Rapport 2002 du pri «Biocarburant-éthanol»



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Rapport 2002 du PRI « Biocarburant-éthanol »

Objectifs scientifiques

L’éthanol carburant est un additif des essences soit directement soit sous forme de dérivés oxygénés renforçant les propriétés antidétonantes. La levure Saccharomyces cerevisiae, présentant les meilleurs atouts génétiques et métaboliques, a été choisie pour cette étude qui participe d’un programme interactif conduit conjointement par plusieurs équipes de recherche. La compréhension et, conséquemment, la maîtrise du comportement physiologique de la levure en condition de forte teneur en éthanol (supérieure à 15%) devra permettre, à terme, de sélectionner une levure très performante pour la production d’éthanol, particulièrement résistante à des taux élevés d’alcool et capable de croître rapidement.


Stratégies de recherche
Volet 1 : Bases méthodologiques et stratégiques de la production de bioéthanol sur substrats non conventionnels. Coordinateur du projet : J-P Belaich UPR 9036 Bioénergétique et ingénierie des protéines (BIP) Marseille
Mise au point d’une stratégie enzymatique pour la l’hydrolyse et la fermentation de substrats non conventionnels. (J-P Belaich UPR 9036 Bioénergétique et ingénierie des protéines)
Ce rapport présente les résultats obtenus grâce à la collaboration de deux équipes qui se sont impliquées dans cette action (M. Asther INRA et J-P Bélaich CNRS), une collaboration s’est également engagée entre l’équipe de A. Boudet (INRA) et J-P Bélaich.

L’objectif de cette étude est de mettre au point un procédé enzymatique performant pour la biotranformation des lignocelluloses, afin de libérer à partir de la biomasse des sucres fermentescibles en bioéthanol. Dans ce contexte, les microorganismes représentent un potentiel exceptionnel comme source d’enzymes originales et/ou comme moyen de production à l’échelle pilote les enzymes recherchées. La complexité structurale des parois végétales et l’hétérogénéité des polysaccharides qui les composent font que de multiples enzymes, de spécificité différente, sont synthétisées par les micro-organismes lignocellulolytiques qui les dégradent. Les champignons basidiomycètes sont reconnus pour être les micro-organismes les mieux adaptés pour la dégradation des la lignines pariétale grâce aux laccases qu’ils synthétisent. D’autres enzymes comme les estérases produites par Aspergillus niger (féruloyl, cinnamoyl estérases) participent à l’hydrolyse des liaisons esters entre les groupements phénoliques des acides cinnamyliques (liés de façon covalente à la lignine) et les polysaccharides des parois (cellulose, hémicellulose et pectine). L’action de ces deux catégories d’enzymes, qui ont été récemment définis comme enzymes « helper » faciliterait ainsi l’accès des cellulases à leurs substrats naturels.

Un procédé de production de ces deux catégories enzymes pouvant être transposé directement de l’échelle laboratoire à l’échelle pilote a été mis au point. Le cDNA de la laccase du champignon Pycnoporus cinnabarinus a été placé sous le contrôle du promoteur du gène de l'alcool oxydase (Aox1) et du gène de la glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase (gpdA) pour l’exprimer respectivement chez la levure Pichia pastoris et le champignon A. niger. La sécrétion de la protéine a été optimale avec les peptides signaux hétérologues (peptide signal du facteur sexuel  de la levure et de la glucoamylase d’A. niger). Les activités atteintes à 10/12 jours sont respectivement de 50 et 7000 U.I./l, avec une masse moléculaire respectivement de 110 et 70 kDa pour la levure et A. niger, contre 70 kDa pour la protéine sauvage, suggérant la présence d'hyperglycosylation pour la laccase produite par P pastoris. Ces résultats correspondent à une production de 8 et 70 mg/l de laccase pour P. pastoris et A. niger. Cette protéine recombinante est produite majoritairement dans le surnageant de culture d’A. niger et peut être purifiée en une seule étape sur DEAE-Sépharose. Les caractéristiques physico-chimiques de la laccase recombinante sont identiques à celles de la protéine sauvage. Ces résultats nous ont encouragés à poursuivre dans la voie de la surexpression chez les Aspergilli pour la production d’autres enzymes.

La féruloyl estérase (faeIII) d’A. niger a été surexprimée en utilisant le peptide signal de FAE III (surexpression homologue) et le promoteur du gène gpdA. La protéine recombinante est purifiée en une étape sur phényl-sépharose et nous avons estimé la production à 1 g/l de FAE. Le niveau de production nous permet donc d’envisager directement une utilisation de l’enzyme à l’échelle industrielle.

Enfin une troisième enzyme helper, provenant de la bactérie cellulolytique Clostridium cellulolyticum a été étudiée. Il s’agit d’une rhamnogalacturonane lyase qui est une composante du cellulosome de cette bactérie cellulolytique. Cette enzyme est une pectinase qui clive les liaisons glycosidique du rhamnogalacturonane I et agit par béta-élimination.

Enfin une collaboration a été entreprise entre l’équipe d’A. Boudet et celle de J-P Bélaich pour évaluer la biodégradabilité de parois végétales provenant de plantes génétiquement modifiées. Cette étude vient de commencer


Références.

Record E., Punt P.J., Chamkha M., Labat M., van den Hondel C.A.M.J.J. and Asther M. 2002. Expression of the Pycnoporus cinnabarinus laccase gene in Aspergillus niger and characterization of the recombinant protein. European Journal of Biochemistry, 269: 602-609.

Record E., Asther M., Sigoillot C., Pagès S., Punt P. J., Delattre M., Haon M., van den Hondel C.A..M.J.J., Sigoillot J.C., Lesage-Meessen L., AstheR M. 2003. Overproduction of the Aspergillus niger feruloyl esterase for pulp bleaching application. AppliedMicrobiology and Biotechnology (in press).

S. Pages , O. Valette, L. Abdou, A. Belaich and J-P Belaich. A Rhamnogalacturonan lyase in the Clostridium cellulolyticum Cellulosome. Soumis J. Bact.


Volet 2 : Bases moléculaires et dynamiques pour l’ingénierie métabolique de levures performantes pour la production d’ethanol-carburant. Coordinateur du projet : J.M. François UMR 5504 Laboratoire de Biotechnologie Bioprocédés, Toulouse

1- Rappel du contexte :
La levure Saccharomyces cerevisiae est l’organisme qui présente par rapport à d’autres levures ou bactéries, les meilleurs atouts génétiques et métaboliques pour répondre à ce double objectif. Cependant, atteindre cet objectif exige avant tout de comprendre, et de maîtriser le comportement physiologique de la levure en condition de forte teneur en éthanol. Ceci suppose d’engager plusieurs actions de recherche qui peuvent être résumées selon les deux grandes lignes directrices suivantes.

  1. Quantifier l’efficacité métabolique fermentaire. Ceci comprend l’analyse des flux métaboliques, de l’état énergétique et de la balance rédox de la levure au cours de la fermentation, de l’efficacité du découplage entre production d’éthanol et croissance, et aussi de quantifier l’effet inhibiteur de la fermentation alcoolique par l’éthanol (inhibition par le produit) (contribution M. Rigoulet et al., IBCG, Bordeaux)

  2. Identifier les cibles moléculaires impliquées dans l’adaptation de la levure à de fortes teneurs en éthanol (>15%). La résistance à l’éthanol peut être soit ‘acquise’ ou induite. On devrait pouvoir mettre en évidence ces cibles par une approche de génomique globale, et la confirmer par des méthodes protéomiques et métaboliques (Contribution JM François, INSA-Toulouse, S. Dequin, INRA-Montpellier et M. Jacquet, Orsay-Paris).

Bien que ces questions aient déjà été posées dans le passé, la connaissance du génome de la levure, la disponibilité d’outils nouveaux plus performants de technologies post-génomiques (puces à ADN, RMN in vivo, microcalorimétrie, etc) et la volonté de travailler en réseau en faisant interagir plusieurs équipes françaises compétentes et complémentaires sont autant d’atouts pour résoudre ces questions et envisager de construire une levure hyper performante pour la production et la résistance à l’éthanol.

A) Optimisation de la croissance et de la capacité fermentaire chez une levure Saccharomyces cerevisiae résistante à l’éthanol. (M. Rigoulet, Laboratoire d’étude du métabolisme énergétique cellulaire, UMR 5095, Bordeaux).


  1. Optimisation de la croissance aérobie des levures.

La croissance aérobie des levures dépend essentiellement de leur capacité respiratoire, elle-même strictement corrélée à la quantité de mitochondries par cellule. Il est maintenant prouvé que le contenu des cellules en mitochondries est un élément clé de l’homéostasie cellulaire, permettant de répondre à de larges variations en besoins énergétiques. Sa régulation nécessite l’expression coordonnée de plusieurs centaines de gènes nucléaires et mitochondriaux. Nous avons entrepris de développer, en collaboration avec le groupe de Claude Jacq (ENS, Paris), une approche génomique globale afin de caractériser les différents groupes de gènes impliqués dans les réponses transcriptionnelles lors de l’induction de la biogenèse mitochondriale. L’identification des voies de signalisation gouvernant cette biogenèse pourrait fournir des outils nouveaux pour le développement de notre projet. Néanmoins, les premières observations faites dans le laboratoire constituent une base solide permettant d’initier le premier volet de notre étude qui est d’améliorer la vitesse de croissance cellulaire. Nous disposons d’une souche dans laquelle l’expression de la sous-unité ∂ de la F1-F0-ATPsynthase mitochondriale peut être contrôlée par simple addition de doxycycline dans le milieu de culture (utilisation d’un promoteur sensible à la doxycycline). Une déplétion partielle en sous-unité ∂ conduit à la formation d’un certain nombre d’ATPsynthases dépourvues de cette sous-unité et ainsi rendues perméables aux protons. Dans ces conditions de faible découplage des oxydations phosphorylantes, nous avons pu observer une forte augmentation de la vitesse de la respiration maximale associée à un doublement du contenu en cytochromes et à un accroissement de la masse mitochondriale. Ceci permet une nette amélioration de la vitesse de multiplication des levures. Nous nous proposons d’utiliser ce système qui permet de bien maîtriser la cinétique d’induction de la biogenèse mitochondriale pour essayer de définir les conditions optimale de croissance. Pour cela, nous étudierons systématiquement les conséquences sur la croissance et sur l’équipement mitochondrial de différents degrés de découplage. Bien sûr, ce travail sera mené en utilisant les souches particulièrement résistantes à l’éthanol qui sont en voie de sélection dans le groupe du Professeur J.M. François. Enfin, les résultats de l’analyse globale de l’expression du génome, lors de l’induction de la biogenèse mitochondriale, pourraient conduire à l’identification de gènes-cibles permettant de définir une nouvelle stratégie de contrôle de la biogenèse de ces organites. Ces données seront prises en compte dans le processus général de sélection de la souche.



  1. L’état énergétique cellulaire et l’amélioration de la production d’éthanol

Afin d’optimiser l’efficacité fermentaire d’une levure, il convient tout d’abord de faire une analyse des flux métaboliques, de l’état énergétique et de la balance rédox, de décrire les mécanismes de régulation gouvernant la relation production d’éthanol / production de biomasse et aussi de caractériser l’effet inhibiteur de la fermentation alcoolique par l’éthanol.

Un des sous-produits majeurs de la fermentation est le glycérol. La balance entre production de glycérol et d’éthanol lors de la fermentation dépend de plusieurs facteurs dont l’un des principaux est l’état rédox des cellules. Plus le pool de NAD+ sera réduit, plus le flux de formation du glycérol aura tendance à augmenter. On peut essayer de modifier cet état et, en particulier, de générer des potentiels plus oxydés soit en agissant sur l’équipement enzymatique des différentes voies, soit en tentant d’imposer un état rédox favorable à la fermentation alcoolique au détriment de la voie glycérol. Ceci peut être la conséquence de l’introduction dans les cellules d’un système actif de réoxydation du NADH indépendant de la fermentation elle-même. Si l’impact de la manipulation de l’état rédox est théoriquement déterminant on peut aussi supposer qu’une augmentation de la consommation d’ATP (création de cycles futiles par exemple) ou une introduction d’un léger découplage favoriserait aussi le drainage du flux métabolique vers l’éthanol. Enfin, on peut aussi agir sur le flux de la glycolyse elle-même en modifiant l’équipement enzymatique et en diminuant ainsi les contraintes cinétiques de ce réseau métabolique. Ces pistes, théoriquement justifiées, devront être systématiquement explorées. Il conviendra cependant de mener une approche pas à pas : en effet, il pourrait apparaître des incompatibilités sérieuses dues aux différents objectifs que nous nous proposons (amélioration de la vitesse de multiplication des cellules, résistance à de fortes teneurs en éthanol, augmentation et orientation du flux fermentaire). Dans ce cas, nous rechercherons le meilleur compromis possible.


B) Base moléculaire et dynamique de l’ingénierie métabolique et physiologique de la levure performante pour la production de bioéthanol carburant
B.1. Analyse génomique de la dynamique d’adaptation de Saccharomyces cerevisiae à des fortes productions d’éthanol (Contribution M.Cot, L. Benbadis, S. Guillouet et Jean M François, INSA-UMR-CNRS 5504 Toulouse)

Nous avons mis au point un stratégie de fermentation alcoolique qui a conduit à 125 g/L d’éthanol (15,6 % v/v) en 48h (Alfenore et al., 2002). L’originalité de notre approche est l’étude du phénomène d’adaptation dynamique de la levure à des concentrations croissantes en éthanol alors que les travaux antérieurs se sont intéressés à l’effet ‘choc éthanol’. Notre objectif est de caractériser le mécanisme de tolérance des levures à l’éthanol et de rechercher une stratégie pertinente pour améliorer la résistance à la toxicité causée par l’éthanol et d’améliorer la performance de production de ce métabolite (productivité). Notre approche consiste à obtenir des informations quantitatives aux trois niveaux d’observations : macroscopique (concentrations, vitesses spécifiques…), microscopique (viabilité, morphologie) et moléculaire (profils d’expressions transcriptomiques, métabolites produits..). Nous rapportons les premiers résultats des profils d’expression globale des gènes de la levure au cours de son adaptation à sa propre production en éthanol lors d‘une fermentation en mode fed-batch, ainsi que les données d’analyse d’image prise en cours de procédé de fermentation.


Pour l’étude du transcriptome, nous avons produit des lames de levure sur un support spécialement conçu par la plateforme transcriptome-Biopuces du Génopole de Toulouse (les Dendrichips, [Trevisiol et al., 2003]) qui porte 6200 fragments PCR en duplica correspondant aux 6200 gènes de la levure S. cerevisiae. Nous avons effectué une étude d’expression globale au cours du temps de la croissance, en utilisant comme référentiel les échantillons de la phase I, qui correspondent au moment de la croissance maximale de la levure sur glucose, quand l’effet ‘inhibition par l’éthanol’ est absent. Les ARN messagers de ces échantillons ont été extraits et marqués avec le fluorochrome CY3 (vert)sont hybridés avec échantillons des phases II à VI (marquage au Cy5). Nous parlerons de gènes sous ou sur exprimés par rapport à cette référence. Les expériences sont répétées 3 fois afin d’appliquer un test de Student. Seuls sont jugés significativement différents les gènes dont la probabilité associée est inférieure à 5%. (Fig 1)




Figure1 : Changements d’expression des gènes au cours de la fermentation alcoolique de S. cerevisiae en mode fed-batch.
F
igure 2 
: Représentation des gènes sous-exprimés en fonction des classes fonctionnelles.
Nous montrons à la figure 2 que les gènes sous-exprimés appartiennent à la famille de la synthèse des protéines et aussi de celle des mécanismes de transcription et de traduction liés à la croissance cellulaire. En particulier, ce type de gènes s’enrichit avec l’avancement de la réaction. On note aussi la sous-expression importante (5 à 10 fois) de gènes codant des enzymes d’initiation de la synthèse des acides gras (MCT1) et de transport des acides gras dans les mitochondries
Nous avons aussi étudié la classe des gènes surexprimés (Figure 3)





Figure 3 : Représentation des gènes sur-exprimés des sous-classe métabolique de la grande famille ‘Métabolisme’
Dans cette figure, on s’aperçoit que les gènes sur-exprimés sont impliqués dans le métabolisme des stérols, ce qui indique un rôle de ces molécules dans la tolérance à l’éthanol. Plus intriguant est l’augmentation de gènes codant des transporteurs de différents ions (sulfate, K+, ammonium, A1BC transporteur) , suggérant que la cellule est face à une difficulté d’homéostasie et donc réagit en activant les transports des ions, considérant que ceux-ci ne fonctionnent pas bien, C’est sans doute un phénomène lié aussi à la modification de la fluidité membranaire.
En conclusion, et pour consolider ces données génomiques, nous avons entrepris une analyse quantitative de la composition de la levure (modification de sa formule CHNOS) et une analyse de la composition lipidique des membranes. De plus, nous allons vérifier que l’activité des enzymes, correspondant aux gènes dont l’expression a été sérieusement modifiée, est aussi affectée. Aussi, les analyses d’image qui nous donnent déjà des indications sur la viabilité des cellules, seront complétées par une analyse de la taille et de la morphologie et par un comptage des cicatrices de bourgeonnement et visualisation de la répartition de chitine par coloration au Calcofluor White. Enfin, à partir du nombre important de données acquises, il sera nécessaire de réconcilier les 3 niveaux d’observation (macroscopique, microscopique et moléculaire) afin de mieux comprendre le phénomène d’adaptation de la levure aux fortes concentrations en éthanol et de mettre le doigt sur les cibles les plus pertinentes pour améliorer la tolérance. Ce travail demandera le développement d’outils mathématiques originaux qui pourront avoir des répercussions importantes sur les stratégies visant à optimiser le procédé fermentaire.

B.2. Identification des gènes et réseaux de gènes et de leur rôle dans l’adaptation des levures à l’éthanol (Contribution S. Dequin, V. Ansanay Laboratoire de Microbiologie et Technologie des Fermentations, ENSAM-INRA-UMI Montpellier)
Ce projet, qui vise à identifier des gènes et réseaux de gènes et à préciser leur rôle dans l’adaptation des levures à l’éthanol, est mené par deux types d’approches. Une première approche est basée sur la recherche et la caractérisation de mutants d’insertion affectés dans la résistance à l’éthanol, l’autre sur l ‘étude de la réponse génique à l’éthanol par analyse transcriptomique.
1 - Identification de gènes impliqués dans la résistance de la levure à l’éthanol par l’étude de mutants d’insertion
Des banques d’insertion aléatoire de transposons ont été utilisées pour transformer une souche de levure. Les transformants ont été repiqués en microplaques de façon à obtenir une banque organisée de 15000 clones. Le criblage de 5000 clones a été réalisé, à partir d‘une réplique de cette banque, en fonction de leur sensibilité à croître sur milieu liquide en microplaques en présence de 7% d’éthanol (v/v). 74 clones présentant une sensibilité accrue à l’éthanol ont été isolés. Le phénotype des mutants a été précisé dans une gamme de concentration en éthanol variant de 0 à 10 % (v/v). A l’issue de ce test, 30 clones présentant un phénotype marqué ont été retenus. L’identification des gènes mutés est en cours.

2 - Etude de la réponse génique des levures à l’éthanol par analyse du transcriptome
L’objectif de cette approche est d’identifier des gènes qui sont spécifiquement exprimés en présence de fortes concentrations d’éthanol et donc susceptibles d’être impliqués dans l’adaptation de la levure en conditions de fermentation alcoolique. Nous avons dans un premier temps mis au point un modèle expérimental mimant les conditions œnologiques où la teneur en éthanol est seule variable. Ce modèle consiste à ajouter de manière progressive 5% (v/v) d’éthanol sur une durée totale de 15h, à une population de levures (dérivant d’une souche de levure œnologique) en phase stationnaire de croissance, alors que la production d’éthanol est faible (2%v/v). A la fin de l’ajout la concentration en éthanol est d’environ 8%, au lieu de 3% dans la fermentation témoin. Les profils d’expression de ces deux populations de levures ont alors été comparés par hybridation d’ADNc marqués à des microarrays d’ADN (lame de verre) où sont déposés l’ensemble des 6000 gènes de la levure. Une première analyse des résultats montre la surexpression d’un grand nombre de gènes codant pour des protéines de stress thermiques, pour des enzymes glycolytiques, pour des gènes impliqués dans la synthèse et la dégradation du tréhalose et du glycogène, ainsi que dans la régulation de l’activité de l’ATPase membranaire. Un certain nombre de ces gènes interviennent dans des mécanismes connus pour être impliqués dans la réponse au stress éthanol, ce qui valide notre approche. D’autres régulations, en revanche, n’avaient pas été mises en évidence. Ces résultats montrent en particulier qu’un important aspect de la réponse au stress éthanol est le contrôle fin du pool énergétique. L’analyse plus fine des données, en particulier en comparaison avec la réponse à un choc éthanol, est en cours.
B.3. Contribution des facteurs de transcription Msn2 et Msn4 au métabolisme du glucose dans la réponse générale aux stress (Contribution M. Jacquet, Institut de Génétique et Microbiologie UMR C8621)
Le laboratoire de Michel Jacquet (implanté à l’Institut de Génétique et Microbiologie UMR C8621, s’intéresse depuis de nombreuses années à la voie de signalisation Ras/AMPc/PKA et à son rôle physiologique dans la cellule S. cerevisiae. La protéine kinase AMPc dépendante (PKA) a un effet négatif important sur la résistance des cellules à de nombreux stress. Une partie de cet effet est relayée par les facteurs de transcriptions Msn2p et Msn4p. Ces facteurs de transcription sont activés par un grand nombre de variations environnementales (stress et carences nutritionnelles) en particulier les stress ethanol et thermiques. La phosphorylation de ces facteurs par la PKA exerce un contrôle négatif en les maintenant dans le cytoplasme (Görner et al, 1998) et en empêchant des phosphorylations par d’autres kinases (Garreau et al, 2000). L’activation de ces facteurs de transcription participe à la résistance des cellules aux stress (Martinez-Pastor et al,1996) et conduit dans certaines conditions à un arrêt du cycle cellulaire en G1, ce qui permet de postuler que Msn2p et Msn4p sont des éléments essentiels d’un “ checkpoint ” activé par les stress (Smith et al, 1998)).

La caractérisation des gènes dont l’expression dépend de Msn2p et Msn4p (régulon Msn2/4) en réponse à de stress variés, par une approche protéomique et par une approche transcriptome (Boy Marcotte et al 1998 & 1999, Gasch et al., 2000 ; Causton et al., 2001), a permis de dresser l’ inventaire complet de ce régulon. Celui-ci se caractérise par le grand nombre de gènes codant pour des enzymes du métabolisme du glucose. Pour un grand nombre de ces enzymes, il existe des isoenzymes et l’induction par Msn2/4 conduit à un changement d’expression d’isozymes. L'activation de Msn2p et Msn4p par les stress doit donc conduire à un changement de l'équipement enzymatique responsable du métabolisme glucose.

Nous nous intéressons aux conséquences de l’activation de Msn2p et Msn4p sur le métabolisme de la cellule, en particulier le métabolisme du glucose, Nous voulons, dans un premier temps, décrire ces changements puis comprendre en quoi ces modifications participent à l’adaptation des cellules aux stress. Nous comptons plus précisément examiner l’effet de la surexpression de la protéine Msn2p et de la délétion des gènes MSN2 et MSN4 sur les flux des métabolites dérivés du glucose et sur les bilans énergétiques.

Un premier travail a consisté à exprimer Msn2 à partir d’un promoteur fort (ADH1) et d’un plasmide multicopie dans deux souches de référence : d’une part la souche W303msn2msn4 qui est délétée pour le gènes MSN2 et MSN4 et d’autre part la souche 654, souche de référence du Laboratoire de Biotechnologies & Bioprocédés utilisée pour les études du métabolisme du glucose en fermenteur. Nous avons constaté que la surexpression du gène MSN2 ne permet pas une expression significative du gène cible HSP12 en absence de stress. La synthèse de tréhalose est dépendante de l’induction par Msn2/4 des gènes de biosynthèse du tréhalose. Nous avons montré par une approche de spectroscopie C13-RMN que la surexpression de MSN2 ne permet pas la synthèse de tréhalose en absence de choc thermique. Ces résultats son cohérents avec les données du transcriptome dans les conditions de surexpression de MSN2 et en absence de stress (Gash et al 2000). En effet, ils montrent que seuls 94 gènes sont induits parmi les 300 gènes normalement induits par Msn2 dans différents conditions de stress et le facteur d’induction et faible par rapport à celui observé dans les conditions de stress. Ces résultats sont aussi en accord avec des données récentes de notre laboratoire qui montrent que Msn2 doit être activé à plusieurs niveaux (localisation nucléaire, activité transactivatrice). Il faut donc une version de Msn2 active de façon constitutive pour exprimer le régulon Msn2 en absence de stress. Le travail est poursuivi dans ce sens.

Ce travail est effectué en collaboration avec le laboratoire de J.M. François à l’INSA de Toulouse. Les résultats de cette étude devraient nous permettre d’évaluer si les facteurs de transcription Msn2p et Msn4p influent le métabolisme du glucose et sont des cibles pertinentes à manipuler pour la construction de souches performantes dans la production de bioéthanol carburant.
Références

Boy-Marcotte, E., Lagniel, G., Perrot, M., Bussereau, F., Boudoscq, A., Jacquet, M., and Labarre, J. (1999). The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2/4 and Hsf1p regulons. Mol. Microbiol. 33, 274-283.

Boy-Marcotte, E., Perrot, M., Bussereau, F., Boucherie, H., and Jacquet, M. (1998). Msn2p and Msn4p control a large number of genes induced at the diauxic transition which are repressed by cyclic AMP in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 180, 1044-1052.

Causton, H. C., Ren, B., Koh, S. S., Harbison, C. T., Kanin, E., Jennings, E. G., Lee, T. I., True, H. L., Lander, E. S. and Young, R. A. (2001). Remodeling of yeast genome expression in response to environmental changes. Mol. Biol. Cell. 12, 323-327

Görner, W., Durchschlag, E., Martinez-Pastor, M. T., Estruch, F., Ammerer, G., Hamilton, B., Ruis, H., and Schüller, C. (1998). Nuclear localization of the C2H2 zinc finger protein Msn2p is regulated by stress and protein kinase A activity. Genes Dev. 12, 586-597.

Martinez-Pastor, M. T., Marchler, G., Schüller, C., Marchler-Bauer, A., Ruis, H., and Estruch, F. (1996). The Saccharomyces cerevisiae Zinc finger proteins Msn2p and Msn4p are required for transcriptional induction through the stress-response element (STRE). EMBO J. 15, 2227-2235.

Smith, A., Ward, M. P. and Garret, S. (1998). Yeast PKA represses Msn2/4p –dependent gene expression to regulate growth, stress response and glycogene accumulation. The Embo J. 17, 3556-3564
Volet 3 : «  Mise en œuvre de levures par des procédés performants pour la production d’éthanol bio-carburant et bio-procédés propres de mise en œuvre   » Coordinateur du projet : C. Jouve, UMR 5504 Laboratoire de Biotechnologie Bioprocédés Toulouse
Dans une première partie, à l’issue de cultures en mode fed-batch sur milieu synthétique en conditions de température (30°C), pH(4), aération et agitation parfaitement contrôlés, nous avons étudié l’influence sur le comportement dynamique de la levure Saccharomyces cerevisiae de trois stratégies d’apport vitaminiques, de cinq niveaux de température de fermentation et de deux conditions d’aération. Il s’avère que :


  1. l’apport séquencé de vitamines est un facteur déterminant de la tolérance de la levure aux très fortes concentration en éthanol et permet d’atteindre un titre en éthanol de 147 g/L (19°G.L.) en 45 heures ;

  2. les températures optimales, vis à vis du taux de croissance et de la vitesse spécifique de production d’éthanol, sont respectivement 30°C et 33°C, la viabilité cellulaire étant fortement affectée par une élévation de la température aux très fortes concentrations en éthanol ;

  3. l’aération permet d’augmenter la tolérance de la levure (viabilité, inhibition de la croissance et titre final en éthanol), diminuer la production de glycérol et accroître le rendement sucre-éthanol par comparaison avec des conditions de micro-aération.

L’ensemble de ces résultats argumentent de la pertinence de la configuration de bioréacteur continu biétagé avec recyclage cellulaire que nous développons pour intensifier la production d’éthanol : le premier étage est dédié à la croissance cellulaire avec une gestion optimisé des flux nutritionnels qui conditionne l’activité et la viabilité des levures en conditions de très fortes concentrations en éthanol. Le second étage est dédié à la production d’éthanol avec l’obtention de fortes concentrations en micro-organismes par couplage avec un module d’ultrafiltration. Le recyclage des micro-organismes vers le premier réacteur permet de maintenir l’activité et la viabilité des levures, dans ce second étage, en conditions extrêmes de produit. Le pilote est construit, de volume utile 7 litres, et il bénéficie aujourd’hui d’une métrologie importante et d’un environnement informatique permettant l’acquisition en temps réel des mesures des nombreux capteurs, leur traitement en ligne, la commande de pompes, la gestion des différents niveaux de sécurité. Une description détaillée du pilote, un schéma de l’installation et une photographie sont présentés en annexe de ce document.

Dans un premier temps, nous avons établi deux modèles cinétiques en conditions d’aération et de micro-aération qui correspondent respectivement aux modes de fonctionnement des deux étages du bioréacteur.

Avec des écarts théorie-expérience inférieures à 9%, ce modèle prend en compte :


  • de processus biologiques limitant de glucose et inhibiteurs de l’éthanol et de la biomasse,

  • la viabilité des micro-organismes,

  • l’effet des hautes concentrations de biomasse sur le volume total,

  • la répartition intracellulaire et extracellulaire de l’éthanol

  • la production de co-métabolites

Les valeurs des paramètres biologiques identifiés corroborant ceux mentionnés dans la littérature, le modèle s’exprime de la façon suivante :
µ=µmax*(S/(Ksx+S))*(1-(P/Pmx))n *(1-(Xt/Xm))

νp = νpmax *(S/(Ksp+S))*(1-(P/Pmp))m

νg= αμ+ε

qs= µ/Ys,xp/Ys,p + νg/Ys,g+ main



A l’issue de ces travaux, nous avons établi l’ensemble des équations de bilan matière permettant, avec les équations cinétiques, de simuler le fonctionnement du bioréacteur en régime permanent. En respectant les contraintes physiques et biologiques de fonctionnement que nous avons listées, les résultats numériques ont permis de dégager l’influence de la concentration en substrat dans l’alimentation et du taux de dilution hydraulique sur la concentration en éthanol en sortie du procédé, la productivité, les rendements. Il apparaît que l’optimisation de ce procédé peut être réalisée selon un critère de titre en éthanol ou de productivité : un point de fonctionnement optimal dans les conditions choisies (dont X bornée à 150 g/l) correspond à une productivité industrielle de 50.5 g/l.h, un rendement industriel de 0.44g/g et un titre en éthanol de 107g/l.


Les premiers essais expérimentaux ont été réalisés et ils ont permis de

  • caractériser hydrauliquement le bio-réacteur,

  • déterminer les flux transmembranaires,

  • tester les capteurs,

  • valider le système d’acquisition, le traitement des données et les sécurités

  • tester la robustesse des régulations

  • améliorer la technologie par l’implantation notamment d’un cyclone afin de favoriser la désorption du CO2 produit en grande quantité en cours de culture, phénomène qui pertube le fonctionnement des pompes et des capteurs.

Les expérimentations en cours ont pour objectif de valider le point de fonctionnement optimal défini à l’issue des travaux de simulation.
Ce programme est également soutenu par l’ADEME/AGRICE et une partie des travaux sur milieu industriel (non mentionnés ici) est réalisé en partenariat avec Amylum Tate&Lyle, producteur d’éthanol N°1 européen. En ce sens, nous adoptons une démarche de recherche générique empreinte de pragmatisme.



Description du pilote

L’installation est composée de l’association de deux fermenteurs B. Braun Biotech International CMF 100 Chemap de volume total 2 litres et de deux modules d’ultrafiltration. Chaque fermenteur est muni d’une unité de contrôle CBC5 et de sondes de mesures de la température, du pH, de l’agitation (pales Rushton) et de l’oxygène dissout. Ils sont munis d’une platine supérieure en acier inoxydable qui comporte différents orifices permettant l’introduction de base et d’antimousse par l’intermédiaire d’un septum et d’une sortie des gaz de fermentation. La température au sein des réacteurs est régulée grâce à la circulation d’eau dans une double enveloppe, l’eau étant issue d’un bain avec résistance chauffante. Deux clapets tarés permettent de limiter la sur-pression dans les réacteurs à 0.2 bar. La surface de chaque membrane d’ultrafiltration, CERAM Inside TAMI de type marguerite, à 8 canaux de diamètre hydraulique 6 mm, de longueur 120 cm, de diamètre extérieur 25mm, de seuil de coupure 150 kD, est de 0.20 m2. les modules de filtration peuvent fonctionner de manière alternative ou simultanées par l’intermédiaire de deux jeux de quatre vannes à membranes. Une vanne à membrane, située en sortie des modules de filtration, permet de fixer la pression aval, sa mesure ainsi que la mesure de la pression amont étant réalisés par des capteurs Rosemount. La circulation des fluides (alimentation du réacteur R1 en glucose, vitamines et milieu, circulation de R1 vers R2 et de R2 vers R1, soutirage du perméat) est réalisée par des pompes péristaltiques Masterflex. La circulation du milieu réactionnel dans la boucle de concentration est assurée par une pompe PCM à pistons rotatifs de débit maximal 5 m3.h-1. Deux débitmètres massiques à effet Coriolis Brooks Micromotion permettent de déterminer le débit total dans la boucle de concentration cellulaire et le débit total de perméat. Chaque fermenteur est muni d’un débitmètre massique gaz Instrutec. Le système de contrôle de la température du bio réacteur est complété par un échangeur multitubulaire à une seule passe côté calandre et côté tubes, placé en sortie des membranes ; le débit d’eau de refroidissement dans la calandre est régulé par l’intermédiaire d’une électro-vanne sur la mesure de température de sortie de l’échangeur du milieu de fermentation. Les gaz de fermentation sont connectés à un analyseur CPG, via un condenseur et un déshumidificateur .


Acquisition et commande :
En collaboration avec l’équipe d’Automatique des Bioréacteurs du LBB, l’environnement informatique a été réalisé et comprend :

  • l’acquisition en temps réel de l’ensemble des débits des pompes, des mesures des débitmètres massiques liquides et gaz, des capteurs de température, pH, agitation et oxygène dissous, des pressions amont et aval des modules d’ultrafiltration, des compositions des gaz de sortie des fermenteurs,

  • le système de commande des pompes d’alimentation en eau et de circulation de R1 vers R2 par des détecteurs de niveau dans les deux fermenteurs,

  • la gestion informatisée des systèmes de sécurité,

  • l’étalonnage des capteurs et des pompes,

  • le traitement de données en ligne (taux de croissance, substrat résiduel, vitesse de production de CO2, de consommation d’O2, de coefficient respiratoire…)


Volet 4 : «  Extraction du bioéthanol » Coordinateur du projet : C. Jouve, UMR 5504 Laboratoire de Biotechnologie Bioprocédés Toulouse
A) Développement de membranes peu perméables à l’éthanol. (C. Innocent, Institut Européen des Membranes.)

La modification de surface de matériaux échangeurs d’ions a été initié en prenant comme matériau de référence la membrane échangeuse de cations Nafion de Dupont. Des travaux antérieurs concernant la modification de surface de membrane par du polypyrrole ont permis de montrer les possibilités offertes par l’ajout de ce polymère conducteur sur la membrane.

Ce concept de modification par polymérisation d’un réseau polymère interpénétré dans le matériau fluoré de la Nafion a été poursuivi en étudiant sa formation en milieu solvant. Les solvants permettent en effet une large expansion du réseau fluoré.

Différentes procédures de synthèse du polymère dans la membrane ont été étudiées. Le choix du solvant constitue un élément important qui entraîne une modification de structure du polymère formé. Les caractéristiques de transport ionique de ces nouveaux matériaux modifiés ont été étudiées avec la mesure de la conductivité de la membrane ainsi que des caractéristiques de transport sous champ électrique de différents cations (Li+, H+, Na+, K+ et Cs+). La perméabilité aux solvants (méthanol et éthanol) a été étudiée. La présence de polymère interpénétré dans la membrane modifie les propriétés de transport ionique ainsi que la perméabilité aux solvants. Toutefois, la migration des ions sous champ électrique n’est que peu affectée par la modification.

Ce résultat est lié aux propriétés d’hydrophobie induites par le polypyrrole et sa « structuration » dans le polymère fluoré, matrice de la membrane.
B) Production d’éthanol à partir d’un fermenteur biologique (faisabilité et coût) (F. Charbit, Laboratoire de Procédés Propres et Environnement, Aix-en-Provence).

Les procédés membranaires peuvent opérer des séparations très délicates de suspensions de solides extrêmement divisés (micro-organismes) ou de vraies solutions. Ils paraissent donc très bien adaptés à l’accompagnement du procédé de fabrication du biocarburant éthanol. La conduite actuelle du procédé de production d’éthanol permet d’envisager d’ores et déjà l’usage de tels procédés pour deux applications bien précises : soit pour séparer les levures contenues dans le fermenteur afin de les recycler par exemple, soit pour traiter la solution produite afin de séparer et concentrer l’éthanol. Il sera nécessaire de connaître les contraintes exactes sur le produit final désiré pour mieux définir l’usage des séparations membranaires.

A ce stade de l’étude, il semble évident que l’étape de séparation et de concentration d’une solution, obtenue après séparation membranaire ou non, est nécessaire et tout à fait réalisable grâce à un procédé membranaire. La pervaporation semble la mieux adaptée à cette application puisqu’elle permet de séparer les mélanges de liquides grâce à des membranes hydrophiles ou hydrophobes suivant la nature du composé à séparer. Ce procédé permet de récupérer et de concentrer l'éthanol produit avec ou sans élimination de la biomasse quelles que soient les concentrations amont et aval (contrainte sur la qualité du produit final et visé). En effet, l’éthanol est contenu dans une solution complexe et se trouve en présence d’eau, de sucres, d’acides, de glycérol, de sels et éventuellement de levures selon les étapes précédemment définies. L’étude bibliographique montre que la séparation d’un mélange eau-éthanol a été abondamment étudiée, mais les co-produits présents dans l’effluent du bio-réacteur modifient considérablement le problème posé à cause notamment des effets de couplage non quantifiables ex nihilo. Il faut donc poursuivre la recherche sur les mélanges réellement produits par fermentation. Il sera alors possible grâce aux travaux de modélisation menés au laboratoire depuis plusieurs années de prévoir grâce à un nombre restreint d’expériences la séparation pour toute solution amont. De nombreux paramètres entrent en jeu lors de la séparation de l’éthanol : température, pression, composition et membrane. Nous venons de construire une unité qui fonctionne suivant le schéma classique (cf. Figure) et permet de tester des membranes organiques de compositions différentes mais aussi des membranes céramiques récentes. En effet, les membranes céramiques de géométrie tubulaire présentent plusieurs avantages (i) la turbulence y est parfaitement contrôlée, (ii) pré-traitement fin non nécessaire et donc possibilité de récupérer l'alcool à partir d'un mélange contenant la biomasse, (iii) pas de gonflement de la membrane (iv) et permettent d'obtenir des flux de perméat plus intéressants.

Figure 1 : Schéma du pilote de pervaporation


Lorsque la membrane sera choisie, il s’agira d'étudier l'effet des autres variables opératoires en termes de sélectivité et de flux de perméat, de modéliser la séparation pour prédire le comportement de la membrane en fonction de la solution à traiter puis d’extrapoler sa surface pour obtenir la production désirée. Une étude économique sera alors réalisée en comparant diverses solutions pour ce procédé qui s’appuie sur une matière première disponible à proximité, abondante, renouvelable et qui est peu polluant.


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