Universidade Federal do Pará
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- RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
- Cronograma das próximas etapas
- FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA
Período: 01/2017 a 07/2017 (x) PARCIAL ( ) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: Estudo do interatoma e exossoma em Corynebacterium pseudotuberculosis para pesquisa de novos alvos terapêuticos Nome do Orientador: Adriana Ribeiro Carneiro Folador Titulação do Orientador: Doutora Faculdade: Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Centro de Genômica e Biologia de Sistemas Título do Plano de Trabalho: Perfil genotípico e fenotípico de uma cepa bacteriana resistente a antibióticos de último recurso, isolada no Lago Água Preta, manancial de Belém, Pará. Nome do Bolsista: Ícaro Rainyer Rodrigues de Castro Tipo de Bolsa: ( x ) PIBIC/ CNPq ( ) PIBIC/CNPq – AF ( ) PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA – AF ( ) PIBIC/ INTERIOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR ( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/PIBIT INTRODUÇÃO Os antimicrobianos são substâncias naturais, químicas ou sintéticas (quimioterápicos), sintetizadas por várias espécies de microrganismos, vegetais e animais (SÁEZ-LLORENS, 2000). Atualmente, é a classe de medicamentos mais utilizados e mais prescritos tanto para uso hospitalar quanto para a automedicação. São classificados como bactericidas, quando causam a morte da bactéria, ou bacteriostáticos, quando promovem a inibição do crescimento microbiano (WALSH, 2003). Os antibióticos são rotineiramente utilizados para melhorar uma infecção estabelecida e possuem a finalidade de eliminar ou impedir o crescimento bacteriano, mas quando usados de maneiras erradas trazem sérios problemas ao ser humano (NICOLINI et al., 2008). Segundo Lohner e Staudegger (2001), as doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana. Esse fato é devido, em grande parte, ao surgimento de microrganismos multirresistentes aos antibióticos. As bactérias têm sido classificadas como resistentes ou susceptíveis de acordo com dados de CMI (Concentração Mínima Inibitória) e CMB (Concentração Mínima Bactericida). São ditas resistentes quando são inibidas de forma in vitro por antibióticos apenas em concentrações superiores àquelas atingidas de maneira in vivo (FIOL et al., 2008). Considera-se que uma bactéria é resistente a um ou vários antibióticos (ATBs), quando este perde a capacidade de controlar o crescimento bacteriano (SEAN, 2005). O agravamento do nível de resistência a este grupo farmacológico deve-se à sua utilização excessiva e muitas vezes errónea praticada ao longo de décadas (INSA, 2010). O uso indiscriminado permitiu que os microrganismos conseguissem se adaptar, por meio de mecanismos de aquisição e transferência de genes de resistência (CDC, 2010). Adaptação esta que contribuiu para a emergência e incidência de bactérias patogênicas e resistentes aos antimicrobianos não apenas em ambiente hospitalar, mas também no meio ambiente e em animais produtores de alimentos, representando assim, uma grave preocupação e ameaça para a saúde pública (FORGETTA et al., 2011). Os principais recipientes para genes de resistência à antibióticos são os ambientes aquáticos, da mesma forma, para as cepas resistentes a antibióticos (GILLINGS et al., 2008). A água constitui não somente um meio de disseminação de organismos resistentes aos antibióticos entre populações humanas e animal, mas também a via pela qual genes de resistência são introduzidos no ecossistema de bactérias naturais alterando a microbiota ambiental, possibilitando assim, o surgimento de cepas multirresistentes (BAQUERO, 2008). Nesse contexto, a caracterização fenotípica e genotípica das cepas de bactérias, tão bem como a identificação dos genes responsáveis pela resistência, assim como sua localização e diversidade são de grande importância para o entendimento dos fatores envolvidos no desenvolvimento da resistência.
O emprego de drogas antibióticas em larga escala tanto para fins profiláticos, terapêuticos e agropecuários tem provocado a seleção de populações bacterianas resistentes aos antibióticos, tendo o meio aquático como um grande facilitador, por facilitar a troca de material genético entre bactérias ambientais e patogênicas, causando assim, uma preocupação tanto para a medicina humana quanto a veterinária. A disseminação da resistência a antibióticos tem sido classificada pela Organização Mundial de Saúde um dos três principais problemas de saúde pública deste século. Assim, este estudo permitirá responder a questões relacionadas com a ocorrência e dispersão da resistência em ambientes naturais, além de contribuir para antecipar cenários de disseminação de resistência e prever riscos inerentes. OBJETIVOS Objetivo geral Caracterizar o perfil genotípico e fenotípico de uma cepa bacteriana resistente a antibióticos de último recurso, isolada no Lago Água Preta. Objetivos específicos
MATERIAIS E MÉTODOS: Obtenção das amostras Para as análises foi selecionada a cepa C40A, resistente ao antibiótico Cefotaxima, a partir da bacterioteca disponível do acervo no Laboratório de Genômica e Bioinformática na UFPA, isolada do lago Água Preta, principal lago que abastece a cidade de Belém, Pará, localizado no Parque Utinga pertencentes à COSANPA. Para o cultivo, a cepa foi cultivada em meio caldo MacConkey por 24 horas à 37ºC, e posteriormente foi semeada em meio ágar MacConkey com adição do antibiótico Cefotaxima.
Para a realização do antibiograma foi utilizada a técnica de difusão em disco (método de Kirby & Bauer). A cepa isolada foi diluída em solução salina até o valor de 0,5 da escala de MacFarland, posteriormente, esta diluição foi coletada e semeada em uma placa com meio de cultura ágar Mueller-Hinton com auxílio de um swab estéril. Posterior a isso, os discos com antibióticos foram aplicados sob a superfície da placa. E após 16 horas, ou overnight, de incubação à 37ºC em estufa, foi realiza a leitura dos halos de inibição segundo os valores padronizados pelo Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI. E como controle, foi utilizada a linhagem Escherichia coli ATCC 25922. Extração DNA genômico As colônias da cepa C40A inicialmente isoladas em meio sólido, serão cultivadas em meio caldo tríptico de soja (TSB) com agitação a 37ºC por 24h, e o pellet será transferido para tubos eppendorf, onde ocorrerá a extração do DNA genômico utilizando o kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) segundo o protocolo do fabricante. A qualidade do DNA extraído será avaliada em gel de agarose 1%. Sequenciamento do 16S O sequenciamento do gene 16S será realizado pela plataforma de sequenciamento Sanger, de acordo com o seguinte protocolo: a mistura da reação da PCR continha 1µl de DNA, 2,5 µl de buffer, 1 µl de DNTP (5mM), 1 µl de MgCL2 (50mM),1 µl dos primers 16s 8F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) e 16s 1492R(I) (GGTTACCTTGTTACGACTT) (3,2 pmols), 0,3 µl de Taq e H2O para completar um volume final de 24 µl. A etapa de desnaturação ocorreu à 95ºC por 5’, 35 ciclos de 1’ à 95ºC, 1’ à 60ºC, 1’ à 72ºC e a etapa de extensão final 72ºC por 7’. As sequencias forward e reverse geradas para cada isolado serão montadas no programa BioEdit e identificadas pela ferramenta BLASTn (NCBI).
Para a realização da PCR para identificar os genes de resistência, será utilizado os seguintes primers dos genes: blaIMP, blaVIM, blaKPC, blaSHV, blaCTX e blaTEM (Henriques et al., 2006; Böckelmann et al., 2009; Hindiyeh et al., 2008). E para a identificação dos integrons intl1 e intl2 também será realizada utilizando primers previamente descritos na literatura (Moura et al., 2010). Construção da biblioteca e sequenciamento do genoma completo A construção da biblioteca para o sequenciamento da cepa seguirá o protocolo disponibilizado para ION Xpress Plus gDNA Fragment Library Preparation (Life Tecnologies), utilizando o kit ION XpressTM Plus Fragment Library. Para a fragmentação do DNA será utilizada a enzima ION Shear Enzyme Mix II, em seguida, os fragmentos serão purificados usando Agencourt AMPure XP reagent (Beckman). Após, a deposição será realizada em chip de 318v2 seguindo o protocolo Ion PGMTM Sequencing 400 kit. E o sequenciamento do genoma ocorrerá por meio da plataforma Ion Torrent PGMTM (Thermo Fisher Scientific). Montagem e anotação do genoma Após o sequenciamento, as leituras serão submetidas à uma avaliação de qualidade dos dados brutos utilizando o software FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/). A montagem do genoma será feita através o montador Mira versão 4.0 (Chevreux et al.,2004), o qual será executado de acordo com os parâmetros para dados produzidos pela plataforma Ion Torrent PGMTM. Os contigs gerados pelo programa Mira serão utilizados para a obtenção do scaffold, pelo software Lasergene (www.dnastar.com). A anotação será realizada nas etapas automática e manual. A etapa de anotação automática será pelo sistema web RAST. A anotação manual será feita através da ferramenta Artemis (Rutherford et al., 2000), onde será feita a curadoria manual das sequências codificantes de proteínas (CDS), através dos bancos de dados, como: Blastp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi); UniProt (http://www.uniprot.org/), para identificar sigla de genes; InterProscan (Zdobnov & Apweiler, 2001); e Pfam (http://pfam.xfam.org/) para identificação de motivos e domínios proteicos conservados.
O material biológico obtido a partir do Lago Água Preta e mantido em glicerol 25% à -80ºC foi cultivado em placas de ágar MacConkey, meio este, seletivo para crescimento de enterobactérias. Após 24h de incubação a 37º, foi observado crescimento da cepa C40A de forma pura (Figura 1), sem a presença de qualquer contaminante ambiental ou laboratorial. A seguir, a bactéria foi submetida ao teste de coloração de Gram, a fim de determinar se as características morfológicas e tintoriais da mesma estavam de acordo com as apresentadas na literatura. A partir da coloração de Gram, a bactéria teve suas características confirmadas como sendo de natureza gram-negativa, apresentando-se na forma de bastonetes.
Fonte: Arquivo pessoal Antibiograma Para o teste de disco-difusão, foram utilizados 16 antibióticos, dos quais foi analisada a capacidade de impedir o crescimento microbiano por meio da medida do halo formado ao redor do disco de antibiótico. Os antibióticos utilizados foram: Amoxicilina (AML), Amoxicilina + Ácido Clavulânico (AMC), Ampiclina (AMP), Ceftazidima (CAZ), Cefalotina (KPF), Cefotaxima (CTX), Cefepime (FEP), Imipenem (IPM), Ciprofloxacina (CIP), Gentamicina (CN), Clorafenicol (C), Sulfametoxazol + Trimeptoprim (SXT), Canamicina (K), Aztreonam (ATM), Ácido Nalidixico (NA) e Tetraciclina (TE). Tendo sido as respostas do crescimento ou ausência de crescimento bacteriano na presença dos antibióticos classificados como: Resistente (R), Intermediário (I) ou Sensível (S). O teste de sensibilidade da cepa bacteriana a antibióticos apresentou os seguintes resultados:
Fonte: Arquivo pessoal Após a aferição dos halos de inibição do crescimento antimicrobiano mediante a ação dos antibióticos e comparação das medidas dos halos com os padrões disponibilizados pelo Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI (Figura 2), pode-se concluir que dos 16 antibióticos testados, a cepa C40A foi resistente a 87,5% dos antibióticos testados (AML, AMC, AMP, CAZ, KPF, CTX, FEP, CIP, CN, C, STX, ATM, NA e TE), e apresentou susceptibilidade a 12,5% (IMP e C) (Tabela 1).
O presente resultado mostra que a cepa em questão pode ser caracterizada como multirresistente por conseguir realizar crescimento no meio de cultivo na presença de três ou mais antibióticos. Cronograma das próximas etapas
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAQUERO, F.; MARTÍNEZ, J. L.; CANTÓN, R. Antibiotics and antibiotic resistance in water environments. Current Opinion in Biotechnology. v. 19, p. 260 - 265, Jun. 2008. CDC - Centers for Disease Control and Prevention. About Antimicrobial Resistance: A Brief overview, Atlanta, 2010. Acessado em: 29 jan. 2017. Disponível em: http://www.cdc.gov/drugresistance/about.html. FIOL, F. S. D.; MATTOS FILHO, T. R.; GROPPO F. C. Resistência bacteriana. Rev. Bras. Med., 2008. FORGETTA, V.; REMPEL, H.; MALOUIN F.; VAILLANCOURT, R. J.; TOPP, E.; DEWAR, K.; DIARRA, M. S. Pathogenic and multidrug-resistant Escherichia fergusonii from broiler chicken. Poultry Science. 91 :512–525. 2012. doi: 10.3382/ps.2011-01738. GILLINGS M., BOUCHER Y., LABBATE M., HOLMES A., KRISHNAN S., HOLLEY M.
GUIMARÃES, D. O.; MOMESSO, L. S.; PUPO, M. T. Antibióticos: Importância terapêutica e perspectivas para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes. Quim. Nova, Vol. 33, No. 3, p, 667-679. 2010. INSA - Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. Vigilância Epidemiológica das Resistências aos Antimicrobianos. 2010. Acessado em: 22 jan. 2017. Disponível em: NICOLINI, P. et al. Fatores relacionados à prescrição médica em farmácia pública da região Oeste da cidade de São Paulo. Rev. Ciência & Saúde Coletiva, 13 (Sup): p. 689-696, 2008. SÁEZ-LLORENS, X. et al. Impact of an antibiotic restriction policy on hospital expenditures and bacterial susceptibilities: a lesson from a pediatric institution in a developing country. Pediatr Infect Dis J. v. 19, p. 200-206. 2000. SARTER, S., NGUYEN, H. N. K., HUNG, L. T., LAZARD, J., MONTET, D. Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria isolated from farmed catfish Food Control 18 (2007) 1391-1396. SEAN S. KARDAR - Antibiotic Resistance: New Approaches to a Historical Problem, Action Bioscience, 2005. Acessado em: 25 jan. 2017. Disponível em:< http://www.actionbioscience.org/newfrontiers/kardar.html>. WALSH, C.; Antibiotics: Actions, Origins, Resistance, ASM Press: Washington, 2003. PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso. DATA : / / ASSINATURA DO ORIENTADOR ASSINATURA DO ALUNO INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Em caso de aluno concluinte, informar o destino do mesmo após a graduação. Informar também em caso de alunos que seguem para pós-graduação, o nome do curso e da instituição. FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICAO AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO:
Aprovado com restrições ( ) (especificar se são mandatórias ou recomendações) Reprovado ( )
Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório. Data : / / . Assinatura do (a) Avaliador (a) Yüklə 94,34 Kb. Dostları ilə paylaş:
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