Universitatea „alexandru ioan cuza”IAŞI

UNIVERSITATEA „ALEXANDRU IOAN CUZA”IAŞI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

Program idei Cod CNCSIS 2100

Tema 1040/2009

STUDIUL COMPLEX AL FILOSFEREI UNOR SPECII DE PLANTE DIN

COLECTIILE GRĂDINII BOTANICE IAŞI
SINTEZA REZULTATELOR - 2009

Filosfera reprezintă un habitat important atât din punct de vedere ştiinţific cât şi economic la nivelul căruia se poate studia ecologia microbiană. Conceptul de filosferă a fost creat de Ruinen la începutul secolului XX Aceasta reprezintă o microbiocenoză formată pe frunză de miliarde de bacterii, cianobacterii, alge, ciuperci (mai adesea levuriforme), granule de polen şi tot ceea ce poate vehicula vântul la suprafaţa frunzelor (încă active) de la majoritatea plantelor superioare. Rolul acestei microbiocenoze, mai ales în momentul căderii frunzelor care se vor adăuga litierei preexistente, este preţios şi important. Epifitele sunt implicate în procese la scară largă cum sunt, de exemplu, circuitul carbonului (interceptând compuşi cu carbon eliberaţi direct de către plante sau îndepărtaţi de către unele artropode) şi circuitele azotului (nitrificarea substanţelor poluante ce conţin amoniu interceptaţi de către plante, fixarea azotului), până la procese ce afectează sănătatea plantelor. Datorită importanţei multor colonizatori microbieni ai filosferei în cadrul sănătăţii plantei, vor exista numeroase aplicaţii practice care sunt rezultatul înţelegerii mai exacte a interacţiunilor dintre microorganisme şi plante cât şi între acestea din urmă. Aceste cunoştinţe avansate pot contribui, de asemenea, la înţelegerea ecologiei bacteriilor patogene de pe suprafaţa plantelor şi pot asigura noi perspective pentru dezvoltarea prevenirii sau a strategiilor de controlare a contaminării cu patogeni enterici înaintea recoltării culturilor.

Filosfera are multe caracteristici care o transformă într-un habitat excelent în care poate fi studiată ecologia microbiană. Frunzele sunt curate iar microorganismele pot fi observate direct pe frunze, permiţând utilizarea unor puternice noi tehnici de microscopie pentru a măsura identitatea microbiană, activitatea şi expresia genelor. Pentru a testa modelele de comportament microbian, putem schimba uşor natura condiţiilor habitatului de pe plantele pe care trăiesc bacteriile modificând genetic plantele. Plantele pot creşte fără comunităţi microbiene epifite, permiţându-ne astfel să le manipulăm colonizatorii. Microbiologia filosferei are multe de oferit în cadrul domeniului ecologiei microbiene şi promite să contribuie la crearea de metode de protecţie a plantelor mai eficiente şi mai puţin dăunătoare pentru mediul înconjurător.

În contextul datelor anterior prezentate, preluate din literatura de specialitate, cercetările iniţiate prin prezentul proiect îşi propun rezolvarea unor aspecte fundamentale legate de structurarea si funcţionarea filosferei la specii din familia Labiatae. Astfel, urmărim să realizăm un model experimental prin care să putem caracteriza, deopotrivă, plantele gazdă (Ocimum basilicum L. şi Perovskia atriplicifolia Benth.), cât şi organismele colonizatoare ale organelor lor aeriene, ca parte intrinsecă a filosferei proprii; în acest sens am urmărit :

• 
  Prelevarea probelor biologice într-o etapă ontogenetică cât mai apropiată de cea indicată de practică, pentru obţinerea unui material biologic bogat în uleiuri volatile cu proprietăţi fitoterapeutice şi aromatizante evidente.
  
• 
  Realizarea de preparate pentru studiile histo-anatomice, pentru investigaţii clasice (de microscopie optică) şi moderne (microscopie electronică SEM).
  
• 
  Efectuarea de analize biochimice pentru evaluarea cantitativă şi calitativă a uleiurilor volatile produse de organele vegetative ale plantelor test - tulpini şi frunze - utilizând metode de extracţie prin hidrodistilare a uleiurilor volatile si de analiză a compoziţiei acestora prin metode gaz cromatografice de analiză, cuplate cu metode de spectrometrie de masă.
  
• 
  Derularea de cercetări de factură microbiologică, pentru investigarea efectelor antibacteriene ale uleiurilor volatile extrase asupra unor tulpini de microorganisme test şi/sau provenind din filosfera proprie plantelor investigate.
  

Ne propunem în acest context, în etapele următoare, continuarea cercetărilor de factură anatomo-histologică, biochimică şi microbiologică pentru identificarea, izolarea şi caracterizarea unor microorganisme specifice filosferei plantelor investigate aparţinând familiei Labiatae, precum şi pentru studiul efectelor antibacteriene ale uleiurilor volatile extrase asupra unor tulpini de microorganisme test, cât şi studiul caracterelor macro şi micromorfologice ale microorganismelor din filosfera acestor plante.

În contextul celor prezentate, necesitatea studierii compoziţiei şi funcţiilor microbiotei flosferice este legată de rezolvarea unor aspecte de strictă actualitate:.

• 
  Stabilirea exactă a relaţiilor existente între membrii comunităţilor microbiene filosferice şi studiul dinamicii populaţiilor microbiene pe suprafaţa frunzelor trebuie să constituie premisa utilizării în agricultură a microorganismelor modificate genetic.
  
• 
  La momentul actual există puţine date cu privire la răspândirea unor grupe de microorganisme în filosferă ori referitoare la enzimologia şi diversitatea funcţională a populaţiilor microbiene de pe suprafaţa foliară a plantelor.
  

Tematica de cercetare urmăreşte astfel să consolideze, prin rezultatele practice, conceptele actuale despre filosfera plantelor, unanim recunoscută astăzi ca realitate biologică în regnul vegetal, dar evidenţiată strict doar pentru un număr redus de plante.
Studiu documentar privind biologia şi comportamentul speciilor Ocimum basilicum L. şi Perovskia atriplicifolia Benth., în raport cu complexitatea interelaţiilor plantă-microorganisme şi a celor dintre comunităţile de microorganisme componente ale filosferei.
Părţile aeriene ale plantelor sunt colonizate în mod normal de o multitudine de bacterii, levuri şi fungi. În timp ce puţine specii microbiene pot fi izolate din cadrul ţesuturilor vegetale, mult mai multe specii microbiene pot fi izolate de pe suprafaţa plantelor sănătoase. Habitatul aerian colonizat de către aceste microorganisme poartă numele de filosferă, iar colonizatorii săi sunt microorganismele epifite. Deşi au fost efectuate investigaţii asupra microorganismelor ce colonizează suprafaţa mugurilor şi a florilor, majoritatea studiilor efectuate asupra microbiologiei filosferei s-au axat asupra frunzelor, acestea din urmă reprezentând structurile aeriene dominante ale plantelor. Bacteriile reprezintă de departe cele mai numeroase microorganisme colonizatoare ale frunzelor, de multe ori găsindu-se în număr de aproximativ 10⁶ până la 10⁷ celule/cm² (până la 10⁸ celule/g) (Andrews şi Harris, 2000).

În comparaţie cu majoritatea altor habitate bacteriene, microbiologia filosferei a fost relativ puţin studiată. Acest lucru este surprinzător, având în vedere abundenţa plantelor pe Terra şi rolul diferitelor bacterii filosferice în cadrul unor procese importante. Frunzele constituie un habitat microbian foarte vast. Se estimează că aria suprafeţelor foliare terestre care poate fi colonizată de către microorganisme este de aproximativ 6,4×10⁸ km². Dat fiind numărul mare de bacterii de pe frunze din zonele temperate ale Globului şi faptul că populaţiile din zonele tropicale sunt probabil şi mai vaste, populaţia bacteriană filosferică planetară poate atinge un număr de 10²⁶ celule (Morris, şi Kinkel, 2002). În mod clar, în cadrul agregatelor, aceste bacterii sunt suficient de numeroase pentru a putea participa în cadrul multor procese de importanţă globală, cât şi în cadrul comportamentului plantelor a căror suprafaţă o colonizează.

Suprafaţa foliară a fost de mult timp considerată a fi un mediu ostil pentru colonizatorii bacterienei. Suprafaţa foliară este expusă fluctuaţiilor rapide de temperatură şi umidităţii relative, cât şi alternanţelor repetate între prezenţa şi absenţa umidităţii normale menţinută de ploi şi rouă. Frunza asigură, de asemenea, resurse nutritive limitate pentru colonizatorii bacterieni. Deşi alte habitate le oferă probabil condiţii extreme (deshidratare, temperaturi extreme etc.), acestea nu prezintă astfel de fluctuaţii rapide extreme ale acestor condiţii fizice diferite. Numeroşi factori pot influenţa microhabitatul întâlnit de către bacterii pe suprafaţa foliară. În primul rând, frunza însăşi este înconjurată de un strat laminar foarte subţire în cadrul căruia umiditatea emisă prin stomate poate fi izolată, micşorând astfel stresul hidric la care sunt expuse epifitele. În al doilea rând, unele celule dintr-o populaţie bacteriană foliară, în special cele din cadrul populaţiilor patogene ale plantelor, nu pot coloniza zonele expuse ale suprafeţei foliare, dar pot invada local interiorul frunzei, evitând stresul de la exteriorul frunzei, colonizând camerele substomatice sau alte locaţii de la interiorul frunzei. Astfel, în timp ce unii fitopatogeni au posibilitatea de a evita stresul, aparent, majoritatea altor epifite trebuie să-l tolereze (Beattie şi Lindow, 1999). Această problemă ridică întrebarea: La ce ne referim când spunem bacterii epifite, termen care de obicei transmite imaginea colonizatorilor suprafeţelor foliare? În timp ce majoritatea colonizatorilor bacterieni ai plantelor pot fi uşor îndepărtaţi de pe frunze prin spălare sau pot fi omorâţi de agenţi care nu penetrează frunza, cum sunt peroxidul sau radiaţiile UV (Wilson şi colab., 1999), este probabil mai potrivit ca această colonizare epifită să fie percepută ca fiind tridimensională, în comparaţie cu procesul planar imaginat uneori. Astfel, condiţiile reale la care sunt expuse epifitele pe frunze sunt probabil destul de diferite de cele estimate în urma măsurătorilor la scară largă a iradierii, umidităţii etc.

Frunzele, tulpinile, florile şi fructele plantelor sunt frecvent colonizate de microorganisme epifite (bacterii, fungi, levuri, alge) pentru care aceste organe reprezintă habitate adecvate.

Suprafaţa frunzelor verzi sănătoase este populată de o serie de microorganisme saprofite, dintre care unele apar rar în alte nişe ecologice. Mediul natural, reprezentat de suprafaţa frunzelor este expus direct luminii solare, variaţiilor de climă şi de temperatură, umiditate şi uscăciune, precum şi celor legate de vârsta frunzelor. Dispersia microorganismelor din filosferă este favorizată de ploi, de curenţii de aer, de praf, de insecte şi de multe mecanisme proprii (balistosporii).

Bacteriile sunt cele mai numeroase şi includ, în special, ca şi în cazul celorlalte microorganisme, specii cu pigment roşu, verde, galben etc., cu rol protector faţă de radiaţiile solare. Actinomicetele, deşi frecvente în sol, sunt prezente doar rar pe frunze. Microfungii, în special levurile, dispun de un mecanism foarte eficient de dispersare de la o frunză la alta, respectiv de balistospori.

Numeroase exemple demonstrează că microorganismele saprofite de pe suprafeţele foliare pot controla eficient dezvoltarea patogenilor pentru plante. Acest efect se poate realiza prin competiţie şi în primele stadii de acţiune ale acestora, prin sinteza de metaboliţi, care le diminuează virulenţa sau stimulează rezistenţa gazdei.

Unele microorganisme sintetizează fitoalexine, gibereline, substanţe de tip auxinic etc. Unii fungi endofiţi, ca Acremonium coenophialum, produc substanţe repelente care protejează planta gazdă (Festuca arundinaceea), respingând sau limitând capacitatea de hrănire a afidelor sau producând tulburări digestive animalelor erbivore. Fungii transmisibili prin seminţe găsesc în planta gazdă adăpost şi nutrienţi, iar aceasta beneficiază prin îndepărtarea consumatorilor potenţiali.

Cunoaşterea rolului microorganismelor din filosferă ridică o serie de probleme dificile legate de acţiunea fungicidelor. Acestea pot avea un efect benefic dacă omoară microfungii lipolitici (Sporobolomyces, Aureobasidium), prin faptul că întârzie fenomenele de senescenţă foliară, menţinând cerurile cuticulare în stare nealterată. Efectul poate fi însă nociv dacă diminuează rezistenţa naturală, prin îndepărtarea microorganismelor saprofite care competiţionează cu cele patogene.

Numeroase exemple de microorganisme din filosferă demonstrează că microorganismele saprofite de pe suprafeţele foliare pot controla eficient dezvoltarea patogenilor pentru plante. Acest efect se poate realiza prin competiţie în primele stadii de acţiune ale acestora, prin sinteza de metaboliţi care le diminuează virulenţa sau stimulează rezistenţa gazdei.

Suprafaţa totală a vegetaţiei terestre însumează peste 500 de milioane de km² (Morris şi Kinkel, 2002). Frunza reprezintă un habitat pentru microorganismele epifite. Este un habitat efemer care durează doar câteva săptămâni în cazul multor plante anuale şi până la câţiva ani în cazul speciilor lemnoase perene; este un habitat foarte dinamic, expus unor pronunţate variaţii ciclice şi non ciclice ale condiţiilor de mediu (Andrews, 1996) şi diferit faţă de majoritatea habitatelor în cazul cărora limitele sunt mai mult sau mai puţin arbitrar definite, marginile frunzei delimitând în mod clar graniţa comunităţilor microbiene. Comunităţile epifite sunt supuse unor schimbări rapide şi frecvente ale factorilor de mediu (temperatură, umiditate, viteza vântului, radiaţii), unii dintre aceştia constituind un factor de stres pentru unele bacterii (Hirano şiUpper, 2000).

O caracteristică tipică a populaţiilor bacteriene epifite este variabilitatea ridicată în timp şi spaţiu. Dimensiunile populaţiilor pot varia enorm chiar şi în cazul unor frunze adiacente, identice la o primă privire, ale aceluiaşi individ (Andrews, 1996).

Nomenclatura speciilor luate în studiu în lucrarea de faţă a fost preluată din principalele lucrări de floristică publicate în ţară şi străinătate. După Flora României (vol. 8), cele două specii din Familia Lamiaceae sunt perene, cultivate în ţara noastră ca plante medicinale sau ornamentale.
●Ocimum basilicum L. (busuioc). Busuiocul este o plantă de un verde deschis, pubescentă, aromatică. Tulpină este erectă, înaltă de 20-60 cm, ramificată de la bază iar frunzele sunt ovate, acute, la bază atenuate în peţiol, lungi de 3-5 cm, late de 2-2,5 cm, întregi sau slab dinţate, pe dos cu numeroase glande secretoare şi cu 4-5 perechi de nervuri secundare. Inflorescenţa este întrerupt spiciformă, formată din verticile pauciflore scurt pedunculate, cu câte 4-6 flori scurt pedicelate. Caliciul prezintă un tub foarte scurt, bilabiat, persistent; labiul superior orbicular, de 5-6 mm în diametru, ciliat pe margini, cel inferior cu 4 dinţi (uneori 3) înguşti. Corola este albă sau alburie, cu tubul scurt, bilabiată; labiul superior cu 4 lobi scurţi, rotunjiţi, cel inferior întreg, mai lung decât cel superior. Staminele sunt exserte, cu antere aproape sferice, sprijinite pe labiul inferior al corolei şi uşor curbate în sus; prezintă filamente lungi, cele posterioare cu câte un mic apendice subulat. Stilul este subţire. Sunt prezente 4 nucule, ovoidale, lungi de 1,5-2 mm, care în mediu umed devin mucilaginoase. Planta prezintă numeroase forme horticole care după Benth. se deosebesc prin mărimea şi grosimea frunzelor, prin mărimea florilor şi prin pubescenţa pronunţată a frunzelor (Guşuleac, 1961).

Genul Ocimum cuprinde plante ierboase anuale şi perene, precum şi arbuşti, provenind din regiunile tropicale şi subtropicale ale Asiei, Africii, Americii de Sud, şi cu o largă răspândire pe glob. Taxonomia genului este complexă, din cauza hibridării interspecifice şi poliploidiei. Unii autori (Pushpangadan şi Bradu, 1995, cf. Telci şi colab., 2006; Labra şi colab., 2005) au recunoscut 150 de specii, Paton şi colab., (1999) (cf. Telci şi colab., 2006) a propus doar 65 de specii, pe când alţi autori acceptă existenţa a circa 35 de specii de Ocimum. Cele mai importante specii ale genului sunt Ocimum sanctum L. şi Ocimum basilicum L., ultima specie constituind obiectul nostru de studiu şi asupra căreia vom insista în mod deosebit..

Frunzele plantelor din genul Ocimum produc un ulei esenţial a cărui compoziţie a fost stabilită prin gaz-cromatografie. Acesta conţine eugenol, eugenal, carvacrol, metil-chavicol (estragol), limatrol, cariofilin. Uleiul din seminţe este compus din acizi graşi şi sitosterol, iar mucilagiul are, ca zaharuri, xiloza şi polizaharidele. Speciile cu frunze verzi conţin şi antociani.

Prezenţa eugenolului din frunze îi conferă proprietăţi antimicrobiene şi antiinflamatoare, fiind indicat şi în afecţiunile respiratorii. Menţine sănătatea tractului respirator şi plămânilor, fiind un antiinflamator. Uleiul are proprietăţi insecticide, omorând, de exemplu, ţânţarii şi iInhibă creşterea in vitro a microorganismelor Mycobacterium tuberculosis şi Micrococcus pyogenes var. aureus, datorită, mai ales, prezenţei eugenolului şi metal-eugenolului. Extractele eterice şi alcoolice din frunze de Ocimum sanctum au demonstrat efecte semnificative împotriva bacteriei Escherichia coli. Uleiurile sale esenţiale conţin substanţe biologic active cu acţiune nematicidă, insecticidă, fungistatică şi antifungicidă (Candida albicans, Penicillium notatum, şi Microsporeum gyseum), antimicrobiană (Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis şi Escherichia coli).

Testarea efectului insecticid al uleiurilor esenţiale de Ocimum basilicum L. asupra coleopterului Callosobruchus maculates a evidenţiat că uleiurile foarte toxice, care au determinat procentaje de 40-100% în mortalitate a insectelor au fost cele care conţineau, ca principal component, eugenolul sau metil chavicolul (Pascual-Villalobos şi Ballesta-Acosta, 2003).

În literatură există relativ puţine referiri la toxicitatea componenţilor chimici ai speciilor genului Ocimum. Totuşi, se cunoaşte faptul că busuiocul comun conţine astfel de substanţe periculoase – safrolul, acidul cafeic, triptofanul, quercetinul. Triptofanul determină, de exemplu, o boală respiratorie la bovine, acidul cafeic (un acid fenolic) poate inhiba digestia la rumegătoare, iar quercetinul este cocarcinogen al unui papilomavirus bovin.

Concluzia este că, atât la Ocimum sanctum şi Ocimum basilicum, cât şi la celelalte specii ale genului Ocimum, există o mare variaţie intraspecifică, realitate ce deschide perspective favorabile pentru ameliorare şi selecţie.
●Perovskia atriplicifolia Benth. Este originară şi creşte în zonele pietoase din Afganistan şi Pakistan şi este cunoscută pentru proprietăţile sale febrifuge şi utilizată în medicină pentru scăderea febrei, având şi utilizări culinare, dar şi decorative ori de purificare a aerului (efect de tip aerosoli). În Europa este cultivată ca plantă decorativă. (Pourmortazavi, 2003). Este o plantă cu tulpini de culoare gri-albicioasă şi frunze lobate, adânc dinţate de culoare gri-argintat cu o lungime de 5 cm şi o lăţime de 2,5 cm. Tulpinile mature sunt lemnoase la bază iar cele tinere sunt ierboase, tulpina fiind pătratică în secţiune transversală. Tulpinile şi frunzele emană un miros specific de salvie prin strivire. La sfârşitul verii şi toamna planta produce inflorescenţe cu flori tubulare de culoare albastră sau liliachie. Inflorescenţele pot atinge o lungime de 30 cm şi rezistă până la 3 luni. Planta creşte sub formă de tufă ce poate atinge o înălţime de 1,5 m şi o circumferinţă de 60 cm (Cox, 2002).


Elaborarea şi parcurgerea unui model experimental optim caracterizării filosferei la specii aparţinând genului Ocimum şi Perovskia, cultivate în condiţii naturale.
Stabilirea protocoalelor experimentale pentru analiza specifică a comunităţilor filosferei, prin adaptare la caracteristicile biologice ale speciilor testate. În vederea izolării microorganismelor din filosfera unor specii de Ocimum şi Perovskia au fost utilizate două metode:

1. amprentarea pe agar nutritiv (Tsavkelova et al., 2007): frunze din diferite regiuni ale plantei (bază şi vârf) au fost aşezate în condiţii sterile pe suprafaţa mediului de cultură, atât pe faţa ventrală cât şi pe cea dorsală; plăcile Petri au fost ulterior incubate 72 ore la 28⁰ C (Fig. 1 - 3).

Fig. 1 – Perovskia atriplicifolia - frunze bazale: amprentă pe agar nutritiv	Fig. 2 – Perovskia atriplicifolia - frunze apicale: amprentă pe agar nutritiv
Fig. 3– Ocimum basilicum - amprentă frunză pe agar nutritiv: faţă ventrală

2. însămânţarea la suprafaţa mediului de cultură (agar nutritiv) a unor diluţii zecimale provenite din suspensii microbiene în apă distilată sterilă: frunze de Ocimum basilicum, respectiv Perovskia atriplicifolia au fost introduse în baloane cu apă distilată sterilă, agitate apoi la 210 rpm şi 28⁰ C, timp de 30 min; din aceste suspensii au fost obţinute diluţii zecimale seriate care au fost însămânţate prin etalare (Dunca et al., 2004). Ulterior, plăcile Petri au fost incubate 72 ore la 28⁰ C (Fig. 4, Fig. 5).

După cele trei zile de incubare, de pe suprafaţa plăcilor cu coloniile dezvoltate, s-au izolat (pe baza caracterelor macro-morfologice) mai multe tulpini bacteriene. Repicarea s-a făcut cu ajutorul ansei sterile, în eprubete cu mediu de cultură înclinat, având aceeaşi compoziţie cu cea a mediului iniţial folosit pentru izolare. Eprubetele însămânţate prin tehnica descrierii de striuri la suprafaţă au fost incubate la 28⁰ C, timp de patru zile.

Fig. 4 – Colonii bacteriene izolate din filosfera speciei Ocimum basilicum dezvoltate pe agar nutritiv

Fig. 5 – Colonii bacteriene izolate din filosfera speciei Perovskia atriplicifolia dezvoltate pe agar nutritiv

Pentru verificarea purităţii tulpinilor izolate, dar şi pentru descrierea caracterelor micro-morfologice s-au efectuat frotiuri colorate după metoda Gram (Dunca et al., 2004) care au fost supuse examenului microscopic (1000 x).

După întocmirea colecţiei, tulpinile pure s-au păstrat la temperatura de + 4⁰ C, fiind trecute, la intervale regulate de timp, pe mediu proaspăt. Colecţia de microorganisme astfel întocmită a servit studiilor ulterioare.

• 
  Izolarea microorganismelor din filosfera unor specii de Ocimum şi Perovskia prin tehnici diferite, pentru alegerea metodei optime de lucru.
  

Izolarea microorganismelor de pe frunzele de Ocimum basilicum şi Perovskia atriplicifolia s-a realizat pe parcursul anului 2009, în două etape corespunzătoare unor fenofaze diferite (vegetativ şi înflorire). Utilizând cele două metode prezentate anterior au fost izolate un număr de 25 tulpini bacteriene, respectiv 3 tulpini levuriene (Fig. 6) din filosfera speciei Perovskia atriplicifolia şi un număr de 19 tulpini bacteriene (Fig. 7) din filosfera speciei Ocimum basilicum. Toate tulpinile au fost examinate macro- şi micro-morfologic, rezultatele urmând a fi prezentate în etapa următoare, conform planului de realizare al proiectului.

Fig. 6 – Aspectul micro-morfologic al tulpinii fb 2-2 izolată din filosfera speciei Perovskia atriplicifolia (1000 x)

Fig. 7 – Aspectul micro-morfologic al tulpinii fv 1-3 izolată din filosfera speciei Ocimum basilicum (1000 x)

În scopul optimizării metodei de izolare a microorganismelor filosferice s-au testat cele două metode descrise mai sus: amprentarea şi însămânţarea la suprafaţa mediului de cultură a unor suspensii în apă distilată sterilă cu microorganisme de pe suprafaţa frunzelor. Deşi a doua metodă utilizată a permis izolarea unui număr mai mare de tulpini microbiene, ne-am propus, pentru activităţile aferente următoarei etape, utilizarea ambelor metode, amprentarea prezentând totuşi avantajul unei localizări mai precise a microorganismelor la nivelul celor două feţe foliare (ventrală şi dorsală). Rezultatele obţinute prin utilizarea amprentării ca metodă de izolare vor putea fi corelate mai bine cu investigaţiile de microscopie electronică ale limbului foliar ce vor fi realizate pe parcursul etapelor viitoare.

De asemenea, pentru izolările ulterioare, vom testa comparativ utilizarea unui sistem tampon (PBS – tampon fosfat salin) în locul apei distilate la obţinerea suspensiilor cu microorganisme de pe suprafaţa frunzelor de Ocimum basilicum şi Perovskia atriplicifolia.