Septembre 2002 n°199

§129 et 130).. Ils analysent, au passage, les divers types de réseaux utilisables et leurs avantages et inconvénients.

I Dahllof (p.213 217) publie une revue critique sur l'ensemble des techniques moléculaires utilisables dans l'analyse des communautés. Elle insiste sur le caractère crucial du choix des gènes pris comme sonde d'analyse, les artefacts dans l'échantillonage, la PCR et d'analyse des des données. Elle souligne les contraintes qui doivent guider le choix des techniques

Il est clair, selon le commentaire de S Kjelleberg; Current Opinion in Biotechnology 13 (JUN02) 199 203, qu'il est possible de cultiver plus de microrganismes ainsi détectés qu'on ne le pensait, et qu'il faut s'y atteler.

Les consortiums des stations d'épuration sont un exemple de communautés qui sont analysés avec ces outils (M Wagner et al; p.218-227). Ils insistent sur l'analyse des fonctions in situ, au delà des organismes, dans les consortiums et biofilms. Ce genre des travaux devraient permettre d'améliorer l'efficacité des usines d'épuration. En effet, la révélation des liens métaboliques au sein de la communauté devrait permettre de rationaliser les techniques dites de "bioaugmentation" (additions ou complémentation de souches à fonctions définies).

On a, de cette façon, identifié des bactéries, jusqu'alors inconnues, qui sont responsables de la dénitrification et de l'élimination des phosphates.

Les biofilms sont à la mode dans beaucoup de domaines et L Hall Stoodley et al.; p.228-233 traitent de ces formes particulières de communautés naturelles. Ils montrent comment des études de génomique et de protéomique, ainsi que des patrons d'expression de gènes marqueurs permettent de caractériser les régulations au sein de la communauté, et de montrer qu'un biofilm est une entité dynamique en constant renouvellement et présentant une véritable différenciation. C'est effectivement une bonne base pour aborder les autres développements de ce numéro de Current Opinion in Biotechnology.

WD Bauer et al.; p.234-237 reviennent sur les mécanismes de "quorum sensing" au sein des biofilms et leurs effets sur la virulence et la colonisation des eucaryotes. Ils indiquent que les eucaryotes doivent probablement produire des imitations des inducteurs intervenant dans le "quorum sensing", et pilotent ainsi les populations de commensaux et de pathogènes. Ils citent plusieurs exemples choisis parmi les plantes. On a, par ailleurs, des indications que les bactéries ont déjà engagé la bataille des communications, en dévoyant les signaux d'autres bactéries. La revue de SE Lindow et al.; p.238-243 porte sur le pilotage de la microflore épiphylle et les interactions entre la feuille et les microbes qui essayent de la coloniser. Des préparations sont déjà commercialisées pour lutter contre les pathogènes foliaires. On peut modifier la biologie de la surface des feuilles par ingéniérie génétique.

R de Nys et al.; p.244-248 reviennent, ainsi, sur le pilotage de la colonisation de la rhodophycée Delisea pulchra par des bactéries grâce à une furanone (Voir le Bulletin de Mai §101). Ceci pourrait conduire au développement d'"antifouling" pour les constructions marines. Ils traitent plus généralement des biotechnologies appliquées aux milieux marins.

EZ Ron et al.; 249-252 traitent de l'utilisation des biosurfactants dans lutte contre les fuites d'hydrocarbures en milieu marin, tandis que R Cavicchioli et al.; p. 253-261 traitent de l'utilisation des archées et bactéries des milieux froids (avec le débouché sur l'ingéniérie des protéines pour les adapter à ces températures). Enfin L Gram et al.; p.262-266 montrent comment prévoir et étendre les délais de consommation des produits de la mer, notamment par l'utilisation de disrupteurs des communications entre microrganismes, plutôt que d'utiliser des désinfectants comme on le fait actuellement. Ils se basent sur des études des microflores des poissons qui ont montré de nombreux échanges via les acyl-homosérine lactones entre ces bactéries. Ils font l'hypothèse que ces échanges induisent la production d'exo-enzymes néfastes, qui ne sont pas invraisemblables.

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107. Pseudomonas putida KT2442 a été modifié pour pouvoir être utilisé dans la dépollution du parathion, un pesticide organophosphoré, qui est par ailleurs un modèle des gaz de combat. AW Walker et al.; Biotechnology & Bioengineering 78 (30JUN02) 715-721. lLes auteurs (de Berkeley) ont introduit une organophosphate hydrolase (OPH), codée par le gène opd (organophosphate-degrading), fonctionnant également sur p-nitrophénol (PNP) et le diéthyl thiophosphate, qui ne sont pas métabolisés par P.putida KT2442. Le gène opd, est exprimé le plus efficacement sous la commande du promoteur tac. Ce dernier est un promoteur synthétique constitué par la région –35 du promoteur de l'opéron tryptophane de la région –10 du promoteur de l'opéron de l'utilisation du lactose, lac.

Un plasmide porteur des gènes de conversion du p-nitrophénol en -cétoadipate permet, ensuite, d'utiliser 0,5 mM de PNP comme source d'énergie et d'azote ainsi que 0.,8 mM de parathion.

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108. On trouve, par ailleurs, une revue plus générale sur la détoxication des organophosphorés et plus particulièrement des gaz de combat par les bactéries dans FM Raushel; Current Opinion in Microbiology 5 (JUN02) 288-295.

Les triesters organophosphates et les organophosphonates apparentés sont apparus sur le marché depuis la fin de la deuxième guerre. On ne connait pas de triesters organophosphates naturels. Les enzymes s'attaquant à eux ne le font donc qu'accidentellement, et ne sont pas, a priori, optimisées. Plusieurs de ces enzymes sont connues, et on cherche maintenant à optimiser le site catalytique, soit par une approche rationnelle, soit par mutations au hasard et sélection. L'optimisation porte sur l'utilisation, soit des versions insecticides de ces agents, soit des agents de guerre chimique. La figure 2 rassemble les formules de plusieurs de ces composés.

La revue porte sur les phosphotriestérases et les organophosphates anhydrolase. Les gènes opd (voir le praragraphe précédent) sont plasmidiques et leur spécificité est, comme on pouvait s'y attendre, relativement larges. L'oxygène des phosphates peut être remplacé par un soufre comme dans le parathion.

Les plus connues de ces enzymes sont les phosphotriestérases (PTE) de Pseudomonas diminuta (une souche du sol) et Flavobacterium (récoltée dans une rizière des Philippines après plusieurs années de traitements par l'insecticide diazinon) et l'anhydrolase acide d'organophosphorés d'Alteromonas sp.. Les deux phosphotriestérases sont identiques, et leur substrat préféré parmi les xénobiotiques est le paraoxon.

On ne connaît pas le substrat naturel des phosphotriestérases, mais celui des anhydrolases est la liaison peptidique des dipeptides contenant une proline. Une enzyme de la même famille, l'atrazine chlorohydrolase, qui dégrade l'atrazine fait partie de la même famille qui a due être créée pour nous aider à atténuer nos bêtises (voir Bernardin de Saint Pierre).

Les agents de guerre chimique sont des mélanges racémiques dont les deux stéréoisomères sont inégalement toxiques, alors que la stéréospécificité des sites actifs est relativement étroite. On tient cependant à détruire les deux isomères et donc à réduire la sélectivité. Dans cas du sarin, la spécificité est nettement en faveur du moins toxique des isomères.

L'analyse structurale de l'enzyme a permis de définir les sites de fixation engendrant cette spécificité et de les modifier dans le sens voulu, et ceci en ne modifiant qu'un tout petit nombre d'acides aminés. La revue en donne un exemple avec les isomères d'éthyl phényl p-nitrophényl phosphate. La seule substitution Gly60Ala a un effet saisissant avec une stéréosélectivité de 11 000 à 1 pour le SP-enantiomère. Dans le cas des gaz de combat, on a élargi cette spécificité en substituant les Phe132, Ser308 et Ile106 en glycine et/ou alanine, ce qui agrandit le sous-site de reconnaissance. On a, évidemment, évité de réduite l'activité de l'enzyme pour son substrat préféré. L'opération d'inversion de la sélectivité a été plus difficile à réaliser. On a, ainsi, modifié la préférence pour la forme la moins toxique du sarin en une préférence pour la forme la plus toxique par les substitutions Ileu106Ala/Phe132Ala/His257Tyr avec un facteur de sélectivité de 30. On a des succès analogues pour le soman.

Une extension de ces recherches conduit à la décontamination des pesticides dans les eaux de lavage du bétail dans les grands troupeaux, qui concentrent les insecticides lessivés de la peau dans une eau dépouvus de substrats de croissance. Le même groupe de Texas A & M qui a réalisé les travaux sur le sarin a essayé, apparemment avec succès, des E.coli recombinantes exprimant l'organophosphate hydrolase et dégradant le coumaphos. JW Kim et al.; Biotechnology Progress 18 (MAY-JUN02) 429-436. Les bactéries en suspension ou sous forme immobilisée dans un cryogel de poly(vinyl alcool) ne se multiplient pas, mais dégradent l'insecticide. Les formes immobilisées sont deux fois plus actives et gardent leur activité pendant plus de 4 mois d'usage ou de stockage. Les auteurs ont cependant noté qu'il devait exister des facteurs inhibiteurs dans l'eau de lavage.

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109. Agrobacterium radiobacter P230, est capable d'hydrolyser plusieurs insecticides organophosphorés (OPs). Le gène, opdA, d'une organophosphate hydrolase (OPH) de cette bactérie a été cloné et séquencé. L'enzyme ressemble à celui de Flavobacterium ATCC 27551 et Brevundimonas diminuta MG. Sa fonction a été vérifiée par mutagenèse insertionnelle. Elle est surtout efficace sur les diméthyl-OPs, phosmet et fenthion. I Horne et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUL02) 3371-3376.

Les enzymes détoxifiant les organophosphorés provenant des insectes résistants sont peu efficaces et ne savent hydrolyser que les liaisons O-P (OPs oxons), et pas les S-P (OPs thions). C'est pourquoi on s'intéresse plutôt aux enzymes bactériennes qui ont un spectre de substrat plus large et sont très efficaces. L'OPH est codée par le gène opd, mais d'autres bactéries capables de détoxifier les OPs ne portent pas ce gène. Il existe, par ailleurs, des prolidases comme celle d'Alteromonas, qui sont plus adaptées à la détoxification du sarin et du soman, les OPHs étant mieux adaptées à celle des insecticides de la famille.

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110. Les biphényls polychlorés (PCBs) comporte de un à onze chlores greffés sur les deyx cycles aromatiques, ce qui donne des combinaisons de 209 congénères potentiels, dont on retrouve usuellement de 20 à 60 dans une préparation industrielle classique. Limitée à environ 1000 tonnes dans les années 30s, la production a culminé à 200 000 tonnes in 1975. La très grande stabilité de ces molécules qui en faisait l'intérêt (durée de vie chiffrée en décades) se traduit par une forte persistance et un transit dans la chaîne alimentaire. Des effets tératogènes et carcinogénes ont été décrits. Or il s'en est ainsi accumulé environ 1,5 millions de tonnes entre 1930 et maintenant (et pas par an comme indiqué par erreur dans le Bulletin de Juillet §134). La production en a été interdite dans les années 80s. On en trouve jusqu'au Groenland et en Antarctique.

On se préoccupe depuis longtemps d'une biodépollution efficace, notamment avec Burkholderia LB400 ou des Rhodoccus (pour la voie de dégradation, voir le Bulletin de Décembre 2001 §132). L'équipe de Timmis est l'auteur d'une revue sur le sujet dans WR Abraham et al.; Current Opinion in Microbiology 5 (JUN02) 246-253. La biodégradation est rendue difficile par le caractère très hydrophobe des molécules et de la proximité d'atomes de chlore sur les cycles.L'hydrophobicité des biphényls polychlorés (PCBs) explique leur faible biodisponibilité, et c'est une des raisons de leur faible biodégradabilité. Des chercheurs italiens montre qu'on peut améliorer cette biodisponibilité par addition de -cyclodextrines méthylés aux sols contaminés par les huiles de transformateurs. Cela dépend évidemment de la nature des sols et du prix qu'on veut bien payer. F Fava et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 58 (MAR02) 393-399.

On peut également utiliser Mycobacterium PYR-1. Ce métabolisme a été étudié par des chercheurs de la FDA. JD Moody et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 58 (MAR02) 364-369. On y trouve, en sus des voies habituelles, une monoxygénation en position C4 (donnant le hydroxybiphenyl). Les PCBs sont dégradés, soit en aérobiose, soit en anaérobiose, suivant la composition des mélanges, souvent par des consortiums. En règle générale, les PCBs très chlorés sont plutôt de bons substrats pour une dégradation anaérobie probablement grâce à une chlororespiration où ils jouent un rôle d'accepteurs d'électrons. C'est l'inverse pour les PCBs faiblement chlorés où il se comporte comme donneurs d'électrons et sont dégradables de façon aérobie.

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112. Rhodococcus rhodochrous S-2 produit des polysaccharides extracellulaires (S-2 EPS) contenant D-glucose, D-galactose, D-mannose, acide D-glucuroniques associés à des lipides. Cette couche la protège de la toxicité des fractions aromatiques des pétroles bruts. Ce polysaccharide protège également les bactéries autochtones des régions pétrolières et facilite la dégradation, par celles-ci, des fuites de pétrole en milieu salin. Ce polysaccharide émulsifie, beaucoup plus que bien d'autres détergents, les fractions aromatiques, ce qui accélère leur dégradation, comme très souvent lors des biodépollutions d'hydrocarbures. Il facilite le développement de populations de Cycloclasticus. N Iwabuchi et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (MAY02) 2337-2343.

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113.Une culture de deux isolats de Pseudomonas putida a été extraite d'un consortium vivant dans un mélange BTEX classique de benzène, toluène, ethylbenzène, et les trois isomères m-xylène, p-xylène et o-xylène. Benzène, toluène et ethylbenzène sont utilisés par un des isolats. Toluène, m-xylène, et p-xylène sont utilisés par l'autre. L'o-xylène n'est utilisé, par les deux souches que dans le cadre d'un co-métabolisme à la suite d'une induction par les autres. Les six composants sont donc catabolisés, ce qui est une amélioration par rapport à l'utilisation des inoculats monospécifiques ou des consortiums indéfinissables qui ont été surtout étudiés. HH Attaway et al.; Current Microbiology 45, n°1 (2002) 30–36.

Le champignon Cladophialophora T1 peut également pousser sur des frazction hydrosoluble des BTEX d'essence automobile. Le benzène n'est, cependant, pas métabolisé, mais tous les autres le sont par assimilation ou co-métabolisme. Toluène et éthylbenzène sont des sources de carbone et d'énergie, tandis queles xylènes sont essentiellement co-métabolisés. o-Xylène et m-xylène sont convertis en phtalates mais le p-xylène n'est minéralisé qu'en présence des autres. Toluène, éthylbenzène et xylène sont attaqués par la même monooxygénase. FX Prenafeta-Boldú et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUN02) 2660-2665.

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115. On utilise souvent des bactéries porteuses de résistances aux antibiotiques pour suivre leur devenir dans l'environnement. Encore faut-il qu'elles expriment leur résistance.. La technique classique d'expression de résistance sous-estime donc, parfois gravement, la persistence de souches microbiennes dans un sol. JD Nairn et al.; FEMS Microbiology Ecology 40 (JUN02) 167-170.

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117. L'inhibition de la production microbiologique d'H2S dans des réservoirs d'hydrocarbures par l'addition de nitrates convertis en nitrites est démontrée par des chercheurs norvégiens. S Myhr et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 58 (MAR02) 400-408. L'abandon de l'addition de nitrates entraîne un retour à la production d'origine en 5 mois.

Les bactéries réduisant les sulfates (les productrices du H2S) prédominent (64 à 93% de la flore) dans la zone anoxiques avant l'addition de nitrates. La flore réduisant les nitrates ne constituent que 6% et l'abondance reste inchangée après addition de nitrate, ce qui suggère que d'autres bactéries réductrices sont présentes, mais pas identifiées. La population des réductrices de sulfates s'effondre au bout de 1-3 mois (9-25%). C'est manifestement la présence de nitrites qui en est responsable.

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118. Le méthyl tert-butyl ether (MTBE) peut être ajouté dans des proportions appréciables (jusqu'à 15%) dans l'essence automobile pour remplacer le plomb tétraéthyle, et réduire les émissions polluantes dans les gaz d'échappement. D'autres composés oxygénés sont utilisables pour obtenir un indice d'octane convenable, comme l'éthyl tert-butyl ether (ETBE qui a la préférence des agriculteurs, car on peut le fabriquer à partir de bioéthanol) et le tert-amyl methyl ether (TAME) ainsi que leurs alcools respectifs. Le MTBE est dominant car fabriqué par les pétroliersavec une capacité deproduction de l'ordre de 25 millions de tonnes. Malheureusement les fuites dans les rivières ont été détectées en Europe, pas encore dans les eaux "potables" comme c'est le cas aux Etats-Unis. Il est, en effet, très soluble dansl'eau et n'est que difficilement immobilisé dans le sol. Il est très récalcitrant à une biodégradation liée à desproblèmes stériques et à la présence d'une liaison ether.

La dégradation rapide du méthyl tert-butyl ether (MTBE) a été réalisée par des chercheurs de l'Institut Français du Pétrole en commençant une sélection de souches sur le tert-butyl alcool, un composé récalcitrant. Ils ont ainsi isolé un Mycobacterium austroafricanum capable de dégrader les deux composés avec une bonne induction par le tert-butyl alcool. On observe la formation de deux intermédiaires de la dégradation du MTBE, le tert-Butyl formate et le 2-hydroxy isobutyrate (HIBA). La cadence de dégradation est de 0,6 mmol/h/g (poids sec de cellules). Au moins une monoxygénase est en cause. Deux polypeptides (66 et 27 kDa) ont été caractérisés qui ressemblent beaucoup à des oxydoréductases.

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119. L'élimination des phosphates des eaux usées urbaines par la voie biologique peut être réalisée en insérant une phase anaérobie avant le passage dans les bassins aérobies. On favorise ainsi les bactéries qui utilisent leurs polyphosphates intracellulaires comme source d'énergie, et ceci constitue une réserve de carbone qui peut être utilisée durant la phase aérobie. Cette énergie permet de capter le phosphate et de le stocker sous forme de polyphosphates pendant la phase anaérobie. Cette déphosphoration améliorée par un cycle anaérobie-aéobie est effectivement utilisées à grande échelle, mais on ignore quels en sont exactement les acteurs. On a pensé que ce sont des Acinetobacter, mais ils n'ont pas toutes caractéristiques métaboliques nécessaires. D'autres études ont montré qu'on enrichissait les boues avec des Rhodocyclus dans ces conditions. Des chercheurs de l'University of Wisconsin—Madison montrent par la technique FISH, que sont bien des bactéries de ce type qui interviennent. Elles représentent 13 à 18% de la population bactérienne totale. JL Zilles et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUN02) 2763-2769.

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