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Les Productions Microbiennes

57.### On trouvera dans CP Kurtzman et al.; FEMS Yeast Research 3 (JUN03) 417-432, une analyse phylogénique de toute une série de levures en se basant sur les répétitions des rDNAs. Les auteurs ont également utilisé quelques gènes nucléaires et mitochondriaux pour raffiner leur analyse. Ces derniers ne permettent pas de caractériser les ramifications profondes de l'arbre.

Les 75 espèces comparées peuvent être regroupées en 14 clades (des groupes monophylétiques) qui diffèrent, dans plusieurs cas, des genres communément admis. Ainsi Wingea qui est caractérisée par ses ascospores lenticulaires, n'est autre qu'une Debaryomyces, dont les ascospores ont une forme très différente. Ceci n'est pas trop étonnant dans la mesure où la systématique est basée sur des critères morphologiques des cellules végétatives et reproductrices, ainsi que sur des critères physiologique divers.

L'ennui des disparités observées avec les caractérisations classiques des espèces est que les phénotypes sont de très mauvais prédicteurs des relations génétiques entre espèces.

On savait, en utilisant les rDNAs 18S et 26S, que dans le complexe "Saccharomyces" les genres sont mal délimités, mais qu'on pouvait, ainsi, procéder à des reclassements, mais il restait toujours des espèces inclassables. Le nouveau travail permet de tout reclasser.

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58.### La comparaison des séquences de six Saccharomyces permet de détecter des séquences potentiellement fonctionnelles (codantes et régulatrices).Les différences entre ces espèces sont généralement dues à quelques réarrangements rares entre espèces très proches, plus fréquents ailleurs. Ce sont des traces de l'évolution. Les plus intéressantes sont celles qui sont potentiellement régulatrices, car généralement de telles séquences sont difficiles à repérer dans une séquence du fait de leur petite taille, leur dégénérescence et de leur localisation sur l'une ou l'autre des deux brins, à des distances variables de la séquence codante. Mais leur fonction fait qu'elles sont généralement conservées. La génomique comparative peut donc être d'une grande aide. P Cliften et al.; Science 301 (04JUL03) 71-76. Les séquences repérées lors de cette analyse sont disponibles à www.genetics.wustl.edu saccharomycesgenomes/

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59.### Bacillus methanolicus MGA3 est un méthylotrophe thermotolérant qui peut sécréter jusqu'à 55 g/L. de glutamate à 50° en partant de méthanol. Il peut également surproduire de la L-lysine chez des mutants dont l'homosérine déshydrogénase (HSD^-) est inactivée. On vient de montrer que la citrate synthase II régule la production du glutamate chez ces mutants sécrétant la L-lysine. T Brautaset et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUL03) 3986-3995.

Le glutamate dérive du 2-oxoglutarate du cycle de Krebs par transamination. La lysine dérive de l'oxaloacétate qui donne l'aspartate, puis la lysine en même temps que méthionine et thréonine, via l'homosérine.

Le mutant d'homosérine déshydrogénase, 13A52-8A66, sécrétant jusqu'à 35 g/L. de L-lysine en fed-batch présente, en outre, une activité minime de la 2-oxoglutarate déshydrogénase, qui pourrait vider le pool crucial de 2-oxoglutarate, source du glutamate.

Le cycle est donc partiellement bloqué au passage oxoglutarate vers succinyl-CoA, il faut le relancer, ce qui est permis, chez ce mutant, par un accroissement de trois fois de la production de la pyruvate carboxylase (PC), qui recharge le cycle de Krebs au niveau de l'oxaloacétate (réaction anaplérotique du cycle) et de la citrate synthase (CS) qui relance le cycle.

Les souches productrices de lysine (HSD^-) réorientent le flux de la thréonine et de la méthionine vers la lysine. Le mutant utilisé sécrète donc simultanément glutamate et L-lysine.

La production simultanée de glutamate et L-lysine chez B. methanolicus indique qu'une bonne partie du flux de carbone se dirige vers l'aspartate et vers les trois premières réactions du cycle de Krebs catalysées par la citrate-synthase (CS), l'aconitase et l'isocitrate déshydrogénase.

L'alimentation du cycle par les citrates synthases est donc important et B. methanolicus possède, en réalité, plusieurs CS.

Le cycle de Krebs de B.methanolicus étant surtout utilisé pour obtenir du glutamate, sa sécrétion, chez les mutants surproducteurs de lysine peut être modifiée en faveur de celle de la lysine, en jouant sur l'activité de ces CS, en l'occurrence la citrate synthase II majeure.

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60.### On trouvera dans M Rossi et al.; Journal of Bacteriology 185 n°13 (JUL03) 3683-3689, un compte-rendu d'un colloque sur les extrêmophiles qui s'est tenu à Napoli du 22 au 26 Septembre 2002.

L'adaptation à une vie à très haute température a probablement été favorisée par l'apparition des gyrases réverses qui ont permis le surenroulage stabilisant de l'ADN. La seule protéine trouvée chez tous les thermophiles (et chez aucun des autres organisme) est la gyrase réverse.

La diversité génétique des extrêmophiles a également été abordée. Il faut prendre en compte la diversité des gènes (dans un individu, une population, un écosystème) plus que celui des espèces ou sous-espèces rencontrées. Ceci a été fait en détail pour des niches écologiques bien précises.

Il est cependant beaucoup plus difficile de définir la diversité dans les écosystèmes à cause de la fluidité des limites. On est donc conduit à utiliser des limites commodes pour une analyse. Ceci a été pratiqué pour les communautés isolées des glaces où on suppose qu'elles ont été confinées pendant plus de 500 millions d'années, mais surtout les hyperthermophiles chez qui l'on peut éviter toute contamination accidentelle par des mésophiles.

Les archées sont d'ailleurs un monde finalement très complet. On vient d'y découvrir des symbiotes, les nanoarchéotes avec, pour prototype provisoire "Nanoarchaeum equitans" avec une taille de 400 nm, un génome de 500 kb, et une vie à la surface d'une autre archée, Ignococcus. Ce pourrait être une autre façon d'aborder la question des génomes et du métabolisme minimaux en sus de la communication exigée par la symbiose et de la thermophilie proprement dite. Ce sont, évidemment, de bons modèles pour étudier les mécanismes de réponse aux stress, inévitables dans ce mode de vie.

Les virus comme les Fuselloviridés des Sulfolobus permettent d'analyser la diversité des populations géographiques de ces archées. On a, par ailleurs, étudié les fluctuations des communautés dans des boues chaudes de Nouvelle-Zélande en fonction de celles de la composition et de la température dans des boues chaudes.

On a évidemment beaucoup discuté des données de la protéomique comparée dans ce domaine.

Les flux géniques dans ces communautés ont été étudiés dans le cas de la bactérie thermophile bien connue, Thermus aquaticus.

La première utilisation d'un gène marqueur, celui de la ß-galactosidase (codée par le gène lacS de Sulfolobus) a été décrite dans le cas des thermophiles. Des techniques utilisables chez les cryophiles sont également en cours de mise au point. Pour l'instant le vecteur reste instable et ne peut être utilisé que pour des transformations transitoires.

Comme on possède plusieurs séquences complètes de génomes d'extrêmophiles, alors qu'on ne dispose pas encore de techniques de transformation simples, on utilise les réseaux ADN pour aborder les régulations de l'expression génique. Cela est pratiqué chez Pyrococcus furiosus (mais également chez Thermus aquaticus) pour étudier les voies métaboliques, notamment d'utilisation des sucres (avec des vues appliquées). On dispose actuellement des séquences génomiques de 20 bactéries et archées extrêmophiles et 30 autres vont bientôt sortir, ce qui commence à être confortable.

Beaucoup d'haloarchées utilisent les mêmes facteurs de résistance pour des stress différents. Les réponses aux stress osmotiques et des hautes températures sont semblables chez les procaryotes halophiles et thermophiles. Un rôle du mannosylglycérate comme compensateur de ces deux types de stress a été évoqué. Là aussi les réseaux ont permis de pister les modifications de l'expression dans des stress particuliers. Cela a été réalisé dans le cas de Sulfolobus solfataricus.

Une étude comparée des génomes de trois Sulfolobus (S.solfataricus, S.acidocaldarius, S.tokodaii) a été entreprise et indique la présence de plusieurs éléments mobiles. Ce sont soit des séquences d'insertions (IS), soit des éléments MITE-like (pour Miniature Inverted Repeat Element).

La première séquence d'une psychrophile, Desulfotalea psychrophila, a été réalisée par Epidauros Biotechnologie. Le génome contient 3,66 Mb. C'est une bactérie Gram^- réduisant le soufre et poussant à 10°C. Elle est très fréquente dans les sédiments arctiques où elle est omniprésente. L'annotation des gènes est intéressante.

Deux méthanogènes, l'une psychrophile, Methanogenium frigidum (Topt de 15°C), et l'autre psychrotolérante, Methanococcoides burtonii (Topt de 23°C), ont été séquencées. On dispose donc des séquences de sept méthanogènes dont les Topt vont de 10° à 110°C (Methanopyrus kandleri). Cela devient intéressant dans le cadre d'un étude comparée de l'adaptation aux diverses températures.

Fidelity Systems s'intéresse précisément à Methanopyrus kandleri isolé d'un fumeur profond du golfe de Californie. Cet hyperthermophile stocke du 2,3-diphosphoglycérate (1,1 M) et des ions potassium (3,3 M) Son génome contient 1,6 Mb indique des similitudes avec ceux des halophiles.

Les polymérases Y qui savent réparer des quantités de lésions correspondant à des altérations de nucléotides dans l'ADN, ont été discutées. C'est un groupe d'enzymes de réparation récemment révélé.

La polymérase B1 (réplicative) de S.solfataricus possède une propriété intéressante. Elle reconnaît la présence d'un uracile intempestif dans l'ADN plusieurs nucléotides en avant, phénomène qui avait déjà été révélé pour l'homologue de Pyrococcus furiosus. La structure n'est pas très différente de celle des autres polymérase de ce type, mais dans ce cas, elle n'a que très peu de contact avec l'ADN, et c'est peut être l'explication de sa faible fidélité de copie.

Les applications n'ont pas été oubliées. Le contournement des brevets sur la Taq polymérase a incité à la découverte d'autres enzymes du même type. L'une, décrite lors du colloque, a été celle de Thermococcus kodakaraensis, qui est plus fidèle et plus efficace dans l'élongation.

New England Biolabs cherche à utiliser des polymérases mutées d'archées pour incorporer des nucléotides anormaux, afin de marquer des terminateurs de réplication, ce qui est utile dans le séquençage et dans l'analyse du polymorphisme nucléotidique.

Mais un des débouchés les plus recherchés est l'utilisation des résistances aux stress rencontrés dans les procédés industriels. Des cyclodextrines glycosyltransférases, amylomaltases et enzymes ramifiantes des glucanes de thermophiles (même modérés), par exemple, peuvent être utilisées pour la synthèse de ces cyclodextrines en conservant la fluidité du milieu.

Un capteur ne consommant pas le glucose lors de la mesure peut être monté à partir d'une glucose déshydrogénase d'une thermophile dont on n'utilise que la propriété de lier le glucose par l'apoenzyme.

Le vrai problème des enzymes d'extrêmophiles est leur production en grandes quantités. Cela ne peut se faire, pour l'instant, que dans des hôtes hétérologues auxquels il faut adapter les codons du transgène. On sait exprimer, de la sorte, certaines de ces enzymes chez des champignons filamenteux industriels.

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61.### Zymomonas mobilis présente un comportement paradoxal face à l'acide cyanhydrique. Normalement c'est un inhibiteur de la respiration, mais chez cette bactérie c'est un stimulateur. Ceci est peut-être la conséquence d'une protection contre l'acétaldéhyde qui est toxique. Zymomonas mobilis, en réorientant les équivalents réducteurs de la respiration vers la synthèse d'éthanol, se débarrasse de l'acétaldéhyde. U Kalneniek et al.; Microbiology 149 (JUL03) 1739-1744. Zymomonas , comme beaucoup d'autres bctéries possède des oxydases terminales alternatives dont certaines sont sensibles au cyanure.

Il y a, en fait, une inhibition de l'isozyme ADHII de l'alcool déshydrogénase (celle qui contient du fer) qui, dans les cultures aérobies, risque d'oxyder l'éthanol en acétaldéhyde en fournissant du NADH à la chaîne respiratoire. La NADH oxydase membranaire est inhibée encore plus rapidement, mais moins complètement que l'ADH II. On constate une plus forte corrélation entre l'inhibition de la NADH oxydase et celle de la respiration, mais cette dernière est complète.

L'activité résiduelle d'ADHII résistante au cyanure est nécessaire à la respiration en présence du cyanure, et constitue une réponse adaptative de Zymomonas au cyanure, comme c'est le cas chez d'autres bactéries.

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62.### Des chercheurs de Düsseldorf ont monté une souche de Saccharomyces cerevisiae qui sait utiliser efficacement l'arabinose, et le convertir en éthanol. J Becker et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUL03) 4144-4150.

Ce pentose est un composant du matériel lignocellulosique (et spécialement des hémicelluloses) qui est la seule chance du bioéthanol, car il n'entre pas en compétition avec les besoins alimentaires de l'homme.

On a déjà transformé Escherichia coli, Klebsiella oxytoca et Zymononas mobilis dans le but de convertir tous les sucres principaux de l'hémicellulose en éthanol. Beaucoup de levures et de champignons savent utiliser le L-arabinose en aérobiose, mais ne peuvent le fermenter en éthanol.

La voie d'utilisation a été empruntée à Bacillus subtilis avec AraA et à Escherichia coli avec AraB et AraD, et elle a été accompagnée par la surexpression de la galactose perméase, un transporteur qui accepte le L-arabinose. L'utilisation du L-arabinose suppose, en effet, un transport efficace.

L'analyse par réseaux ADNs montre qu'il faut, en outre, abaisser l'activité de la L-ribulokinase. Une activité transaldolase est bénéfique. Il faut travailler en oxygène limitant.

La transplantation globale de la voie chez la levure ne marche pas, car la L-arabinose isomérase d'E.coli n'est pas fonctionnelle chez S.cerevisiae. C'est pourquoi on a emprunté celle de Bacillus subtilis. Mais, manque de chance, l'enzyme naturelle de B.subtilis ne fonctionne pas plus. Il a donc fallu exercer une pression de sélection pour obtenir une enzyme qui veut bien faire ce qu'on lui demande, et permettant donc la croissance sur arabinose. L'analyse des meilleurs transformants indique qu'une stoichiométrie adaptée entre les activités enzymatiques est indispensable.

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63.### L'une des composantes des stratégies de survie dans un milieu fluctuant est de se constituer des réserves pendant des périodes de pléthores, même déséquilibrées (azote ou carbone). Les bactéries ne stockent que rarement des triacylglycérols (cas des Mycobacterium, Streptomyces et Rhodococcus) et préfèrent divers types de lipides (pensez au polyhydroxyalcanoates, par exemple) en carence d'azote et pléthore de carbone. Des chercheurs de Luminy et de Pau ont étudié la constitution de réserves lipidiques chez une nouvelle bactérie marine, Marinobacter squalenivorans. Il s'agit, dans ce cas, d'un produit de conversion du squalène. C'est une cire isoprénoïde polyinsaturée. JF Rontani et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUL03) 4167-4176.

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