FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.9 TEKRARLI DOZ (28 GÜNLÜK) TOKSİSİTESİ (DERİ YOLUYLA) YÖNTEM
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.10 MUTAJENİTE IN VITRO MEMELİ KROMOZOMAL BOZUKLUK TESTİ YÖNTEM
VERİLER Veriler her bir test grubu, testin başlangıcındaki hayvan sayısını ve her bir doku bozukluğu türüne ait hayvan sayısını gösterecek şekilde bir tablo halinde özetlenmelidir. Gözlenen tüm sonuçlar uygun bir istatistiksel yöntemle değerlendirilmelidir. Bilinen herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılabilir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
maruz kalma düzeneğinin tanımı tasarımı, tipi, boyutları, hava kaynağı, aeresol üretme sistemi, havalandırma yöntemi ve bu düzenek kullanıldığında hayvanların test odacığının içindeki barınma yöntemini kapsamalıdır. Sıcaklık, nem, aeresol konsantrasyonu ve partikül büyüklüğü dağılımı ölçüm ekipmanı tanımlanmalıdır. Maruz kalma verileri: Tablo haline getirilmeli ve ortalama değerler, değişkenlik ölçümü (örneğin, standard sapma) ile birlikte sunulmalıdır, mümkünse, aşağıdakileri içerir:
ç) taşıyıcının yapısı, eğer kullanıldıysa;
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.9 TEKRARLI DOZ (28 GÜNLÜK) TOKSİSİTESİ (DERİ YOLUYLA)
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (A).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Yok.
Test maddesi, her gün çeşitli gruplardaki deney hayvanlarının derilerine, grup başına bir doz kullanılarak 28 gün boyunca uygulanır. Uygulama süresince hayvanlar toksisite belirtilerine karşı her gün gözlemlenir. Test sırasında ölen hayvanlarla deney sonunda hayatta kalan deney hayvanlarına otopsi yapılır.
Yok.
Test hayvanları testten en az beş gün öncesinden deneysel barınma ve beslenme koşullarında tutulurlar. Test öncesinde sağlıklı, genç hayvanlar kontrol ve uygulama gruplarına rasgele ayrılırlar. Teste başlamadan kısa bir süre öncesinde kürk kırpılarak test hayvanının gövdesinin sırt bölgesinden uzaklaştırılmalıdır. Traş işlemi uygulanabilir ama bu testten yaklaşık 24 saat önce uygulanmalıdır. Haftalık aralıklarla tüylerin traş edilmesinin veya kırpılmasının tekrar edilmesi gereklidir. Kürk kırpılırken veya traş edilirken, deriye zarar vermekten kaçınılmalıdır. Vücut yüzeyinin % 10’undan az olmayacak bir alan test maddesinin uygulanması için temizlenir. Hayvanın ağırlığı temizlenmesi gereken alana ve kaplanması gereken boyutlara karar verilirken dikkate alınmalıdır. Eğer uygunsa toz haline getirilebilen katı maddeler test edilirken, test maddesi cilde iyi temas etmesi için yeterli miktarda suyla veya gerekli durumlarda uygun bir taşıyıcıyla ıslatılmalıdır. Sıvı haldeki test maddeleri seyreltilmemiş halde kullanılmalıdır. Haftada beş-yedi gün arası günlük uygulama yapılır.
Yetişkin sıçan, tavşan veya kobay kullanılabilir. Diğer türler de kullanılabilir ancak kullanımları gerekçelendirilmelidir. Deneyin başında, hayvanlardaki ağırlık değişim aralığı her iki cinsiyet için de, uygun ortalama değerin + % 20’sini geçmemelidir.
Her bir doz için sağlıklı bir cilde sahip en az 10 hayvan (5 dişi ve 5 erkek) kullanılmalıdır. Dişilerin, hiç doğum yapmamış olmaları ve hamile olmamaları gerekir. Eğer arada da hayvan öldürülmesi planlanıyorsa, gruplardaki hayvan sayısı, çalışma tamamlanmadan öldürülmesi planlanan hayvan sayısı kadar artırılmalıdır. Ayrıca, 10 hayvandan oluşan bir ikincil test grubu (cinsiyet başına beş hayvan) 28 gün boyunca yüksek doz düzeyine maruz bırakılabilir ve uygulama sonrasındaki 14 gün içinde toksik etki tersinirlikleri, kalıcılıkları veya gecikmiş etkileri açısından gözlemlenmelidirler. 10 kontrol hayvanından oluşan bir ikincil test grubu (cinsiyet başına 5 hayvan) ayrıca kullanılır.
Taşıyıcı kullanıldıysa, kontrol veya taşıyıcı kontrol grubuna ait en az üç doz düzeyi kullanılmalıdır. Maruz kalma süresi günde en az altı saat olmalıdır. Test maddesinin uygulanması her gün aynı saatte yapılmalıdır ve hayvan vücut ağırlığına dayanarak sabit doz seviyeleri elde etmek için uygulanan maddenin miktarı, aralıklarla (haftada ya da iki haftada bir) ayarlanmalıdır. Test maddesiyle muamele edilenler dışında, kontrol grubundaki hayvanlar test grubundakilerle eşit şekilde tutulmalıdırlar. Dozun uygulanmasını kolaylaştırmak için taşıyıcı kullanılan durumlarda, taşıyıcı kontrol grubuna da uygulama grubuyla aynı şekilde doz uygulanmalıdır ve en yüksek doz grubu ne kadar aldıysa, aynı miktarı almalıdır. En yüksek doz toksik etkilerle sonuçlanmalı ancak çok az ölüm olmalı ya da hiç olmamalıdır. En düşük doz herhangi bir toksisite meydana getirmemelidir. İnsan maruz kalımına dair kullanılabilir bir tahmininin olduğu durumlarda, en düşük değer bu değeri geçmelidir. İdeal olarak ara doz en az gözlenebilir toksik etki meydana getirmelidir. Eğer birden fazla ara doz kullanılmışsa doz seviyelerine göre kademeli olarak toksik etki oluşturacak şekilde yerleştirilmelidir. Kontrollerdeki düşük ve ara gruplarda sonuçların anlamlı olarak değerlendirilmesi için ölüm oluşma sıklığının düşük olması gerekir. Eğer test maddesinin uygulanması ciddi cilt tahrişine neden oluyorsa, konsantrasyonlar düşürülmelidir. Bu durum, yüksek dozdaki diğer toksik etkilerin azalmasıyla veya yok olmasıyla sonuçlanabilir. Ayrıca, cilt çok kötü şekilde hasar görmüşse çalışmaya son verilmesi ve daha düşük konsantrasyonlu yeni bir çalışma yürütülmesine ihtiyaç duyulabilir.
1000 mg/kg doz seviyeli veya olası insan maruz kalmasıyla ilgili daha yüksek doz seviyeli bir ön çalışmada hiçbir toksik etki gözlenmiyorsa, ilave testlerin üzerinde düşünülmesine gerek yoktur.
Deney hayvanları, toksisite belirtileri için günlük olarak gözlenmelidir. Toksisite belirtilerinin ortaya çıktığı ve kaybolduğu zamanlar ve ölüm zamanları kaydedilmelidir.
Hayvanlar ayrı ayrı kafeslere konmalıdırlar. Hayvanlara test maddesiyle haftanın her günü, 28 gün boyunca uygulanır. Herhangi bir ikincil test grubunda devam eden gözlemler için programlanan hayvanlar, ilave bir 14 gün daha uygulama olmadan tutulmalı, toksik etkilerin düzelip düzelmediği belirlenmelidir. Maruz kalma süresi günde en az altı saat olmalıdır. Test maddesi, toplam vücut yüzey alanının %10’u kadar bir alan üzerine tek tip uygulanır. Oldukça toksik maddelerle kaplanan yüzey alanı daha az olabilir fakat mümkün olduğunda geniş bir alan ince ve tek tip bir katman halinde kaplanmalıdır. Test maddesi, maruziyet süresi boyunca tahriş etmeyen bir gazlı bezle cilde temas ettirilmelidir. Test yapılacak alan ayrıca gazlı bezi muhafaza etmek için uygun bir şekilde tekrar kaplanmalıdır ve hayvanların test maddesini yememeleri sağlanmalıdır. Test maddesinin yenmesini engellemek için uygun tasmalar kullanılabilir ancak hayvanların tamamen hareketsiz olmaları tavsiye edilen bir yöntem değildir. Alternatif olarak koruyuculu tasmalar kullanılabilir. Maruz kalma süresinin sonunda, yapılabiliyorsa suyla veya uygun başka temizleme yöntemleriyle kalan test maddesi ciltten uzaklaştırılmalıdır. Tüm hayvanlar günlük olarak gözlenmeli ve başlangıç zamanını da içeren toksisite belirtileri, dereceleri ve süreleri kaydedilmelidir. Gözlemler cilt ve tüylerdeki, gözlerdeki, mukoz (sümüksü) membranlardaki, solunum, dolaşım, otonom ve merkezi sinir sistemindeki değişikliklerle somatomotor aktivite ve davranışlarındaki değişikliklerini kapsamalıdır.Hayvanların ağırlıklarının ölçümleri haftalık olarak yapılmalıdır. Ayrıca gıda tüketiminin de haftalık olarak ölçülmesi tavsiye edilir. Hayvanların birbirlerini yemesi, dokuların otolizi veya yanlış yerleştirme gibi nedenlerle kaybedilmediklerinin ispat edilmesi için düzenli olarak gözlenmesi gereklidir. Çalışma süresi sonunda ikincil testi bulunmayan uygulama grubundaki sağ kalan tüm hayvanlara otopsi yapılır. Ölmek üzere olan, acı ve ağrı çeken hayvanlar farkına varıldığında uzaklaştırılmalı, insanca öldürülmeli ve hayvanlara otopsi yapılmalıdır. Aşağıdaki incelemeler kontrol grupları da dâhil olmak üzere tüm hayvanlara testin sonunda uygulanır: (i) hematoloji, hematokrit hemoglobin derişimi, eritrosit sayısı, toplam ve türevsel lökosit sayısı ve pıhtılaşma potansiyelinin ölçümü dahil olmalıdır; (ii) klinik kan biyokimyası karaciğer ve böbrek fonksiyonlarından en az birini içine alır: serum alanin aminotransferaz (geçmişte glutamik piruvik transaminaz olarak bilinir), serum aspartat aminotransferaz (geçmişte glutamik okzaloasetik transaminaz olarak bilinir), üre azotu, albumin, kanda kreatinin, toplam bilirubin ve toplam serum protein ölçümleri; Yeterli toksikolojik değerlendirmeler için gerekli olabilecek diğer belirlemelere kalsiyum, fosfor, klorür, sodyum, potasyum, lipitlerin analizi, açlık glikoz analizi, hormonlar, asit/baz dengesi, methemoglobin ve kolinesteraz aktivitesi dahildir. Gerekli yerlerde gözlenen toksik etkilerin araştırmasını genişletmek için ilave klinik biyokimya uygulamaları yapılabilir.
Çalışmadaki bütün hayvanlara kapsamlı otopsi yapılmalıdır. En az karaciğer, böbrekler, adrenaller, akciğerler ve testis parçalara ayrıldıktan sonra kurumasından olabildiğince kaçınılarak ıslak ağırlıkları tartılmalıdır. Organlar ve dokular (soluk borusu, karaciğer, böbrekler, dalak, testis, adrenaller, kalp ve büyük doku bozukluğu (lezyonlar) olan herhangi bir organ veya büyüklükteki değişiklikler) ileride olası histopatolojik inceleme için uygun bir ortamda muhafaza edilmelidir.
Yüksek doz grubunda ve kontrol grubunda, organ ve dokularda histopatolojik incelemeler yapılmalıdır. En yüksek dozdaki test maddesinin zarar verdiği organlar, daha düşük dozların verildiği gruplarda incelenmelidir. Herhangi bir ikincil test grubundaki hayvanlar, diğer muamele gruplarında etki gösterdiği teşhis edilen bu organ ve dokulara özel önem gösterilerek histolojik olarak incelenmelidir
Veriler her bir test grubu, testin başlangıcındaki hayvan sayısını ve her bir doku bozukluğu türüne ait hayvan sayısını gösterecek şekilde bir tablo halinde özetlenmelidir. Gözlenen tüm sonuçlar uygun bir istatistiksel yöntemle değerlendirilmelidir. Bilinen herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılabilir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.10 MUTAJENİTE IN VITRO MEMELİ KROMOZOMAL BOZUKLUK TESTİ
Bu yöntem OECD TG 473, In Vitro Memeli Kromozom Bozukluğu Testi (1997)’nin tekrarıdır.
In vitro kromozomal bozukluk testinin amacı, kültürlenmiş memeli hücrelerinde yapısal kromozom bozukluğu (chromosomal aberration) meydana getiren ajanları belirlemektir (1)(2)(3). Yapısal bozukluklar kromozom veya kromatit olarak iki tip olabilir. Kimyasal mutajenlerin çoğunun neden olduğu bozukluklar kromatit tiptekidir fakat ayrıca kromozom tipte bozukluklar da meydana gelir. Poliploidideki artış kimyasalın sayısal bozuklukları harekete geçirme potansiyeline sahip olduğuna işaret eder. Yine de bu yöntem sayısal bozuklukların ölçülmesi için tayin edilmemiştir ve düzenli olarak bu amaç için kullanılmamaktadır. Kromozom mutasyonları ve bunlara bağlı olaylar, insandaki pek çok genetik hastalığın nedenidir ve somatik hücrelerin onkogenlerinde (kanserojen genlerinde) ve tümör baskılayıcı genlerinde değişikliklere neden olan kromozom değişmeleri (mutasyonları) ve ilgili olaylar, insanda ve deney hayvanlarında, kanserin harekete geçmesinde rol oynadığına dair kuvvetli kanıtlar vardır. In vitro kromozomal bozukluk testi, yerleşik hücre dizisi kültürlerine, hücre suşlarına veya birincil hücre kültürlerine uygulanabilir. Kullanılan hücreler, kültürdeki büyüme kabiliyetlerine, karyotiplerinin kararlılıklarına, kromozom sayısına, kromozom çeşitliliğine, kromozom bozukluklarının kendiliğinden olma sıklığına bağlı olarak seçilirler. İn vitro yürütülen testler genellikle, dışarıdan kaynaklı bir metabolik aktivasyon kaynağı kullanımını gerektirir. Bu metabolik aktivasyon sistemi, memeli in vivo koşullarına tamamen benzemez. Özgün mutajeniteyi (genlerde değişimlerin meydana gelmesini) yansıtmayan veya pH, ozmolalite değişiklerinden ya da yüksek seviyede hücre toksisitesinden (sitotoksisite) kaynaklanan pozitif sonuçlar yaratacak koşullardan kaçınılmasına dikkat edilmelidir (4)(5). Test, olası memeli mutajenleri ve kanserojenleri taramak için kullanılır. Bu testte pozitif sonuç veren bileşikler memelilerde kansere neden olan maddelerdir, ancak bu test ve kanserojenik maddeler arasında tam bir ilişki bulunmamaktadır. İlişki kimyasal sınıfa bağlıdır ve bu testle belirlenemeyen kanserojenik maddelerin olduğuna dair giderek artan kanıtlar mevcuttur, çünkü bu kanserojenik maddeler doğrudan DNA hasarı dışında bir mekanizma sergilerler. Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (A).
Kromatit-tip bozukluk: Yapısal kromozom hasarı tekli kromatit kırılması veya kromatitler arası kırılma ve birleşme olarak ifade edilir. Kromozom-tipi bozukluk: Yapısal kromozom hasarı, özdeş yerlerdeki her iki kromatitin kırılması veya kırılıp birleşmesi olarak ifade edilir. Endoredublikasyon: DNA replikasyonunun S fazından sonraki bir işlemdir, çekirdek mitoza gitmez fakat başka bir S fazı süreci başlatır. Sonuç, 4, 8, 16, . ..kromatitli kromozomlardır. Boşluk (gap): bir kromatitin genişliğinden daha küçük genişlikte ve minimum yanlış kromatit dizimli akromatik bir doku bozukluğudur. Mitotik indeks: metafazdaki hücre sayısının, hücre populasyonunda gözlenen toplam hücre sayısıyla bölümünün oranıdır; o populasyondaki çoğalma derecesinin göstergesidir. Sayısal bozukluk: kullanılan hücrelerin normal kromozom sayısındaki değişiklikler. Poliploidi: haploid kromozom sayısının (n) diploid sayı haricindeki bir sayıyla çarpımı (örneğin, 3n, 4n.....). Yapısal bozukluk: Kromozom yapısında, hücre bölünmesinin metafaz aşamasındamikroskobik incelemeyle saptanabilen değişikliktir; silinmeler ve parçalanmalar ara ve iç değişiklikler olarak gözlenir.
Hücre kültürleri test maddesine hem metabolik aktivasyonla hem de metabolik aktivasyon olmadan maruz kalır. Hücre kültürlerinin test maddesine maruz kalmasından sonra daha önceden belirlenen aralıklarda, kültürler metafaz-durdurucu maddelerle muamele edilir (örneğin, Kolsemid veya kolşisin), toplanır, boyanır ve metafaz hücreleri kromozom bozukluklarının varlığı için mikroskobik olarak incelenir.
Çeşitli hücre dizileri, suşları veya insan hücresi de dahil birincil hücre kültürleri kullanılabilir. (örneğin, Çin hamster fibroblastları, insan veya diğer memelilerin periferal (çevresel) kan lenfositleri)
Kültürlerin elde edilmesinde uygun kültür ortamı ve inkübasyon koşulları (kültür kapları, CO2 derişimi, sıcaklık ve nem) kullanılmalıdır. Yerleşik hücre dizileri ve suşları, model kromozom sayısında kararlılıkları ve mikoplazma kirlenmesinin olup olmaması açısından rutin olarak kontrol edilmeli ve kirlilik varsa kullanılmamalıdırlar. Hücreler için normal hücre döngüsü zamanı ve kültür koşulları bilinmelidir.
Sabit hücre dizileri ve suşları: Hücreler stok kültürlerden oluşturulurlar, kültürlerin toplanmasından önce akıcı olmayan duruma ulaşmadığı yoğunluktaki kültür ortamına ekilir ve 37 °C’de inkübe edilirler. Lenfositler: bir pıhtılaşmayı önleyici (örneğin, Heparin) muamele edilen tam kan veya sağlıklı numunelerden elde edilen ayrılmış lenfositler, mitojen (örneğin, Fitohemogglutinin) içeren kültür ortamına ilave edilirler ve 37°C’de inkübe edilirler.
Hücreler, test maddesine metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda maruz bırakılmalıdırlar. En yaygın kullanılan sistem, Aroklor 1254 (6)(7)(8)(9) veya fenobarbitonla ß–naftoflavon karışımı (10)(11)(12) gibi enzim aktive eden ajanlarla muamele edilen kemirgenlerin karaciğerlerinden elde edilen kofaktör-destekli post-mitokondriyal fraksiyondur (S9). Son-mitokondriyal kısım genellikle sonuç test ortamının %1–10 v/v, derişim aralığında kullanılır. Metabolik aktivasyon sisteminin koşulları test edilen kimyasalın sınıfına bağlı olabilir. Bazı durumlarda, son-mitokondriyal kısmına ait birden fazla derişim kullanılması uygun olabilir. Özgün aktivitegösteren enzimleri ifade eden genetik olarak tasarlanmış hücre dizileri dahil bir dizi gelişme içsel olaylardan kaynaklanan aktivasyon için potansiyel sağlayabilir. Kullanılan hücre dizilerinin seçimi (test maddesinin metabolizmasının sitokrom P450 benzer enzimle ilgisi gibi) bilimsel olarak gerekçelendirilmelidir
Hücrelerin muamele edilmelerinden önce uygunsa, katı test maddesi uygun çözücüler veya taşıyıcılar içinde çözünmeli veya süspande edilmelidir. Sıvı test maddeleri muameleden önce test sistemine doğrudan eklenebilirler ve/veya seyreltilebilirler. Kararlılığıyla ilgili veriler saklanmasının kabul edilebilirliğini göstermedikçe test maddesinin taze hazırlanmış olanları uygulanmalıdır.
Çözücü/taşıyıcı, test maddesiyle kimyasal reaksiyona girmemeli ve hücrelerin sağ kalımlarıyla ve S9 aktivitesiyle uyumlu olmalıdır. Çok iyi bilinen çözücüler/taşıyıcılar dışındakiler kullanılırsa, muhteviyatları uyumlu olduklarını gösteren verilerle desteklenmelidir. Mümkün olan yerlerde, sulu çözelti/taşıyıcının kullanılması ilk önce göz önünde bulundurulması tavsiye edilir. Suda kararsız olan maddeler test edilirken, kullanılan organik çözeltilerde su olmamalıdır. Su, moleküler bir elek ilave edilerek uzaklaştırılabilir.
En yüksek derişimi belirlerken, dikkate alınması gereken kriterler arasında sitotoksisite, test sisteminde çözünürlük, pH değişiklikleri ve ozmolalite vardır. Sitotoksisite, hücre kültür flaskını kaplama derecesi gibi, canlı hücre sayısı veya mitotik indeks gibi hücre bütünlüğünün ve büyümesin uygun göstergeleri kullanılarak, asıl deneyde metabolik aktivasyonun hem varlığında hem de yokluğunda belirlenmelidir. Sitotoksisite ve çözünürlüğün bir ön deneyde belirlenmesi daha uygun olabilir. Analiz edilebilen en az üç derişim kullanılmalıdır. Sitotoksisite meydana gelen yerlerde, bu derişimler, maksimum toksisiteden, minimum toksisiteye ya da hiçbir toksik etki yaratmayan bir aralığa dahil olmalıdırlar, bu da genellikle derişimlerin 2 ve 10 arasındakinden daha fazla olmayan bir faktörle ayrılmaları gerektiği anlamına gelir. Toplama zamanında, en yüksek konsantrasyon hücre sayımının veya mitotik indeksin akıcı olmama (confluency) derecesinde önemli bir düşüşe neden olmalıdır (hepsi %50’den büyüktür). Mitotik indeks sitotoksik/sitostatik etkilerin tek dolaylı ölçüm ifadesidir ve muamele sonraki süreye bağlıdır. Ne var ki mitotik indeks, diğer toksisite ölçümlerinin kullanışsız ve uygulanamaz olabildiği süspansiyon kültürler için kabul edilebilirdir. Ortalama Üreme Zamanı (AGT) gibi hücre döngüsü kinetiğiyle ilgili bilgiler, yardımcı bilgi olarak kullanılabilir. AGT, buna rağmen, her zaman gecikmiş alt popülasyonların varlığını açıklamayan genel bir ortalamadır ve hatta ortalama üretim zamanındaki hafif artışlar, bozuklukların verimlilik süresindeki önemli gecikmelerle ilişkilendirilebilir. Nispeten sitotoksik olmayan maddeler için, maksimum test derişimi 5 µl/ml, 5 mg/ml veya 0.01 M olmalıdır. Çözünemedikleri derişimden daha düşük derişimlerde toksik etki göstermeyen, nispeten çözünemeyen maddeler için, kullanılan en yüksek doz, uygulama süresinin sonundaki nihai kültür ortamında çözünebilirlik sınırının üzerinde bir konsantrasyon olmalıdır. Bazı durumlarda (örneğin, toksisitenin sadece en düşük çözülemez derişimden daha yüksekte görüldüğü zaman) görülebilir çökelme meydana getiren birden fazla derişimin test edilmesi tavsiye edilir. Uygulamanın başındaki ve sonundaki çözünürlüğün tayin edilmesi uygun olabilir, çünkü çözünürlük test sistemindeki maruz kalma boyunca hücrelerin, S9’un, serum, vs’nin varlığına bağlı olarak değişebilir. Çözünmezlik çıplak gözle belirlenir. Çökelti skorlamayı etkilememelidir.
Eş zamanlı pozitif ve negatif (çözücü veya taşıyıcı) kontroller, metabolik aktivasyonun hem varlığında hem de yokluğunda her bir deneyde yer almalıdır. Metabolik aktivasyon kullanıldığında, pozitif kontrol kimyasalı, mutajenik cevap vermek için aktivasyona ihtiyaç duymalıdır. Pozitif kontroller, test sisteminin güvenilirliğini gösteren ve bazal seviyenin üzerinde tekrarlanabilir ve tayin edilebilir artışa neden olması beklenenmaruz kalma seviyelerinde, klastojen olduğu bilinen maddeler olmalıdır. Dozlar etkilerin açıkça görülebileceği şekilde seçilebilir fakat işaretli lamların okuyucu tarafından hemen anlaşılabilmesini sağlamaz. Pozitif kontrol madde örnekleri:
içerir.
Muamele ortamındaki çözücü veya taşıyıcıyı tek başına içeren ve kültür ile aynı şekilde muamele edilmiş negatif kontroller, her toplama zamanında teste dahil edilmelidir. Ayrıca, geçmişe yönelik kontrol verileri sağlığa zararlı veya mutajenik etkilerin seçilen çözücüyle meydana geldiğini göstermediği sürece muamele edilmemiş kontroller de kullanılmalıdır.
Çoğalan hücreler test maddesiyle metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda muamele edilirler. Lenfositlerin muamele edilmesi, mitojenik uyarılmasından yaklaşık 48 saat sonra başlatılmalıdır. İki seri kültür, normalde her derişimde kullanılmalıdır ve negatif/çözücü kontrol kültürleri için kesinlikle tavsiye edilirler. Daha önceki verilere dayanılarak, (iki seri) kültürler arasında çok az değişimin gösterilebildiği durumlarda (13)(14), bu durum her bir derişim için tekli kültür kullanımı kabul edilebilir. Gaz veya uçucu maddeler, kapalı kültür kaplarının içinde olduğu gibi uygun yöntemlerle test edilmelidirler (15)(16).
İlk deneyde hücreler metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda, 3-6 saat arasında test maddesine maruz kalırlar ve muamele edildikten sonra yaklaşık 1,5 normal hücre döngüsü uzunluğuna eşit bir sürede örneklenirler. (12). Eğer bu protokol metabolik aktivasyonun hem varlığında hem de yokluğunda negatif sonuçlar verirse, aktivasyon olmadan ve yaklaşık 1,5 normal hücre döngüsü uzunluğunda bir süreye eşit sürede örnekleyinceye kadar, sürekli muamele edilerek ilave bir deney yapılmalıdır. Belli kimyasallar 1,5 hücre döngüsü uzunluğundan daha uzun bir uygulama/örnekleme süresin daha kolayca belirlenebilir. Metabolik aktivasyonlu negatif sonuçların vaka vaka teyit edilmesi gerekir. Negatif sonuçların teyit edilmesine gerek duyulmayan böyle durumlarda, gerekçe sağlanmalıdır.
Genellikle toplamadan bir-üç saat önce hücre kültürleri, kolsemid veya kolşisinle muamele edilirler. Her bir hücre kültürü toplanır ve kromozomların hazırlaması için ayrı ayrı işleme tabi tutulur. Kromozomların hazırlaması, hücrelerin hipotonik muameleden geçmesi, sabitlenmesi ve boyanması aşamalarını içerir.
Negatif ve pozitif kontrollere ait olanlar da dahil bütün lamlar, mikroskobik analizden önce bağımsız olarak kodlanmalıdır. Sabitleme işlemi genellikle metafaz hücrelerinin kırılarak kromozom kaybetmesiyle sonuçlansa da sayılan hücreler bütün hücre tipleri için ± 2 model sayısına eşit sentromer içermelidir. Mümkünse, derişim ve kontrol başına çiftliler arasında eşit olarak bölünmüş en az 200 düzgün dağılmış metafaz sayılmalıdır. Bu sayı daha yüksek sayıda bozukluk gözlendiğinde düşürülebilir. Her ne kadar bu testin amacı yapısal kromozom bozukluklarını belirlemek olsa da, poliploidi ve endoreduplikasyon görüldüğünde kaydedilmeleri önemlidir.
|