Universitatea „alexandru ioan cuza”IAŞI

Caracterizarea filosferei în corelaţie cu particularitătile morfo-anatomice şi fiziologice ale aparatului foliar şi cu producţia de uleiuri volatile la specii de Ocimum şi Perovskia, în condiţii naturale de cultivare şi/sau condiţii de seră,

în ciclul ontogenetic al plantelor.

• 
  Evidenţierea caracteristicilor micromorfologice ale suprafeţei limbului foliar la speciile de Ocimum si Perovskia luate în studiu, utilizând tehnica microscopiei de baleaj.
  

Material si metoda de lucru

Pregătirea probelor pentru SEM. Microscopul electronic cu scanare (SEM) produce imagini prin detecţia electronilor secundari, cu energie scăzută, emisii de pe suprafaţa specimenului datorită excitării acestuia de către raza principală de electroni. In cazul SEM, raza de electroni parcurge întreg specimenul, detectorii construind o imagine prin maparea semnalelor detectate la poziţia razei.

În general, rezoluţia TEM este de regulă cu un ordin de mărime mai mare decât cea a SEM, dar, datorită faptului ca imaginea produsă de microscoapele cu scanare se bazează pe procese de suprafaţă şi nu pe transmisie, este capabil să vizualizeze probe mai mari, şi are o adâncime de penetrare mult mai mare, producând astfel imagini care sunt o bună reprezentare tridimensională a probei.

• 
  Recoltarea probelor – Prelevarea probelor se realizează de pe exemplare vii, secţionarea ţesuturilor realizându-se direct intr-o picătura de fixator (glutaraldehida). Ţesuturile se secţionează in blocuri mici (pot avea pana la 1 cm²).
  
• 
  Fixarea si deshidratarea - Prima etapa a fixării se realizează în glutaraldehidă 2,5% (2 ore). Probele se spală cu tampon fosfat şi apoi se realizează postfixarea cu tetraoxid de osmiu 2% (2 ore).
  
• 
  Deshidratarea se face în băi succesive de alcool etilic (35%, 50%, 70%, 90%, 95%, câte 15 minute şi alcool absolut – de trei ori, câte 20 minute). După deshidratarea in alcool etilic absolut probele se trec in doua bai de acetona anhidra.
  
• 
  Uscarea la punctul critic al dioxidului de carbon (cu EMS 850 Critical Point Dryer) – este necesară pentru prezervarea detaliilor structurale ale probei analizate. Uscarea la aer poate cauza deformări accentuate ale suprafeţelor materialelor biologice cauzate, in principal, de tensiunea supeficială a apei. Utilizând uscarea la punctul critic al dioxidului de carbon aceasta tensiune superficială este redusă aproape la 0. În momentul atingerii punctului critic (31,1⁰C la o presiune de 1250 psi) CO₂ lichid trece direct in faza gazoasă, iar eliminarea acestuia din probe, odată cu scăderea presiunii se realizează cu păstrarea intactă a structurilor existente.
  
• 
  Metalizarea probelor uscate (cu metalizorul EMS 550X Sputter Coater) este necesara pentru observarea acestora în camera de vid a SEM. Metalizarea se realizează fie cu aur, fie cu aur-paladiu. Stratul de metal depus are grosimea de 30-60 angstromi (funcţie de detaliile ce se doresc a fi observate).
  
• 
  Analiza probelor s-a realizat cu ajutorul microscopului electronic de baleiaj TESCAN Vega II SBH, la o acceleraţie a electronilor de 30 kV.
  
• 
  Măsurătorile diferiţilor parametri morfologici au fost efectuate cu ajutorul softului de morfometrie NIS – Elements furnizat de firma Nikon.
  

Pregătirea probelor pentru investigaţiile histo-anatomice

Materialul vegetal a fost fixat in FEA (formol: alcool etilic 70%: acid acetic glacial 5:5:90) timp de 72 de ore, apoi spălat şi conservat în alcool etilic 70%. Ulterior, a fost prelucrat fie prin imparafinare (secţiunile fiind colorate cu roşu ruteniu şi albastru de metilen) şi secţionate manual cu briciul botanic (şi colorate cu roşu ruteniu si verde iod). Fotografiile au fost efectuate la microscopul de cercetare trinocular Olympus BX50 cu camera foto digitala Olympus E 330.

Aspecte anatomice si micromorfologice la Ocimum basilicum
Pe frunzele de la Ocimum basilicum se pot observa peri tectori şi peri secretori pe ambele epiderme. Perii tectori sunt uniseriaţi, formaţi din 1-5 celule cu pereţii îngroşaţi.

Perii secretori sunt de doua feluri (figurile 8, 9, 10) – peri capitaţi cu glanda unicelulară şi peri peltaţi, cu glanda pluricelulară. Perii capitaţi sunt alcătuiţi dintr-o celulă bazală, o celulă picior şi una (mai rar două) celule glandulare. Când există o singură celulă glandulară, aceasta este piriformă sau alungită; când exista două celule glandulare, acestea sunt aşezate una lângă alta (pe orizontală). Perii peltaţi au o structură asemănătoare, cu deosebirea că glanda este alcătuita din patru celule. Uleiul volatil produs de celulele glandulare se acumulează, ca la toate speciile de Lamiaceae, între peretele extern al celulelor glandulare şi cuticulă. Aceasta duce la detaşarea cuticulei de celulele glandulare şi la apariţia unui spaţiu de depozitare comun pentru uleiurile volatile. Când spaţiul subcuticular se umple cu produsul de secreţie, perii glandulari, intraţi în faza postsecretoare, degenerează. La perii capitaţi s-a observat doar o uşoară mărire a spaţiului subcuticular (în acest caz materialul secretat se acumulează în lumenul celulei glandulare (Werker et al, 1993).

Perii secretori ajung la maturitate (în faza secretoare) chiar pe frunzele foarte tinere (0,5-1mm lungime). Pe frunzele tinere deja se pot observa peri secretori în faza post-secretoare. Pe frunzele ajunse la maturitate se pot observa peri în toate stadiile de dezvoltare; acest fapt sugerează o continuă histogeneza a perilor glandulari pe toată durata dezvoltării frunzelor. Pe frunzele bazale, perii glandulari se pot observa mai ales în etapa post-secretoare, datorita încetării formării de noi peri odată cu diferenţierea completă a celulelor epidermice şi încetarea creşterii în suprafaţă a frunzei.



Fig. 8 – Tipuri de peri glandulari de pe frunze de vârste diferite de Ocimum basilicum: A – păr peltat în faza pre-secretoare, B – păr capitat în faza pre-secretoare, C – păr peltat în faza pre-secretoare (stânga) şi post-secretoare (dreapta), D – păr capitat cu glanda bicelulară, E, F – peri peltaţi în faza secretoare, G, H - peri peltaţi în faza post-secretoare şi peri capitaţi în faza pre-secretoare (original)








Fig. 10 – Aspecte electrono-microscopice (SEM) ale perilor glandulari de pe frunzele tinere: A – epiderma superioară, B – epiderma inferioară, C – păr glandular capitat de pe epiderma superioară, D – păr peltat de pe epiderma superioară (original)

Pe ambele epiderme ale frunzelor tinere se întâlnesc peri aflaţi în toate stadiile de dezvoltare (de la peri abia iniţiaţi, în fazele pre-secretoare şi secretoare, mai puţini în faza post-secretoare). Diametrul glandei secretoare (atât la perii peltaţi cat si la cei capitaţi) este mai mare pe epiderma superioara) (Tab.1). De asemenea, densitatea perilor glandulari este mai mare pe epiderma superioara decât pe cea inferioară.
Tabel 1 – Variaţia diametrului glandei şi a densităţii perilor secretori pe frunze tinere (valorile reprezintă media ± deviaţia standard)

	Epiderma inferioară	Epiderma superioară
Diametru glanda tetracelulară (μm)	62.29±3.32	32.69±3.34
Diametru glanda unicelulară (μm)	25.09±4.22	23.91±2.43
Diametru glanda bicelulară (μm)	32.75±5.61	16.59±1.4
Densitate peri cu glanda tetracelulară (nr/μm^2)	12.3±1.87	42.32±9.76
Densitate peri cu glanda bicelulară (nr/μm^2)	17.3±2.32	23.7±2.87
Densitate peri cu glanda unicelulară (nr/μm^2)	20.3±1.56	60.43±12.98

Aspecte anatomice şi micromorfologice la Perovskia atriplicifolia
În urma analizei la microscopul fotonic şi la cel electronic cu baleiaj, la nivelul epidermei inferioare şi superioare a frunzei, precum şi pe sepale, petale şi antere, s-au observat următoarele tipuri de peri (figurile 11, 12, 13, 14): peri secretori cu glanda bicelulară, peri secretori cu glanda tetracelulară, peri secretori cu glanda multicelulară (formată din 10 celule) şi peri tectori pluricelulari ramificaţi.

La nivelul organelor de reproducere, pe petale si sepale am observat aceleaşi tipuri de peri, iar pe stamine doar peri secretori cu glanda multicelulară.

L
A.
a maturitate, glanda secretoare pluricelulară prezintă un spaţiu subcuticular mare. Această cavitate se va umple cu ulei volatil odată cu începerea procesului de secreţie. Spaţiul celular care ia astfel naştere se măreşte pe măsură ce uleiul este secretat şi eliberat la nivelul acestei cavităţi. Produşii de secreţie trec prin membrana plasmatică şi peretele celulelor secretoare şi se acumulează în această cavitate de acumulare a produşilor de secreţie. Atunci când cuticula se rupe, produşii de secreţie sunt eliberaţi. La perii secretori cu glanda pluricelulară acest spaţiu subcuticular depăşeşte în înălţime celulele glandulare propriu-zise.




Fig. 11 – Tipuri de peri glandulari de pe frunze de vârste diferite de Perovskia atriplicifolia: A – păr peltat cu glanda multicelulară în faza secretoare, B, C - păr peltat cu glanda multicelulară în faza post-secretoare, D – păr peltat cu glanda tetracelulară în faza secretoare, E - păr capitat cu glanda bicelulară, (original)








Fig. 12 – Aspecte electrono-microscopice (SEM) ale perilor glandulari de pe frunzele din treimea mijlocie a tulpinii: A – epiderma inferioară, B – păr glandular peltat cu glanda tetracelulară de pe epiderma superioară, C – păr glandular peltat cu glanda multicelulară de pe epiderma inferioară, D – păr glandular capitat de pe epiderma superioară (original)

Tabel 2 – Variaţia diametrului glandei şi a densităţii perilor secretori pe frunze tinere (valorile reprezintă media ± deviaţia standard)

	Epiderma inferioară	Epiderma superioară
Diametru glanda multicelulară (μm)	48.39±7.23	56.09±4.64
Diametru glanda bicelulară (μm)	17.02± 2.2	18.94± 2.7
Densitate peri cu glanda multicelulară (nr/μm^2)	52.56±5.87	44.54±3.65
Densitate peri cu glanda bicelulară (nr/μm^2)	92.45±11.34	64.81±9.45

Diametrul glandei secretoare este mai mare în cazul perilor de pe epiderma superioară, atât în cazul perilor peltaţi. cât şi a perilor capitaţi (Tab. 2). Densitatea lor insă este mai mare pe epiderma inferioară. Măsurătorile s-au realizat la frunze situate în treimea mijlocie a tulpinii.

Au fost analizaţi, la microscopul electronic cu baleiaj, perii secretori de pe organele de reproducere. Pe sepale şi petale perii peltaţi sunt foarte abundenţi atât în epiderma superioară, cât şi în cea inferioară. Perii scurţi, capitaţi sunt prezenţi îndeosebi pe faţa externă a sepalelor. La petale, perii peltaţi apar de timpuriu, îndeosebi pe faţa externă (inferioară); pe măsură ce tubul corolei creşte, ei devin tot mai numeroşi, îndeosebi la vârful acesteia, atât pe faţa superioară, cât şi pe cea inferioară. De asemenea, perii peltaţi, cu glanda multicelulară sunt vizibili în şanţul anterior al anterelor.





Fig. 13 – Aspecte electrono-microscopice (SEM) ale perilor glandulari de pe sepale şi petale: A – sepală şi petală, B – păr glandular peltat cu glanda multicelulară de pe petală, C, D – peri glandulari peltaţi cu glanda multicelulară de pe sepale, (original)








Fig. 14 – Aspecte electrono-microscopice (SEM) ale perilor glandulari de pe antere şi sepale: A – anteră (ansamblu), B – păr glandular peltat de pe anteră C - păr glandular capitat cu glanda bicelulară, D - păr glandular peltat cu glanda multicelulară de pe sepale (original)

• 
  Extracţia şi caracterizarea uleiurilor volatile la diferite specii de Ocimum şi Perovskia prin metoda gaz cromatografică
  

Deşi proprietăţile antimicrobiene ale uleiurilor volatile şi ale componenţilor lor au fost studiate în trecut, mecanismul acţiunii lor nu a fost studiat în detaliu. Ţinând cont de numărul mare al diferitelor grupuri de compuşi chimici prezenţi în compoziţia uleiurilor volatile este foarte posibil ca activitatea lor antimicrobiană să nu poată fi atribuită unui mecanism specific ci existenţei unui număr mare de locaţii ţintă în celulă. Nu toate aceste mecanisme reprezintă ţinte separate, unele reprezintă consecinţe ale altor mecanisme ţintă. O importantă caracteristică a uleiurilor volatile şi a compuşilor lor este hidrofobia, aceasta permiţându-le să afecteze structura lipidică a membranei celulare bacteriene şi să le crească permeabilitatea, celulele pierzând ioni şi alte componente celulare.

Structura chimică a compuşilor individuali ai uleiurilor volatile afectează modul lor specific de acţiune antibacteriană. A fost confirmată importanţa prezenţei grupării hidroxil în cadrul compuşilor fenolici cum sunt carvacrolul şi thimolul. Poziţia acestei grupări în cadrul inelului fenolic nu pare să afecteze mult gradul activităţii antibacteriene. Se pare că acţiunea thimolului asupra speciilor Bacillus cereus, Staphylococcus aureus şi Pseudomonas aeruginosa este comparabil cu cel al carvacrolului de exemplu.

Uleiurile volatile au proprietăţi antibacteriene, antifungice, antivirale, insecticide şi antioxidante, unele uleiuri fiind utilizate chiar în tratarea cancerului, iar altele în aromaterapie, parfumerie şi pentru conservarea alimentelor. Uleiurile volatile reprezintă o sursă bogată de compuşi biologici activi, proprietăţile antifungice ale extractelor obţinute din plante medicinale, în special cele ale uleiurilor volatile stârnind un interes din ce în ce mai mare. O gamă largă de compuşi vegetali din cadrul acestor uleiuri prezintă activitate antimicrobiană specifică cât şi generală şi un potenţial efect antibioitic.

Uleiurile volatile şi extractele vegetale au fost utilizate de mii de ani în medicina alternativă, industria farmaceutică, terapii naturiste şi conservarea alimentelor, aceste uleiuri fiind potenţiale surse de compuşi antimicrobieni noi în special împotriva patogenilor bacterieni. O caracteristică importantă a uleiurilor volatile şi a componenţilor lor o reprezintă hidrofobia, proprietate ce le permite să partiţioneze lipidele din cadrul membranelor celulare bacteriene şi din cadrul mitocondriilor, afectând structurile celulare şi făcându-le mai permeabile; pierderea moleculelor şi a ionilor indispensabili va duce la moartea celulelor bacteriene. Alte studii au arătat că bacteriile Gram-pozitive sunt mai rezistente faţă de efectul uleiurilor volatile decât cele Gram–negative.

Au fost efectuate numeroase studii pentru a demonstra eficacitatea uleiurilor volatile ca şi agenţi antimicrobieni cu scopul de a putea fi folosite ulterior pe scară largă în scopuri comerciale. Unul dintre aceste studii, realizat de către Prabuseenivasan şi colab. în 2006 a avut ca scop testarea efectului antimicrobian a 21 de uleiuri volatile utilizate în medicina tradiţională indiană asupra unui număr de patru tulpini de bacterii Gram–negative (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeriginosa, Proteus vulgaris) şi două tulpini bacteriene Gram–pozitive (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus). Rezultatele obţinute au arătat faptul că uleiurile selectate au avut activitate antibacteriană diferită. Din 21 de uleiuri volatile 19 au prezentat activitate antibacteriană asupra uneia sau mai multe bacterii. Uleiurile de scorţişoară, lămâie verde, muşcată, rozmarin, portocală, lămâie şi cuişoare au avut activitate antibacteriană maximă asupra tuturor bacteriilor test, în timp ce uleiurile de anason, eucalipt şi camfor nu au inhibat dezvoltarea nici uneia dintre bacteriile test. Uleiul de busuioc a avut un efect antibacterian moderat. Nu au fost sesizate diferenţe evidente între bacteriile Gram–negative şi cele Gram–pozitive în ceea ce priveşte susceptibilitatea acestora.

Uleiurile volatile care sunt caracteristice plantelor din Familia Lamiaceae nu sunt singurii metaboliţi secundari conţinuţi de către plantele aromatice, compuşii fenolici fiind de asemenea întâlniţi (Cuvelier şi colab., 1996; Van Den Broucke, 1982). Avantajele pe care le au aceste plante de pe urma metaboliţilor secundari sunt încă intens dezbătute în ciuda recunoaşterii activităţii lor biologice. Atât terpenele cât şi compuşii fenolici sunt importanţi în apărarea plantelor împotriva insectelor şi a animalelor ierbivore, în încercarea lor de a câştiga spaţiu şi resurse faţă de plantele competitoare (Harborne, 1997; Vakou, 1992) cât şi împotriva microorganismelor patogene (Jenssen şi colab., 1987; Bennett şi colab., 1994).

Metaboliţi secundari ca alcaloizi, izoprenoizi şi acizi fenolici sunt eliminaţi sub formă de exudate de către frunze şi sunt eliminaţi la suprafaţa acestora (Fiala, 1990). S-a arătat faptul că mulţi dintre ei inhibă creşterea fungilor, a bacteriilor şi a virusurilor (Grayer şi Harborne, 1994). De exemplu, s-a arătat că uleiurile volatile produse de către perii glandulari de pe suprafaţa frunzelor sunt active faţă de un spectru larg de microorganisme (Deans şi Ritchie, 1987). Totuşi, efectele uleiurilor volatile nu sunt întotdeauna negative; în unele cazuri acestea sporesc creşterea microbiană (Vokou, 1999), felul în care diferiţi nutrienţi, metaboliţi primari şi secundari de la nivelul frunzei influenţează colonizarea microbiană la nivelul filosferei rămânând, încă, incomplet elucidată.

Materialul vegetal analizat a fost reprezentat de tulpini şi frunze proaspăt recoltate de la plante aflate în etapa de anteză în cazul speciei Ocimum basilicum L., de frunze proaspăt recoltate de la plante aflate în etapa vegetativă (două populaţii de plante, care au constituit tot atâtea probe de lucru), precum şi de frunze şi flori proaspăt recoltate de la plante aflate în etapa de anteză în cazul speciei Perovskia atriplicifolia Benth.

Metoda de extracţie a uleiurilor volatile

În vederea extracţiei uleiurilor volatile s-a utilizat un dispozitiv de hidrodistilare de tip Clevenger ce se bazează pe recircularea apei, pentru eliminarea pierderilor de ulei volatil prin dizolvare în apă. Încălzirea s-a realizat la foc direct, instalaţia fiind permanent monitorizată pentru a evita supraîncălzirea vasului de distilare. Materialul vegetal a fost introdus în balonul aparatului după ce a fost cântărit în prealabil, adăugându-se 500 ml de apă, iar distilarea a durat aproximativ 3-4 ore.

Analiza cromatografică a uleiurilor volatile

În vederea analizei calitative a uleiurilor volatile s-a utilizat metoda cromatografiei GC-MS (gas chromatography - mass spectrometry). Această metodă presupune separarea şi determinarea componenţilor pe baza distribuţiei acestora între două faze:

• 
  staţionară: solid activ sau lichid sub formă de peliculă pe suport solid inert;
  
• 
  mobilă: gaz (are rolul de a traversa componenţii de-a lungul fazei staţionare şi de a-i elua, deplasa sau dezlocui în urma reţinerii).
  

Analiza calitativă a uleiurilor volatile s-a efectuat în cadrul Centrului de Cercetări pentru Studiul Calităţii Produselor Horticole al Facultăţii de Horticultură a Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Bucureşti, aparatul utilizat fiind un gas-cromatograf GC-MS Agilant.
Analiza calitativă a uleiului volatil la speciile de plante aromatice luate în studiu

Ocimum basilicum L.

În urma investigaţiilor asupra uleiului volatil la specia Ocimum basilicum L. au fost evidenţiaţi compuşii caracteristici, care dau proprietăţi specifice fiecărei probe. Nu s-a evidenţiat prezenta metil cinamatului şi a linalolului în nici una dintre cele două probe studiate.

Numărul compuşilor identificaţi în materialul biologic investigat este de 28 de compuşi în prima probă şi de 25 de compuşi în ce-a de-a doua probă. Din totalul compuşilor, 17 sunt comuni pentru ambele probe, dintre care 11 ating valorile procentuale cele mai ridicate în ambele eşantioane, dând practic, caracterul comun aromat al uleiurilor respective.

În funcţie de concentraţie, pe primele 5 poziţii, în cazul ambelor probe studiate, se află următorii compuşi ai uleiului volatil: germacren D (24.103, 10.267%), β - elemen (14.67, 10.010%), r - cadiden ( 5.632, 9.095/), α - guaien (5.095, 3.487) şi γ- Elemen (5.915, 1.504%) (Tab. 3).

Tabel 3 - Numărul compuşilor identificaţi în cele două probe de Ocimum basilicum L.

recoltate în stadiu de anteză