colo, ocasionada por Sclerotium rolfsii, é importante e ocorre em regiões de clima tropical e subtropical, em condições de temperatura e umidade relativa do ar elevadas, seguidas de período seco. De acordo com Punja (1985), esse fungo também causa tombamento, podridão radicular e murcha em mais de 500 espécies de plantas. O agente causal dessa doença sobrevive no solo na forma de escleródios, por períodos de um a três anos, possui capacidade de competição saprofítica e produz elevado número de escleródios, tornando difícil seu controle (DANTAS et al., 2002).

As espécies pertencentes ao gênero Fusarium apresentam grande importância econômica, pois são agentes causadores de doenças em diversas culturas. A podridão-radicular-seca é uma doença ocasionada pelo fungo de solo Fusarium solani. A severidade dessa doença aumenta na presença de nematóides, por estes acarretarem ferimentos que facilitam a entrada do fungo. A doença afeta inicialmente as regiões do hipocótilo e da raiz principal das plântulas, causando lesões longitudinais, afiladas e de coloração avermelhada. Progressivamente, as lesões chegam a cobrir todo o sistema radicular da planta. A raiz principal e a parte mais baixa do caule podem secar; consequentemente, o crescimento torna-se mais lento e há o amarelecimento e a queda das folhas, reduzindo a produção da lavoura (ABREU; BIAVA, 2005).

Já o amarelecimento ou murcha-de-fusarium é causada pelo fungo Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. Este fitopatógeno atua invadindo frequentemente as pontas das raízes, podendo penetrar no hospedeiro por aberturas naturais, como verticelas, ou ferimentos (BIANCHINI et al., 1997). Os sintomas dessa doença manifestam-se por perda de turgescência, amarelecimento, seca e queda progressiva das folhas. A ação desse fungo está relacionada aos sintomas de tombamento de plântulas e podridão de raiz de plantas (LUCON, 2010).

De acordo com Vitale et al. (2011), Fusarium lateritium Ness. (Sacc.) tem sido bastante estudado como agente causal de deformação foliar em batata doce, nos Estados Unidos, e da podridão de nozes e azeitona na Itália, sendo um patógeno de planta distribuído globalmente. Este fitopatógeno teve seu primeiro relato de ocorrência de doença no feijoeiro na América do Sul e América Central (LIMA et al., 2013). Sendo importante investigar também este fitopatógeno para avaliar seu efeito no feijoeiro.

A podridão radicular de rizoctonia ou rizoctoniose, ocasionada pelo fungo R. solani provoca sérios danos ao feijoeiro podendo ocorrer até três semanas após o plantio, apresentando sintomas como podridão das sementes e raízes, cancros no hipocótilo, e tombamentos de plântulas (RIOS, 1990). Este é um dos patógenos radiculares mais comuns e de maior importância (CARDOSO, 1990) e é considerada uma das doenças mais destrutivas ao feijoeiro no Nordeste brasileiro, sobretudo na fase de germinação e emergência (COELHO, 2001; ATHAYDE SOBRINHO et al., 2005; TENÓRIO, 2011). O controle da rizoctoniose é muito difícil, pois o patógeno apresenta elevada severidade por possuir grande competição saprofítica e capacidade de sobreviver no solo na ausência do hospedeiro (LEACH; GARBER, 1970). De acordo com Bianchini et al. (1997), este fungo causa lesões deprimidas, geralmente com bordos delimitados, de coloração marrom-avermelhada, na parte basal do hipocótilo e raiz principal das plantas jovens. Com o desenvolvimento da doença, as lesões tornam-se mais pronunciadas, formando cancros avermelhados. O fungo pode destruir parcialmente a raiz principal. Infecções severas podem reduzir o desenvolvimento da planta e acarretar sua morte. A infecção durante a emergência produz cancros profundos nas plântulas, que podem sofrer estrangulamento, levando ao “damping-off” de pré e pós-emergência.

Plântulas são altamente suscetíveis ao patógeno e plantas adultas são menos afetadas. O fungo pode ainda afetar vagens em contato com o solo, causando lesões aquosas ou manchas marrons, e ocasionando manchas amarelas ou esbranquiçadas nas sementes.

A mela ou murcha da teia micélica ocasionada por Thanatephorus cucumeris é uma das doenças mais destrutivas do feijoeiro em climas tropicais úmidos (GÁLVEZ et al., 1989; SCHWARTZ et al., 2005; COSTA-COELHO et al., 2012), podendo destruir lavouras inteiras em poucos dias (CARDOSO, 1997). Existe uma diferenciação de sintomas, relacionada com a identidade dos agentes de infecção. Um tipo de infecção é igualmente produzido pelo micélio e pelo escleródio, enquanto outro é produzido pelos basidiósporos. Quando a infeção ocorre num período mais seco, o micélio ou escleródio provocam, inicialmente, o surgimento de pequenas manchas necróticas (5-10 mm de diâmetro) com o centro marrom e as margens com coloração verde-oliva.

Depois as manchas coalescem e geralmente as folhas são destruídas em 2-3 dias. Em condições de umidade mais elevada, surgem pequenas manchas úmidas, tipo escaldadura, de cor verde-acinzentada, com margens de cor castanho-avermelhadas e, a partir destas lesões o patógeno cresce, formando hifas em ambas as faces da folha, de cor castanho-clara, que podem atingir toda a superfície foliar (folhas, caule e vagens) com que ele está em contato, formando uma teia micélica e afetando toda a planta e as plantas vizinhas (DALLA PRIA et al., 1999).

A podridão cinzenta do caule é uma doença bastante importante no Nordeste do Brasil, particularmente pelo favorecimento decorrente das elevadas temperaturas e estresse hídrico. É incitada por Macrophomina phaseolina, fungo habitante natural do solo, de grande variabilidade patogênica e alta capacidade de sobrevivência sob condições adversas. Os prejuízos á cultura do feijão são determinados pela diminuição do estande, do desempenho produtivo das plantas e da baixa qualidade da semente produzida quanto ao vigor e sanidade (ATHAYDE SOBRINHO et al., 2000). O mofo branco, ocasionado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum, ocorre em grande número de países, principalmente nas regiões de clima temperado e subtropical. O fungo pode afetar toda a parte aérea da planta, causando lesões, inicialmente pequenas e aquosas. Estas lesões rapidamente aumentam de tamanho, tomando todo o órgão afetado e ocasionando podridão mole nos tecidos. Sob condições de umidade, desenvolve-se, sobre as lesões, micélio branco de aspecto cotonoso do fungo. A podridão mole provoca morte de ramos. Nessa fase, observa-se que o micélio branco apresenta engrossamentos, que são os escleródios em formação. Estes são inicialmente brancos e tornam-se negros quando maduros. Vagens afetadas podem conter escleródios e as sementes infectadas são descoloridas ou recobertas pelo micélio branco, podendo ser menores que o normal (BIANCHINI et al., 1997).

Apesar de todo o avança tecnológico obtido ao longo dos anos, o controle de doenças radiculares ainda é muito difícil, pois os patógenos co-evoluiram com as plantas por milhões de anos e estão altamente adaptados ao ambiente subterrâneo em associação com o hospedeiro (MICHEREFF et al., 2005). O surgimento de isolados de fitopatógenos resistentes às substâncias químicas utilizadas ocasionam resultados negativos para sociedade como um todo e para o meio ambiente, devido à poluição causada pelos resíduos. Nesse contexto, a agricultura alternativa estimula a busca de novas medidas de controle (SCHWAN-ESTRADA et al., 2005).

O Nordeste do Brasil tem 70% de seu território ocupado por uma vegetação xerófila denominada “caatinga.” Plantas endêmicas são potencialmente boas fontes de novos compostos com atividade biológica por serem únicas naquele ambiente e por apresentarem metabolismo diferenciado das demais similares (CARTAXO et al., 2010).

As plantas da caatinga com potencial atividade antifúngica que serão utilizadas neste estudo serão: Agave sisalana Perr., Canavalia ensiformis (L.) DC., Datura stramonium L. e Commiphora leptophloeos.

A utilização de produtos naturais no controle de doenças de plantas tem se tornado um meio eficiente para a redução do uso indiscriminado de defensivos. A exploração da atividade biológica dos metabólitos secundários dos extratos brutos e dos óleos essenciais de plantas surge como uma forma potencial de controle alternativo de doenças das plantas cultivadas. Vários extratos brutos e óleos essenciais de plantas já foram testados sobre fungos fitopatogênicos em diversos trabalhos (ARAÚJO et al., 2012; PLODPAI et al., 2013; SUKORINI et al., 2013; TAKATSUKA et al., 2003). O fracionamento dos metabólitos secundários dessas plantas, bem como a determinação da atividade biológica dessas moléculas, com respeito à atividade elicitora ou antimicrobiana poderá contribuir para a aquisição de maiores conhecimentos que reforcem sua possível utilização como um método alternativo de controle de doenças de plantas (CASTELLANOS et al., 2001). O principal papel dos metabólitos secundários é a proteção contra pragas e patógenos. Pode se dizer que a ampla variedade de compostos produzidos pelas plantas é o produto de milhares de anos interagindo com os mais diferentes organismos. De modo mais específico, muitas plantas desenvolveram substâncias que são verdadeiros inseticidas ou fungicidas naturais.

Trabalhos desenvolvidos com extrato bruto ou óleo essencial de plantas medicinais e aromáticas, obtidos a partir da flora nativa, têm indicado o potencial de controle de fitopatógenos, tanto pela ação fungitóxica direta, inibindo o crescimento micelial e a germinação de esporos, quanto pela indução de fitoalexinas, indicando a presença de composto (s) com característica (s) de elicitor (es) (STANGARLIN et al., 1999; SCHWAN-ESTRADA et al., 2000; CUNICO et al., 2004; BONALDO et al., 2004; BASTOS & ALBUQUERQUE, 2004).

Dessa forma, as plantas da caatinga possuem características singulares, sendo assim excelentes alvos para a busca de novas substâncias ativas. Adicionalmente, diante da velocidade do fenômeno de devastação da caatinga, há o risco que muito das propriedades medicinais dessas plantas não sejam reconhecidas, o que torna mais urgente intensificar os investimentos nessa área.

Os compostos produzidos pelos vegetais são agrupados em dois grupos: os metabólitos primários, tais como carboidratos, aminoácidos e lipídeos; e os metabólitos secundários que são compostos elaborados a partir da síntese dos metabólitos primários, tais como compostos fenólicos, terpenóides, óleos essenciais e alcalóides entre outros. São esses compostos os responsáveis pelos efeitos medicinais, ou tóxicos, das plantas, e eles apresentam grande importância ecológica, uma vez que podem atuar na atração de polinizadores, ou representar uma defesa química contra estresse ambiental. O conhecimento da química de espécies nativas é um aspecto importante em face da biodiversidade do nosso país.

Apesar da reconhecida atividade biológica de metabólitos secundários, o Brasil é deficiente em grupos de pesquisa cujas atividades estão dirigidas ao controle dos processos metabólicos de tais substâncias, dado que menos de 1% das espécies medicinais nos diferentes ecossistemas foram quimicamente estudadas. Nessa área temática, dar-se-á ênfase ao isolamento, caracterização estrutural e modificação química de moléculas extraídas da biodiversidade brasileira para posterior uso na funcionalização de superfícies. É uma ciência complexa, dependendo de áreas do conhecimento, e consequentemente, profissionais especializados em diferentes partes do saber. A equipe executora conta com a participação de profissionais com experiência Botânicos/taxonomistas, Microbiologistas, Bioquímicos e Biologistas moleculares com experiência em área específica relacionada ao projeto. Já existe a cooperação entre algumas instituições: Centro de Ciências Biológicas/Departamento de Bioquímica/Lab. Biologia Molecular Vegetal/UFPE, Laboratório de Genoma do IPA. Neste projeto propõe-se isolar e identificar metabólitos secundários oriundos de plantas endêmicas da caatinga e avaliar o seu potencial antifúngico in vitro e in vivo, em fitopatógenos de solos em feijoeiro.

Objetivo Geral

Isolar e identificar substâncias bioativas em extratos vegetais extraídos de plantas da Caatinga com potencial de atividade antifúngica in vivo e in vitro, em fitopatógenos do feijoeiro.


Objetivos específicos

- Investigar o potencial antifúngico de extratos vegetais de plantas da Caatinga;

- Identificar compostos bioativos (metabólitos secundários) em extratos vegetais;

- Controlar doenças radiculares do feijoeiro por meio de produtos não prejudiciais ao homem e ao meio ambiente;

- Difundir novas tecnologias de controle alternativo de doenças aos produtores da região do semiárido nordestino.
Metas

- Utilizar o potencial oferecido pela biodiversidade brasileira, em especial da Caatinga, para gerar, pelo menos, um novo produto e um novo processo de elevado valor agregado;

- Isolar quatro biomoléculas/metabólitos de plantas da caatinga com atividade antifúngica a patógenos radiculares do feijoeiro;

- Realizar duas apresentações orais de trabalhos em congressos;

- Publicar cinco artigos científicos em revistas indexadas de circulação internacional;

- Selecionar uma inovação para transferência tecnológica.


Metodologia


conector de seta reta 53


Coleta e identificação dos isolados fúngicos

As amostras de feijoeiro com sintomas de doença serão levadas para os locais de execução para posterior manipulação. O material vegetal obtido será desinfestado superficialmente com hipoclorito de sódio. Com auxílio de um estilete esterilizado serão retirados pequenos fragmentos de caules e raízes que serão transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura BDA (Batata Dextrose Agar) e incubados sob condições de temperatura e luminosidade adequadas (MENEZES; SILVA, 1997). Para a identificação dos fungos serão avaliados os aspectos macroscópicos (tamanho, cor e aspecto da colônia) e microscópicos dos isolados. Os isolados serão inoculados, assepticamente, em placas de Petri contendo BDA e acompanhados por até 96h, para posterior identificação.


Locais de coleta e Realização dos Experimentos Fitopatológicos

Os trabalhos serão realizados na Estação Experimental do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) na sede do IPA em Recife/PE. Atividades de apoio também serão desenvolvidas no Departamento de Bioquímica da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e no Instituto Nacional do Semiárido (INSA). As amostras de feijão serão coletadas nas regiões produtoras no Sertão do Araripe, Sertão do São Francisco, do Agreste Meridional, Sertão do Pajeú.



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