FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- TABLO I: OKÜLER DOKU BOZUKLUKLARININ (LEZYONLARIN) DERECELENDİRİLMESİ Kornea
- B.6 CİLT HASSASİYETİ YÖNTEM
VERİLER
Oküler tahriş skorları lezyonların doğası ve ciddiyetiyle, tersinir olup olmamalarıyla birlikte değerlendirilmelidir. Skorlar ayrı ayrı, materyalin tahriş edici özelliğiyle ilgili olarak mutlak bir standardı ifade etmezler; bunun yanında test materyalinin diğer özellikleri de ayrıca değerlendirilir. Bunun yerine, her bir skor, çalışmadan elde edilen diğer tüm gözlemlerle beraber değerlendirilmesi gereken referans değerleri olarak sunulmalıdır.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Test maddesi:
Taşıyıcı:
Test hayvanları:
Sonuçlar:
Sonuçların tartışılması.
Laboratuar hayvanlarındaki gözde tahriş çalışmalarının insana uyarlanması sadece sınırlı bir dereceye kadar geçerlidir. Pek çok durumda albino tavşanlar oküler aşındırıcı ve tahriş edicilere insanlardan daha hassastırlar. Veriler yorumlanırken, ikincil bir enfeksiyona bağlı tahrişin dahil edilmemesine dikkat edilmelidir.
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410- 429. (2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164. (3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177. (4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. InVitro, 2, 19 - 26. (5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 - 231. (6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483.524. (6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion. (7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion. (8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). (9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ ehs/Class/HCL6.htm). (10) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm). TABLO I: OKÜLER DOKU BOZUKLUKLARININ (LEZYONLARIN) DERECELENDİRİLMESİ Kornea
İris
Konjonktiva Kızarıklık (kornea ve iris hariç, palpebral ve bulbar konjonktivaya dair);
Ek-I Gözde Tahriş ve Aşınma için Sıralı Test Uygulama Stratejisi Genel açıklamalar Gerek güvenilir bilim ve gerekse hayvan refahı açısından, hayvanların gereksiz kullanımından kaçınmak ve hayvanlarda ciddi tepkiler meydana getiren testleri azaltmak önemlidir. Bir maddenin potansiyel olarak oküler aşındırma/tahriş etme potansiyeline ilişkin tüm bilgiler in vivo testler üzerine düşünülmeden önce değerlendirilmelidir. Bir maddenin dermal aşınma veya tahriş oluşturma potansiyelini sınıflandırmak için önceden elde edilmiş yeterli bilgi olabilir ve test hayvanları üzerinde deney yapılmasına gerek kalmayabilir. Bu yüzden, delilin ispat kuvveti analizi ve sıralı test uygulama stratejisi in vivo testlere olan ihtiyacı, özellikle de madde ciddi tepkimeler meydana getirecek gibiyse, en aza indirecektir. Maddenin gözü tahriş etme/aşındırma potansiyeli olup olmadığı hakkında karar vermek için mevcut bilgiler değerlendirilirken, in vivo göz çalışmaları haricinde ilave çalışmalar yürütülüp yürütülmeyeceğini belirlemek için delillerin ispat kuvveti analizi kullanılması tavsiye edilir. İlave çalışmaların gerekli olduğu durumlarda, ilgili verilerin oluşturulması için sıralı test uygulama stratejisinin kullanılması tavsiye edilir. Daha önce teste tabi tutulmamış kimyasalların gözde aşınma/tahriş potansiyelinin değerlendirmesinde kullanılacak verilerin geliştirilmesi için sıralı test uygulama stratejisi kullanılmalıdır. Bu Ekte tarif edilen test uygulama stratejisi OECD çalıştayında geliştirilmiştir (1) ve daha sonra onaylanarak Kimyasal Maddelerin İnsan Sağlığı ve Çevreye Etkileri için Uyumlu Hale Getirilmiş Bütünleştirilmiş Tehlike Sınıflandırma Sistemi içinde genişletilmiş, Kasım 1998’de 28. Kimyasallar Komitesi Ortak Toplantısı ve Kimyasallar Üzerine Çalışma Grubu Toplantı’sında kabul edilmiştir(2). Her ne kadar bu sıralı test uygulama stratejisi, test yöntemi B.5’in bütününü oluşturmuyorsa da gözdeki tahriş/aşınma özelliğinin belirlenmesi için tavsiye edilen yaklaşımı ifade eder. Bu yaklaşım, gözde tahriş/aşınma in vivo testlerinin uygulanması için hem en iyi uygulama hem de etik bir değerlendirmedir. Test uygulama yöntemi, in vivo testlerin yürütülmesi için bir rehber sağlar ve böyle bir teste başlamadan önce vurgulanması gereken etkenleri özetler. Sıralı test uygulama stratejisi, test maddesinin gözü tahriş etme/aşındırma özelliklerinin mevcut verilerle değerlendirilmesi için bir delilin ispat kuvveti analiz yaklaşımı ve ilave çalışmaya ihtiyaç duyulan veya hiçbir çalışma yapılmamış maddelerle ilgili verilerin oluşturulması için de katlı bir yaklaşım sunar. Strateji, özel koşullar altında önce geçerli ve kabul edilmiş in vitro veya ex vivo testlerin sonra da B.4 cilt aşınma/tahriş çalışmaları test yönteminin uygulanmasını içerir (3)(4). Test uygulama stratejisinin tanımı ve değerlendirmesi Testleri sıralı test uygulama stratejisinin (Şekil) bir kısmı olarak yürütmeye başlamadan önce, in vivo göz testlerine ihtiyaç olup olmadığının belirlenmesi için mevcut tüm bilgiler değerlendirilmelidir. Her ne kadar anlamlı bilgi tek bir parametrenin (Örnek olarak; uç pH değerleri) değerlendirilmesiyle elde edilebilse de mevcut bilgilerin tamamı göz önünde bulundurulmalıdır. Şüpheli maddenin veya yapısal benzerlerinin etkileriyle ilgili tüm veriler, delilin ispat kuvveti kararı verilerek ve bu karar için bir gerekçe sunularak değerlendirilmelidir. Maddeye dair elde mevcut olan insan ve hayvan verilerine öncelikli olarak önem verilmelidir bunu da in vitro ve ex vivo testlerden elde edilen veriler izlemelidir.Aşındırıcı maddelere ait in vivo çalışmalardan mümkün olduğunca kaçınılmalıdır. Test uygulama stratejisinde göz önünde bulundurulması gereken faktörler aşağıdaki gibidir: (1. Basamak) İnsan ve hayvana ait var olan verilerin değerlendirilmesi. İnsanla ilgili mevcut veriler ör. Klinik veya mesleksel çalışmalar ve vaka raporları ve/veya tek veya tekrarlı oküler maruz kalma toksisite çalışmalarından elde edilen hayvan test verileri, göz önünde bulundurulmalıdır, çünkü bu şekilde göz üzerindeki etkilerle doğrudan ilgili bilgi sağlanır. Daha sonra insan ve/veya hayvan çalışmalarından elde edilen dermal tahriş/aşınma varlığını gösteren sonuçlar değerlendirilmelidir. Gözde aşındırıcılığı ve ciddi tahriş özelliği bilinen maddeler hayvanların gözüne damlatılmamalıdır, aynı şekilde ciltte aşındırıcı veya tahriş edici etki gösteren maddeler, gözde de aşındırıcı/tahriş edici etki meydana getireceğinin göz önünde bulundurulması gerektiğinden, göze uygulanmamalıdır. Önceden yapılan çalışmalardan gözde aşındırıcılığı ve tahriş özelliklerinin olmadığına dair yeterli delilin bulunduğu maddelerin in vivo göz çalışmalarında test edilmesine gerek yoktur. (2.Basamak) Yapı aktivite ilişkisinin analizi (SAR). Yapısal olarak birbirleriyle ilişkili maddelere uygulanan testlerin sonuçları, mevcutsa, göz önüne alınmalıdır. Yapısal olarak ilişkili maddelerle veya karışımlarla ilgili olarak gözdeki aşındırıcı/tahriş edici potansiyellerine dair elde yeterli insan ve/veya hayvan verileri mevcutsa, değerlendirilmekte olan maddenin aynı tepkileri meydana getireceği tahmin edilebilir. Böyle durumlarda, maddesinin teste tabi tutulmasına gerek yoktur. Yapısal olarak ilişkili maddelerle veya böyle maddelerin karışımlarından elde edilen negatif veriler, sıralı test uygulama stratejisi altındaki bir maddenin tahriş edici ve aşındırıcı olmadığına karar vermek için yeterli değildir. Maddenin hem dermal hemde oküler aşındırma ve tahriş potansiyelini belirlemek için geçerli ve kabul edilmiş SAR yaklaşımları kullanılmalıdır. (3.Basamak) Fizikokimyasal özellikler ve kimyasal reaktivite. pH değeri ≤2.0 veya ≥11.5 olan maddeler kuvvetli bölgesel etkiler gösterebilirler. Eğer kuvvetli pH değeri bir maddenin ciltte aşındırıcı olup olmadığını belirlemek için temel alınıyorsa, o zaman maddenin asit/alkali rezervi de (tampon kapasitesi) ayrıca dikkate alınmalıdır (5)(6). Tampon kapasitesine göre maddenin göz üzerinde aşındırıcı etkisi olmayabileceği düşünülüyorsa, bunu teyit etmek için ilave testler -tercihen geçerli ve kabul edilmiş in vitro veya ex vivo (canlı sistemin laboratuvar ortamında incelendiği sistem)- yürütülmelidir. (bakınız 5. ve 6. basamaklar). (4.Basamak) Diğer mevcut bilgilerin ele alınması. Dermal yolla sistemik toksikoloji hakkında elde edilen tüm bilgiler bu basamakta değerlendirilmemelidir. Test maddesinin akut dermal toksisitesinin ayrıca üzerinde durulmalıdır. Eğer test maddesinin dermal yolla çok toksik olduğu gösterilirse, gözde test edilmesine gerek kalmayabilir. Her ne kadar akut dermal toksisite ve dermal aşınma/tahriş arasında geçerli bir ilgi yoksa da eğer bir madde dermal yolla çok toksikse, göze uygulandığında çok fazla toksisite göstereceği öngörülebilir. Bu gibi veriler 2. ve 3.basamaklar arasında da göz önünde bulundurulmalıdır. (5. veya 6.Basamaklar) in vitro veya ex vivo testlerin sonuçları. Özellikle göz veya cildi aşındırma ve tahriş etme gibi özel etkilerin değerlendirilmesi için tasarlanan geçerli ve kabul edilmiş in vivo veya ex vivo testlerde (7)(8) aşındırıcı veya ciddi tahriş özelliği gösteren maddelerin hayvanlarda denenmesine gerek yoktur. Böyle maddelerin, benzer ciddi etkileri in vivo olarak da göstereceği önceden tahmin edilebilir. Eğer geçerli ve kabul edilmiş in vitro/ex vivo testler mevcut değilse, 5. ve 6. basamaklar geçilerek doğrudan 7. basamağa geçilir. (7. Basamak) Maddenin in vivo dermal tahriş ediciliğinin ve aşındırıcılığının değerlendirilmesi. Bir maddenin yukarıda listelenen çalışmalardan elde edilen verilere dayanan potansiyel aşındırma/tahriş etme durumuyla ilgili delilin ispat kuvveti analizi yapıldığında elde yeterli bilgi olmadığı zaman test yöntemi B.4 ve ilişiğindeki Ek(9) kullanılarak in vivo cilt tahriş/aşınma potansiyeli ilk önce değerlendirilmelidir. Eğer maddenin aşındırıcı ciltte ciddi tahriş edici olduğu gösterilirse, diğer bilgiler başka bir sonucu desteklemediği sürece, maddenin aşındırıcı göz tahriş edici olduğu göz önünde bulundurulmalıdır. Böylece, in vivo göz testinin uygulanmasına gerek duyulmayacaktır. Eğer madde ciltte aşındırıcı veya ciddi tahriş edici değilse, in vivo göz testi yapılmalıdır. Tavşanlardaki in vivo test (8. ve 9. Basamaklar). In vivo oküler test uygulamasına bir hayvan kullanılarak başlangıç testi ile başlanmalıdır. Eğer bu testin sonuçları maddenin göz üzerinde ciddi tahriş edici veya aşındırıcı olduğunu gösterirse, ilave testlere gerek yoktur. Eğer başlangıç testinde herhangi bir aşındırıcı veya ciddi tahriş etkisi gözlenmezse iki ilave hayvan kullanılarak teyit testi yürütülmelidir. KAYNAKLAR (1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). (2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). (3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161- 177. (4) Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion. (5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. (6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231. (7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483.524. (8) Testing Method B.40 Skin Corrosion. (9) Annex to Testing method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin Irritation and Corrosion. GÖZDE TAHRİŞ VE AŞINMA İÇİN TEST UYGULAMA VE DEĞERLENDİRME STRATEJİLERİ ŞEKİL 
B.6 CİLT HASSASİYETİ
Açıklamalar: Testlerin duyarlılığının ve gerçekleştirilebilirliğinin, halk sağlığıyla ilgili zehirlenme için bir sınıflandırma sisteminde, insandaki potansiyel cilt duyarlılığını belirlemede önemli olduğu düşünülür.
.
Cilt hassasiyeti: (allerjik temas deri iltihabı (dermatitis)) Bir maddeye karşı gelişen immünolojik (bağışıklık sistemine özgü) cilt reaksiyonudur. İnsanda cevaplar, kaşınma, ciltte kızarıklık, ödem, ciltte kabarma ve kistler, deride su toplanması veya bunların birleşimleriyle bulunabilir. Başka türlerde reaksiyonlar değişebilir, sadece ciltte kızarıklık ve ödem görülebilir. Başlatma maruz kalması: Aşırı hassaslaştırıcı bir durumu meydana getirmesi amacıyla bir nesnenin test maddesine deneysel maruz kalması. Başlatma süresi: Aşırı duyarlı bir durumun gelişebileceği başlatma maruz kalmasını izleyen en az bir haftalık süre. Sataşma (challange) maruz kalması : Başlatma süresini takiben daha önceden test maddesiyle karşılaşmış bir nesnenin aşırı hassaslaştırıcı bir reaksiyon verip vermediğinin belirlendiği deneysel maruz kalma.
Kullanılan deneysel tekniğin duyarlılığı ve güvenilirliği, her altı ayda bir hafiften-ortaya doğru şiddetli cilt hassasiyeti yaratan özelliği olduğu bilinen maddelerin kullanımıyla değerlendirilir. Uygun şekilde yürütülen bir testte, hafif-orta şiddette hassasiyet geliştiriciler için bir adjuvan testte en az %30’luk,bir non-adjuvan testinde en az % 15’lik cevap beklenir. Referans madde olarak aşağıdaki maddeler tercih edilir.
Uygun bir gerekçenin sunulduğu, yukarıdaki kriterlere uyan başka kontrol maddelerinin kullanıldığı durumlar da olabilir
Test hayvanları başlangıçta test maddesine deri altı enjeksiyonlarla ve/veya üst deriye ait uygulamalarla maruz kalırlar (başlatma maruz kalması). İmmün cevabın gelişebileceği 10-14 günlük bir test süresini takiben (indüksiyon süresi), hayvanlar sataşma dozuna maruz kalırlar. Sataşma dozuna maruz kalan test hayvanlarındaki cilt reaksiyonunun büyüklüğü ve derecesi, başlatma ve sataşma maruz kalması sırasında yalandan muameleye tabi tutulan kontrol hayvanlarınkiyle karşılaştırılır.
Test maddesinin uzaklaştırılmasının gerekli olduğu düşünülüyorsa, su ya da uygun çözücü kullanılarak mevcut cevap değiştirilmeden veya üst derinin (epidermis) bütünlüğü bozulmadan, bu durumun üstesinden gelinebilir.
Sağlıklı, genç, yetişkin albino (deride melanin pigmentinin sentezlenememesiyle ortaya çıkan hastalık) kobaylar, testten en az beş gün öncesinden laboratuvar koşullarına alıştırılırlar. Testten önce hayvanlar rastgele ayrılır ve uygulama grupları oluşturulur. Tüylerin kırpılarak, tıraşlanarak veya kimyasal tüy dökücülerle uzaklaştırılması, kullanılan test yöntemine bağlıdır. Cilde zarar vermemeye dikkat edilmelidir. Hayvanlar test başlamadan önce ve testin sonunda tartılırlar.
Albino kobayların laboratuvarda yaygın olarak kullanılan suşları tercih edilir.
Erkek ve/veya dişi hayvanlar kullanılabilir. Dişiler kullanılıyorsa doğum yapmamış olmaları ve hamile olmamaları gerekir. Uygulama grubu olarak en az 10, kontrol grubu olarak da en az 5 hayvan kullanılır. 20’den az deney grubu ve 10’dan az kontrol grubu kobay kullanıldığında, test maddesinin hassaslaştırıcı olduğunu söylemek mümkün değildir. En az 20 test ve 10 kontrol hayvanının kullanıldığı ek testlerin yapılması şiddetle tavsiye edilir.
Kullanılan test maddesinin derişimi her bir başlatma maruz kalması için sistematik olarak iyi tolere edilmeli ve hafif-orta şiddette cilt tahrişi gösterecek en yüksek derişim olmalıdır. Sataşma maruz kalması için kullanılan derişim tahriş etmeyen en yüksek doz olmalıdır. Başka mevcut bilgi yoksa uygun derişimler iki veya üç hayvanın kullanıldığı pilot bir çalışmayla belirlenmelidir. Bu amaçla FCA ile muamele edilmiş hayvanların kullanımına önem verilmelidir.
0. Gün –Uygulama grubu 0,1 ml hacimli deri altı enjeksiyonlar, üç çift olarak tüylerden temizlenmiş omuz bölgesine uygulanırlar, böylece her çiftten biri orta çizginin her iki yanında da bulunur.
2. Enjeksiyon : uygun bir taşıyıcı içindeki seçilen derişimde test maddesi 3.Enjeksiyon : seçilen derişimde test maddesi formülasyonu, 1:1 (v/v) FCA/ su veya fizyolojik tuzlu su çözeltisi karışımı Üçüncü enjeksiyonda, suda çözünen maddeler FCA ile karıştırmadan önce sulu fazda çözünürler. Yağda çözünen veya çözünmeyen maddeler, sulu fazla birleştirmeden önce FCA’nın içinde askıda kalırlar. Test maddesinin son derişimi 2. enjeksiyonda kullanılana eşit olur. 1. ve 2. Enjeksiyonlar birbirlerine yakın ve kafanın çok yakınında olacak şekilde uygulanırken, 3.enjeksiyon test alanının kuyruk kısmı boyunca uygulanır. 0.Gün kontrol grubu 0.1 ml hacimli deri-altı enjeksiyonlar üç çift olarak aynı yere uygulama hayvanlarında olduğu gibi uygulanırlar. 1. Enjeksiyon : 1:1 (v/v) FCA/ su veya fizyolojik tuzlu su çözeltisi karışımı (v/v) 2. Enjeksiyon: seyreltilmemiş taşıyıcı 3. Enjeksiyon: 1:1 (v/v) FCA/ su veya fizyolojik tuzlu su çözeltisi içinde 50% w/v formülasyonlu taşıyıcı karışımı 5-7. günler - uygulama ve kontrol grupları Yüzeysel başlatma uygulamasından yaklaşık 24 saat önce, eğer madde bir cilt tahrişine neden olmuyorsa, kırpma ve/veya traşlama yapıldıktan sonra test alanına bölgesel tahriş oluşturmak için 0.5 ml % 10’luk vazelin içindeki sodyum lauril sülfat uygulanır. 6-8. günler - uygulama grubu Test alanı tüylerden tekrar arındırılır. Bir filtre kâğıdı (2 x 4 cm) uygun bir taşıyıcı içinde test maddesiyle tamamen yüklenir ve test alanına uygulanır ve kapayıcı bir sargı ile 48 saat temas ettirilir. Taşıyıcı seçimi gerekçelendirilmelidir. Katılar, ince toz haline gelinceye kadar ezilir ve uygun bir taşıyıcı ile karıştırılır. Sıvılar, uygunsa, seyreltilmemiş olarak uygulanırlar. 6-8. günler - kontrol grubu Test alanı tüylerden tekrar arındırılır. Sadece taşıyıcı, benzer şekilde test alanına uygulanır ve kapayıcı bir sargı ile 48 saat temas ettirilir.
20-22. Gün - uygulama ve kontrol grupları Uygulamave kontrol grubundaki hayvanların böğürleri tüylerden temizlenir. Test maddesi yüklenmiş bir yama veya bölme hayvanın böğrüne uygulanır ve gerekli olduğunda sadece taşıyıcı yüklenmiş bir yama veya bölme diğer böğüre de ayrıca uygulanabilir. Yamalar kapayıcı bir sargı ile 24 saat temas ettirilir. 1.5.1.3.3 Gözlem ve Derecelendirme: uygulama ve kontrol grupları – yamayı kaldırdıktan yaklaşık 21 saat sonra, sataşma alanı temizlenir ve adım adım kırpılır ve/veya traşlanır ve gerekiyorsa tüyleri alınır; – yaklaşık 3 saat sonra (sataşma uygulamasının başlamasından yaklaşık 48 saat sonra) cilt reaksiyonu gözetlenir ve ekte gösterilen derecelendirmeye göre kaydedilir;– Bu gözlemden yaklaşık 24 saat sonra, ikinci bir gözlem (72 saat) yapılır ve tekrar kaydedilir.
Sağlıklı, genç, yetişkin albino kobaylar, testten en az beş gün öncesinden laboratuvar koşullarına alıştırılırlar. Testten önce, hayvanlar rastgele ayrılırlar ve uygulama grupları oluşturulur. Tüylerin kırpılarak, tıraşlanarak veya kimyasal tüy dökücülerle uzaklaştırılması, kullanılan test yöntemine bağlıdır. Cilde zarar vermemeye dikkat edilmelidir. Hayvanlar test başlamadan önce ve testin sonunda tartılırlar.
Albino kobayların labotaruvarda yaygın olarak kullanılan suşları tercih edilir.
Erkek ve dişi hayvanlar kullanılabilir. Dişiler kullanılıyorsa, doğum yapmamış olmaları ve hamile olmamaları gerekir. Uygulama grubu olarak en az 20, kontrol grubu olarak da en az 10 hayvan kullanılır.
Kullanılan test maddesinin derişimi her bir başlatma maruz kalması için sistematik olarak iyi tolere edilmeli ve hafif fakat aşırı olmayan cilt tahrişi gösterecek en yüksek derişim olmalıdır. Başlatma maruz kalması için kullanılan derişim tahriş etmeyen en yüksek doz olmalıdır. Gerekliyse, uygun derişim iki veya üç hayvanın kullanıldığı pilot bir çalışmayla belirlenebilir. Suda çözünebilen test maddeleri için taşıyıcı olarak su veya yüzey aktif maddenin seyreltik, tahriş etmeyen bir çözeltisini kullanmak uygundur. Diğer test maddelerinde başlatma işleminde %80 etanol/su, sataşma işleminde aseton tercih edilir.
0. Gün - uygulama grubu Bir böğür (kaburga ile kalça arasındaki kısım) tüylerden temizlenir. (oldukça kısa kırpılır) Yama sistemi uygun bir taşıyıcı içinde test maddesiyle tamamen yüklenmiş (taşıyıcı seçimi gerekçelendirilmelidir, sıvı test maddesi eğer uygunsa, seyreltilmemiş olarak) olarak uygulanır. Test yama sistemi test alanına uygulanır ve kapayıcı bir yama veya bölme ile 6 saat için uygun şekilde sarılarak cilde temas ettirilir.
Bir böğür (kaburga ile kalça arasındaki kısım) tüylerden temizlenir (adım adım kırpılır) Taşıyıcı sadece muamele grubunda kullanılana benzer şekilde uygulanır. Yama sistemi test alanına uygulanır ve kapatıcı sargı bir yama veya bölme ile 6 saat için uygun şekilde giydirilerek cilde temas ettirilir. Yalancı bir kontrol grubuna gerek olmadığı gösterilirse, denenmemiş bir kontrol grubu kullanılabilir. 6-8 ve 13-15.Günler - uygulama ve kontrol grupları Aynı uygulama 0. günde olduğu gibi ve aynı tarafın aynı test alanına (eğer gerekliyse tüyler temizlenir) 6-8. ve tekrar 1-15. günlerde yapılır.
27-29.Gün - uygulama ve kontrol grubu Uygulama ve kontrol hayvanlarının böğürleri tüylerden temizlenir. (oldukça kısa kırpılır) Uygun miktarda test maddesi içeren kapayıcı bir yama veya bölme tahriş etmeyen en yüksek derişimde uygulama ve kontrol hayvanlarının uygulama yapılmamış böğrüne uygulanır.
– yamanın uzaklaştırılmasından yaklaşık 21 saat sonra, alan tüylerden temizlenir; – yaklaşık üç saat sonra (sataşma yamasının uygulanmasından yaklaşık 30 saat sonra) cilt reaksiyonları gözlenir ve ekte gösterilen derecelendirmeye göre kaydedilir; – 30 saatlik gözlemden yaklaşık 24 saat sonra (sataşma yamasının uygulanmasından yaklaşık 54 saat sonra) cilt reaksiyonları tekrar gözlenir ve kaydedilir. Test ve kontrol hayvanlarının kör okumaları teşvik edilir. İlk sataşmadan elde edilen sonuçları netleştirmek gerektiğinde, (ilkinden yaklaşık bir hafta sonra yapılacak ikinci bir sataşma (örneğin, bir tekrar sataşma), uygun yerlerde yeni bir kontrol grubuyla sataşma üzerinde durulmalıdır. Bir sataşma ayrıca orjinal kontrol grubunda da uygulanabilir. Başlatma ve sataşma işlemlerinde meydana gelen bütün cilt reaksiyonları ve sistemik reaksiyonları içine alan olağandışı bulgular gözlemlenmeli ve Magnusson/Kligman derecelendirme ölçeğine göre kaydedilmelidir. (Bakınız ek). Diğer işlemler, ör. Histopatolojik incelemeler, cilt kıvrım kalınlığının ölçümü, şüpheli reaksiyonları aydınlatmak için yapılır.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||