FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- KAYNAKLAR Bu yöntem OECD TG 406 ile eşdeğerdir. Ek-I TABLO
- B.7 TEKRARLI DOZ (28 GÜNLÜK) TOKSİSİTESİ (AĞIZ YOLUYLA) YÖNTEM
- KAYNAKLAR Bu yöntem OECD TG 407’ye eşdeğerdir. B.8 TEKRARLI DOZ (28 GÜNLÜK) TOKSİSİTESİ (SOLUNUMLA) YÖNTEM
VERİLER (GPMT VE BUEHLER TESTİ) Veriler, her bir gözlemde, her bir hayvan için cilt reaksiyonlarını gösteren bir tablo halinde özetlenmelidir.
Kobay testi öncesinde tarama testi uygulanmışsa, testin prosedürüyle ilgili detayları içeren tarifi ya da referansı (ör. Lokal Lenf Düğümü Yöntemi (LLNA), Fare Kulak Şişme Testi (MEST) ) test ve referans maddeyle elde edilen sonuçlarla birlikte verilmelidir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir: Test hayvanları:
Test koşulları:
Sonuçlar:
Sonuçların tartışılması Sonuçlar
Bu yöntem OECD TG 406 ile eşdeğerdir. Ek-I TABLO: Sataşma yama testi reaksiyonlarının değerlendirilmesi için Magnusson/Kligman derecelendirme ölçeği 0 = gözlenebilir bir değişiklik yok 1 = kesik veya yamalı kızarıklık 2 = orta şiddette ve bitişik kızarıklık 3 = yoğun kızarıklık ve şişlik B.7 TEKRARLI DOZ (28 GÜNLÜK) TOKSİSİTESİ (AĞIZ YOLUYLA)
Bakınız: Bölüm B Genel Giriş (A).
Bakınız: Bölüm B Genel Giriş (B).
Test maddesi çeşitli gruplardaki deney hayvanlarına günlük olarak ağız yoluyla ölçeklendirilmiş dozlarda uygulanır ve her gruba 28 gün süresince bir doz uygulanır. Uygulama süresince, hayvanların zehirlenme belirtilerini gözetleyebilmek için her gün yakından takip edilirler. Test sırasında ölen ya da öldürülen hayvanlara otopsi yapılır ve testin sonunda hayatta kalan hayvanlar da öldürülerek otopsileri yapılır. Bu yöntem, özel bir sınır noktası olarak nörolojik (sinirsel) etkilere ve hayvanların klinik gözlemlerinin dikkatli bir şekilde yapılması gerektiğine dikkat çeker ve olabildiğince fazla bilgi elde edilmesi gerekliliği vurgulanır. Yöntem bu durumun etraflıca incelenmesini sağlayabilecek olan, nörotoksik (sinir hücreleri üzerinde zehir etkisi gösteren) potansiyelle birlikte kimyasalları tayin etmelidir. İlaveten, yöntem immunolojik (bağışıklık sistemine özgü) etkilerin belirtilerine ve üreme organlarının zehirlenmesine işaret eder.
Sağlıklı, genç, erişkin hayvanlar kontrol ve uygulama gruplarına rastgele olarak ayrılırlar. Kafesler, yerleştirmelere bağlı etkiler en az olacak şekilde konumlandırılmalıdırlar. Hayvanlar özgün şekilde belirlenir ve çalışmaya başlamadan en az beş gün öncesinden itibaren laboratuvar koşullarına alışmalarını sağlamak için kafeslerinde tutulurlar. Test maddesi sonda, diyet ya da içme suyuyla uygulanır. Ağız yoluyla (oral) uygulanan yöntem, çalışmanın amacına ve maddenin fiziksel/kimyasal özelliklerine bağlıdır. İhtiyaç duyuluyorsa, test maddesi uygun bir taşıyıcıda çözülür veya süspande edilir. Uygunsa, öncelikle sulu çözelti/süspansiyon, bunu takiben yağda çözelti/emülsiyon (örneğin Mısır yağı) ve daha sonra başka diğer taşıyıcılarda çözeltilerin kullanımı tavsiye edilir. Su dışındaki taşıyıcıların toksik özellikleri bilinmelidir. Taşıyıcı içindeki test maddesinin dayanıklılığı belirlenmelidir.
Tercih edilen kemirgen türü sıçandır, ancak kemirgenlerden başka türler de kullanılabilir. Laboratuvarda genellikle genç, sağlıklı, yetişkin hayvan ırkları kullanılmalıdır. Dişilerin doğum yapmamış olmaları ve hamile olmamaları gerekir. Dozun uygulanması, hayvanlar sütten kesilir kesilmez ve her koşulda hayvanlar dokuz haftalık olmadan yapılmalıdır. Kullanılan hayvanlardaki ağırlık değişkenliği aralığı, her iki cinsiyet için de en az değerde olmalı ve uygun ortalama değerin % 20’sini geçmemelidir.
Her bir doz için en az 10 hayvan (5 erkek, 5 dişi) kullanılmalıdır. Ara ölümler planlanıyorsa, çalışma tamamlanmadan önce öldürülmesi planlanan hayvan sayısı artırılmalıdır. Ayrıca, 10 hayvandan oluşan bir ikincil test grubu (cinsiyet başına beş hayvan) 28 gün boyunca yüksek doza maruz bırakılabilir ve uygulama sonrasındaki 14 gün içinde tersinirlik, kalıcılık veya gecikmiş toksik etkiler için gözlemlenebilir. 10 kontrol hayvanından oluşan bir uydu grup (cinsiyet başına 5 hayvan) ayrıca kullanılır.
Genel olarak, en az üç test grubu ve bir kontrol grubu kullanılmalıdır. Test maddesi uygulanacak olanların haricinde kontrol grubunda yer alan hayvanlara, test grubu denekleriyle benzer şekilde işlem yapılır. Test maddesi uygulanırken taşıyıcı kullanılmışsa, kontrol grubu kullanılan en yüksek hacimde taşıyıcıyı almalıdır. Diğer verilerin değerlendirilmesi sonucunda, 1000 mg/kg vücut ağırlığı/g dozunda hiçbir etki beklenmiyorsa, sınır testi yapılabilir. Uygun veri yoksa kullanıcak dozların belirlenmesine yönelik olarak, aralık belirlemek için bir çalışma yapılabilir. Doz seviyeleri, test maddesi veya ilgili maddeler için mevcut herhangi bir toksisite ve (toksiko-) kinetik veriler dikkate alınarak seçilmelidir. En yüksek doz ciddi zararlara veya ölüme neden olmadan toksik etkilerinin uyarılması amacıyla seçilmelidir. Daha sonra, doz seviyelerinin dozaja bağlı herhangi bir cevabı ve en düşük dozda olumsuz etkinin gözlenmediğini (NOAEL) gösterecek şekilde, azalan sıralaması seçilmelidir. Azalan doz seviyelerini ayarlamak için 2-4 kat arasındaki aralıklar genelde uygundur ve dozajlar arasında geniş aralıklar (örneğin 10 faktörden daha fazla) kullanılması yerine dördüncü bir test grubunun eklenmesi çoğunlukla tercih edilir. Diyet veya içme suyuyla uygulanan maddeler için, test maddesinin hiçbir miktarının normal beslenme veya su dengesiyle etkileşmediğinin garanti edilmesi önemlidir. Test maddesi, ya sabit diyet derişimi (ppm) ya da hayvanların vücut ağırlığı üzerinden kullanılabilen sabit doz olarak uygulandığında; kullanılan alternatif belirtilmelidir. Sondayla uygulanan maddeler için, doz her gün yakın zamanlarda verilmelidir ve hayvan vücut ağırlığına dayanarak sabit doz elde etmek için gerektiği şekilde ayarlanmalıdır. Uzun süreli bir çalışmanın hazırlık aşaması olarak tekrarlı doz çalışması kullanılıyorsa, her iki çalışmada da benzer diyetler kullanılmalıdır.
Eğer bir test en az 1000 mg/kg vücut ağırlığı/gün tek doz düzeyinde veya besin veya içme suyuyla (vücut ağırlığı belirlemelerine bağlı olarak içme suyu veya içme suyunda eşit yüzdede) yukarıda tanımlanan işlemler kullanılarak uygulandığında, gözlenebilir toksik etki oluşmuyorsa ve yapısal olarak ilişkili maddelerle ilgili verilere dayanılarak toksisite beklenmiyorsa, bu durumda üç doz kullanılarak yapılacak kapsamlı bir çalışmaya gerek olmayabilir. Sınır testi, insan maruz kalmasının daha fazla doz kullanılması gerektiğine işaret ettiği durumlar haricinde uygulanır.
Gözlem süresi 28 gün olmalıdır. Uydu gruptaki takip eden gözlemler için planlanan hayvanlar ilaveten en az 14 gün daha herhangi bir uygulama yapılmadan, gecikmiş veya kalıcı toksik etkiler veya toksik etkilerin düzelme durumu için gözlem altında tutulmalıdır.
Hayvanlar 28 gün boyunca haftanın yedi günü test maddesiyle, haftada beş gün diyet ihtiyaçları karşılanmış olacak şekilde doz uygulaması gerekçelendirilmelidir. Test maddesi sondayla uygulandığında, hayvanlara tek doz halinde, gavaj yöntemi ya da uygun boğaza salınan sonda kullanılarak yapılmalıdır. Tek seferde verilen en fazla sıvı hacmi, test hayvanının büyüklüğüne bağlıdır. Hacim, sulu çözeltilerin 2 ml/100 g vücut ağırlığında kullanılabildiği durumlar haricinde, 1 ml/100 g vücut ağırlığını aşmamalıdır. Tahriş edici ve normalde daha yüksek derişimlerde şiddetlenmiş etkiler açığa çıkaracak olan aşındırıcı maddeler dışında test hacmindeki değişiklikler, tüm doz seviyelerinde sabit hacim sağlamak için derişim ayarlaması yapılarak, en aza indirilmelidir
Genel klinik gözlemler günde en az bir defa, tercihen günün aynı saatlerinde yapılmalı ve doz uygulandıktan sonraki olumsuz etkilerin pik süreleri de düşünülmelidir. Hayvanların sağlık koşulları kaydedilmelidir. Günde en az iki defa tüm hayvanlar hastalık ve ölüm oranı için kontrol edilmelidirler. Ölmek üzere olan, acı ve ağrı çeken hayvanlar farkına varıldığında uzaklaştırılmalı, insanca öldürülmeli ve hayvanlara otopsi yapılmalıdır. İlk maruz kalmadan önce bir defa (karşılaştırılmalarına olanak sağlar) ve daha sonra da haftada en az bir defa olmak üzere, tüm hayvanlara detaylı klinik gözlemler yapılmalıdır. Bu gözlemler kafeslerin dışındaki standart bir ortamda tercihen her seferinde aynı saatlerde yapılmalıdır. Gözlemler dikkatlice, tercihen test uygulama laboratuvarı tarafından açıkça anlatılan skorlama sistemleri kullanılarak kaydedilmelidir. Test koşullarındaki değişimlerin az olması ve gözlemlerin tercihen uygulamadan habersiz gözlemciler tarafından yapıldığının garanti edilmesi için çaba gösterilmelidir. Not alınan belirtiler ciltteki, kürkteki, gözlerdeki, mukoz membranlardaki değişiklikleri, salgılama başlaması, atılım ve otonomik aktiviteyi (gözyaşı salgısı, piloereksiyon, gözbebeği büyüklüğü, solunumla ilgili olağan dışı durumlar) içermeli, ancak bunlarla sınırlı olmamalıdır. Yürüyüşteki değişiklik, duruş ve klonik (spazm) veya tonik (kuvvetlendirici) hareketlerin varlığı yanında, dokunmaya cevap, basmakalıp davranışlar (aşırı tımarlanma, rutin olarak kendi etrafında dönme) veya tuhaf davranışı (örneğin kendini sakatlama, geriye doğru yürüme) ayrıca kaydedilmelidir. Maruz kalmanın dördüncü haftasında, farklı tipteki uyarılarının duyusal tepkileri (örneğin işitsel, görsel ve proprioseptif (vücudun içinden gelen uyarıları duyan) uyarı), kavrama gücü değerlendirmesi ve motor aktivite değerlendirilmesi yapılmalıdır. İşlemlerin detayları literarürde verilmiştir (bakınız Genel Giriş Kısım B). Dördüncü maruz kalma haftasındaki fonksiyonel gözlemler, bu çalışmayı takip eden 90 günlük bir subkronik toksisite çalışmasının ön-hazırlık aşaması halinde yürütüldüğünde, gözardı edilebilir. Bu durumda, fonksiyonel gözlemler takip eden çalışmada yer almalıdır. Diğer taraftan, tekrarlı doz çalışmasından elde edilecek olan fonksiyonel gözlem verileri sonraki bir subkronik çalışma için doz seviyelerini seçme kabiliyetini geliştirebilir. İstisnai olarak, aksi takdirde fonksiyonel test performansıyla anlamlı olarak etkileşecek olan kapsamlı toksisite belirtileri görülen gruplar için fonksiyonel gözlemler göz ardı edilebilir.
Bütün hayvanlar en az bir hafta önce tartılmalıdırlar. Gıda ve su tüketimiyle ilgili ölçümler en az haftada bir yapılmalıdır. Eğer test maddesi içme suyuyla uygulanıyorsa, su tüketimi ayrıca en az haftada bir yapılmalıdır.
Test süresinin sonunda aşağıdaki hematolojik incelemeler yapılmalıdır: hematokrit, hemoglobin derişimi, eritrosit sayımı, toplam ve diferansiyel lökosit sayımı, trombosit sayısı ve kan pıhtılaşma zaman/potansiyelinin ölçümü. Belirlenen yerden, hayvanlar öldürülmeden hemen önce veya işlem sırasında, kan örnekleri alınmalı ve örnekler uygun koşullarda saklanmalıdır.
Dokulardaki, özellikle böbrek ve karaciğerdeki, majör toksik etkileri ortaya çıkarmak için hayvanlardan, öldürülmelerinden önce veya uygulamanın bir parçası olarak işlem sırasında alınan kan örnekleri üzerinde klinik biyokimya çalışmaları yapılmalıdır (ölmek üzere olanların dışındakiler ve/veya aralıklarla öldürülenler). Hayvanların kan örnekleri alınmadan önceki gece boyunca aç bırakılmaları tavsiye edilir1. Plazma veya serum incelemeleri, sodyum, potasyum, glukoz, total kolesterol, üre, kreatinin, toplam protein ve albumin, hepatoselüler etkilerin gösterilmesi için (alanin aminotransferaz, aspartat aminotransferaz, alkalin fosfataz, gama glutamil transpeptidaz ve sorbitol dehidrogenaz gibi) en az iki enzim içermelidir. İlave enzimlerin (hepatik (karaciğere ait) olanlar ve diğerleri) ve safra asitinin ölçümleri bu koşullar altında yararlı bilgiler sağlayabilir. İsteğe bağlı olarak, takip eden idrar analiz tayinleri çalışmanın son haftasında zamanlanmış idrar hacmi toplanması; görünüş, hacim, ozmolalite veya özgül ağırlık, pH, protein, glukoz ve kan/kan hücreleri kullanılarak yapılabilir. İlaveten, genel doku hasarlarının serum belirteçlerini belirlemek için çalışma yapılması göz önünde bulundurulmalıdır. Test maddesiyle ilgili bilinen özellikler şüphe yaratıyorsa veya yaratabiliyorsa, uygulanacak olan diğer belirlemeler kalsiyum, fosfat, açlık trigliseritleri, özel hormonlar, methemoglobin ve kolinesteraz gibi ilgili metabolik profilleri etkilerler. Bunların belirli sınıflara ait maddeler için veya olay bazında tespit edilmesi gerekir. Sonuçta, türlere ve verilen maddenin gözlenen ve/veya beklenen etkilerine bağlı olarak esnek bir yaklaşıma gereksinim vardır. Anahat verileri yeterli değilse, doz uygulanması başlatılması öncesinde hematolojik ve klinik biyokimya değişkenleri üzerinde durulmalıdır.
Çalışmadaki bütün hayvanlara vücudun dış yüzeyinin, tüm deliklerin ve kafatasıyla ilgili, göğüsle ilgili ve karna ait boşlukların ve onların içeriklerinin dikkatlice incelendiği tam, detaylı bir otopsi yapılmalıdır. Tüm hayvanların karaciğer, böbrekler, adrenaller, testis, epididimisler, timüs, dalak, beyin ve kalbi yapışık olan dokulardan ayrılıp kesilmeli ve parçalara ayrıldıktan sonra kurumasından kaçınılarak ıslak ağırlıkları alınmalıdır. Aşağıdaki dokular her iki doku tipi ve istenilen daha sonraki histopatolojik uygulama için, en uygun koruma ortamında muhafaza edilmelidir: bütün büyük lezyonlar, beyin (beyin, beyincik ve ponsları (ön beyin beyincik ve omurilik soğanı arasında yer alan yapı) içine alan örnek bölgeler), omurilik, mide, ince ve kalın bağırsak (Peyer parçalarını kapsar), karaciğer, böbrekler, adrenaller, dalak, kalp, timüs, tiroid, trake ve akciğerler (sabitleyiciyle şişirilip sonra batırılarak muhafaza edilirler), yumurtalıklar, yardımcı cinsiyet organları (örnegin rahim, prostat), mesane, lenf düğümleri (tercihen bir lenf düğümü uygulama yolunu kapsarken ve diğeri, uygulama yolundan uzak olan, sistemik etkileri kapsar) çevresel sinir (siyatik (kalça kemiğine ait) veya tibial (kaval kemiğine ait)) tercihen kasa oldukça yakın ve kemik iliğinin bir bölümü (veya alternatif olarak aspire edilerek yeni hazırlanmış kemik iliği). Klinik ve diğer bulgular ilave dokuların da incelenmesi gerektiğini gösterebilir. Test maddesinin bilinen özelliklerine dayanılarak, hedef organ olduğu düşünülen organlar da ayrıca muhafaza edilmelidir.
Tam histopatoloji, kontrol ve yüksek doz grubundaki tüm hayvanların korunmuş organ ve dokulara uygunlanır. Yüksek doz grubunda uygulamaya bağlı değişiklikler gözlenirse, bu incelemeler diğer tüm doz gruplarındaki hayvanlara yapılmalıdır. Bütün büyük lezyonlar incelenmelidir.
Veriler ayrı ayrı alınmalıdır. İlaveten, bütün veriler her bir test grubu için testin başındaki hayvan sayısını, test sırasında ölü bulunan ve insani nedenlerle öldürülen hayvan sayısını ve bu ölümlerin/öldürülmelerin zamanları, toksisite belirtileri gösteren hayvan sayısını, gözlenen toksisite belirtilerinin tanımlarını başlangıç zamanını, toksik etkilerinin süresini ve ciddiyeti, hayvanların görüldüğü lezyon sayısı, lezyonların türü ve her bir lezyona sahip hayvan yüzdesi gösteren tablo halinde özetlenmelidir. Mümkünse, rakamsal sonuçlar uygun ve genel kabul görmüş istatistiksel yöntemlerle değerlendirilmelidir. İstatistiksel yöntemler çalışmanın oluşturulması sırasında belirlenmelidir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir: Test hayvanları:
Test koşulları:
Sonuçlar:
Sonuçların Tartışılması. Sonuçlar
Bu yöntem OECD TG 407’ye eşdeğerdir. B.8 TEKRARLI DOZ (28 GÜNLÜK) TOKSİSİTESİ (SOLUNUMLA)
Maddenin partikül büyüklüğü dağılımı, buhar basıncı, erime noktası, kaynama noktası, parlama noktası ve varsa patlayıcılığı hakkında önceden bilgi sahibi olmak faydalıdır. Ayrıca Bölüm B Genel Giriş(A)’ya bakınız.
Bölüm B Genel Giriş(B)’ye bakınız.
Yok.
Test edilecek madde çeşitli gruplardaki deney hayvanlarına günlük olarak kademeli konsantrasyonlarda, grup başına bir konsantrasyon olacak şekilde 28 gün boyunca uygulanır. Test maddesinin test ortamında uygun konsantrasyonlarda olmasına yardımcı olmak için bir taşıyıcının kullanıldığı durumlarda, taşıyıcı kontrol grubu da olmalıdır. Uygulama süresince, toksisite belirtilerinin belirlenmesi için hayvanlar her gün gözlenir. Test sırasında ölen hayvanlara ve test sonunda hayatta kalan deney hayvanlarına otopsi yapılır.
Yok
Hayvanlar deneyden en az beş gün öncesinden itibaren deneysel barınma ve beslenme koşullarında muhafaza edilirler. Test öncesinde, sağlıklı, genç, hayvanlar rasgele ve gerek duyulan grup sayılarına göre ayrılırlar. İhtiyaç duyulan durumlarda, test maddesine, test maddesinin test ortamında uygun konsantrasyonlarda olması için uygun bir taşıyıcı ilave edilebilir ve sonrasında taşıyıcı kontrol grubu da kullanılmalıdır. Doz uygulamasını kolaylaştırmak için taşıyıcı veya başka katkı maddeleri kullanılacaksa, bu maddelerin toksik etki göstermemelerinin gerektiği bilinmelidir. Uygunsa geçmişe yönelik veriler kullanılır.
Beklenmedik belirtiler görülmedikçe tercih edilen tür sıçandır. Yaygın olan laboratuvar suşları kullanılmalıdır. Deneyin başında, hayvanlardaki ağırlık değişim aralığı her iki cinsiyet için de, uygun ortalama değerin + % 20’sini geçmemelidir.
Her bir test grubu için en az 10 hayvan (5 erkek ve 5 dişi) kullanılmalıdır. Eğer dişiler kullanıyorsa doğum yapmamış olmaları ve hamile olmamaları gerekmektedir. Arada da hayvan öldürülmesi planlanıyorsa, hayvan sayısı çalışma tamamlanmadan önce öldürülmesi planlanan hayvan sayısı kadar artırılmalıdır. Ayrıca, 10 hayvandan oluşan ikincil bir test grubu (cinsiyet başına beş hayvan) 28 gün boyunca yüksek konsantrasyon düzeyine maruz bırakılabilir ve uygulama sonrasındaki 14 gün içinde toksik etkilerinin tersinirliği, kalıcılığı veya gecikmiş olarak meydana gelme durumu için gözlemlenebilir. 10 kontrol hayvanından oluşan ikincil bir test grubu (cinsiyet başına 5 hayvan) ayrıca kullanılır.
Kontrol veya taşıyıcı bir kontrolle birlikte en az üç konsantrasyon değerine ihtiyaç duyulur. Taşıyıcı kullanılmışsa, taşıyıcının konsantrasyonu en yüksek olmalıdır. Test maddesi uygulanacak olanlar haricinde kontrol grubunda yer alan hayvanlar test grubundaki hayvanlarla eşit koşullarda tutulmalıdırlar. En yüksek konsantrasyonda toksik etkiler görülmeli ancak ölüm ya çok az sayıda gözlenmeli ya da gözlenmemelidir. En düşük konsantrasyonda, herhangi bir toksisite belirtisine rastlanmamalıdır. İnsan maruz kalımıyla ilgili kullanılabilir bir tahmin olduğu durumda, en düşük konsantrasyon bunu geçmelidir. İdeal olarak, ara konsantrasyonun en az seviyede gözlenebilir toksik etkisi oluşturması gerekir. Eğer birden fazla ara konsantrasyon kullanılmışsa, konsantrasyonlar dereceli toksik etki oluşturacak şekilde yer almalıdır. Düşük ve ara doz seviyeli gruplarla kontrol grubunda görülen ölüm sıklığı sonuçların anlamlı olarak değerlendirilmesini sağlayacak en az düzeyde olmalıdır.
Günlük maruz kalma süresi 6 saat olmalıdır fakat diğer süreçler özel gereklilikleri karşılamasına ihtiyaç duyabilirler.
Hayvanlar, yeterli oksijen içeriği ve eşit olarak dağılmış maruz kalma atmosferini temin etmek için saat başına en az 12 hava değişikliği yapan dinamik hava akışı sağlamak amacıyla tasarlanmış soluma donanımıyla test edilmelidirler. Bu amaçla test hayvanların sıkışmaması ve test maddesine solunum yoluyla maruz kalmaları için tasarlanmış bir odacık kullanılmıştır. Genel bir kural olarak, odacığın atmosferinin kararlılığını sağlamak amacıyla test hayvanlarının toplam ‘hacimleri’ test odacığının hacminin % 5’ini geçmemelidir. Odacıktaki ayrı ayrı, ağız burun yolu, sadece baş veya tüm beden, maruz kalmaları kullanılabilir, ilk ikisi test maddesinin başka yollarla alımını azaltmaya yardımcı olur.
Deney hayvanları toksisite belirtileri için uygulama ve iyileşme süresi boyunca günlük olarak gözlenmelidir. Toksisite belirtilerinin ortaya çıktığı ve kaybolduğu zamanlarla ölüm zamanları kaydedilmelidir.
Hayvanlar test maddesine 28 gün boyunca haftada beş-yedi gün arası, günlük olarak maruz kalırlar. Herhangi bir ikincil test grubunda yer alan ve aşağıda belirtilen gözlemler için planlanan hayvanlar uygulama yapılmadan ilave olarak 14 gün daha tutulmalılar ve toksik etkilerin iyileşmeleri veya kalıcılıkları tespit edilmelidir. Testin uygulandığı sıcaklık 22 ±3 °C olmalıdır. İdeal olarak bağıl nem oranı da % 30 ve %70 arasında olmalıdır, fakat bazı aerosollerin (askıda bulunan sıvı damlacıklarının) testleri gibi belli örneklerde bu durum uygulanabilir olmayabilir. Odacığın içindeki önemsiz derecede negatif basınç (≤ 5 mm su) test maddesinin çevreleyen alanın içine sızmasını engeller. Gıda ve su maruz kalma süresince esirgenmelidir. Uygun bir analitik konsantrasyonlu kontrol sistemi bulunduran bir dinamik solunum sistemi kullanılmalıdır. Uygun maruz kalma konsantrasyonunu sağlamak için deneme testi tavsiye edilir. Hava akışı, maruz kalma süresince koşulların homojen olmasını sağlayacak şekilde ayarlanmalıdır. Sistem kararlı maruz kalma koşullarına mümkün olduğunca çabuk ulaşmasını sağlamalıdır. Aşağıda belirtilen ifadelerin ölçüm veya kontrolleri yapılmalıdır: (a) hava akışının hızı (sürekli); (b) test maddesinin nefes alma bölgesindeki mevcut konsantrasyonunun ölçümü Maruz kalma süresi boyunca konsantrasyon, ortalama değerin ± %15’inden daha fazla değişkenlik göstermemelidir. Ancak bazı aerosollerin söz konusu olduğu durumlarda, bu şekilde seviye kontrollerinin yapılması mümkün olmayabilir, bu durumda daha geniş bir aralık kabul görür. Çalışmanın toplam süresi boyunca, günden-güne uygulanan konsantrasyonlar olabildiğince sabit olmalıdır. Aerosoller için test grubu başına haftada en az bir partikül büyüklüğü analizi yapılmalıdır. (c) sıcaklık ve nem (mümkünse sürekli). Maruz kalma sırasında ve maruz kalmayı takiben gözlem yapılır ve yapılan gözlemler sistematik olarak kaydedilir. Kayıtlar her bir hayvan için ayrı ayrı tutulmalıdır. Tüm hayvanlar günlük olarak gözlenmeli ve başlangıç zamanını da içeren toksisite belirtileri, dereceleri ve süreleri kaydedilmelidir. Gözlemler cilt ve tüylerdeki, gözlerdeki, mukoz membranlardaki, solunum, dolaşım, otonom ve merkezi sinir sistemindeki değişikliklerle somatomotor aktivite ve davranışlarındaki değişikliklerini kapsamalıdır.Hayvanların ağırlık ölçümleri haftalık olarak yapılmalıdır. Ayrıca gıda tüketiminin de haftalık olarak ölçülmesi tavsiye edilir. Hayvanların birbirlerini yemeleri, dokuların otolizi veya yanlış yerleştirme gibi nedenlerle kaybedilmediklerinin ispat edilmesi için düzenli olarak gözlenmesi gereklidir. Çalışma süresi sonunda uygulama grubundaki sağ kalan tüm hayvanlara otopsi yapılır. Ölmek üzere olan, acı ve ağrı çeken hayvanlar farkına varıldığında uzaklaştırılmalı, insanca öldürülmeli ve hayvanlara otopsi yapılmalıdır. Aşağıdaki incelemeler kontrol grupları da dâhil edilerek tüm hayvanlara testin sonunda uygulanır: (i) hematoloji, hematokrit hemoglobin konsantrasyonu, eritrosit sayısı; toplam ve türevsel lökosit sayısı ve pıhtılaşma potansiyelinin ölçümü dâhil olmalıdır; (ii) klinik kan biyokimyası karaciğer ve böbrek fonksiyonlarından en az birini içine alır: serum alanin aminotransferaz (geçmişte glutamik piruvik transaminaz olarak bilinir), serum aspartat aminotransferaz (geçmişte glutamik okzaloasetik transaminaz olarak bilinir), üre azotu, albumin, kanda kreatinin, toplam bilirubin ve toplam serum protein ölçümleri; Yeterli toksikolojik değerlendirmeler için gerekli olabilecek diğer belirlemelere kalsiyum, fosfor, klorür, sodyum, potasyum, lipitlerin analizi, açlık glikoz analizi, hormonlar, asit/baz dengesi, methemoglobin ve kolinesteraz aktivitesi dahildir. Gerekli yerlerde gözlenen toksik etkilerin araştırmasını genişletmek için ilave klinik biyokimya uygulamaları yapılabilir.
Çalışmadaki bütün hayvanlara tam kapsamlı otopsi yapılmalıdır. En az karaciğer, böbrekler, adrenaller, akciğerler ve testis parçalara ayrıldıktan sonra kurumasından olabildiğince kaçınılarak ıslak ağırlıkları tartılmalıdır. Organlar ve dokular (soluk borusu, karaciğer, böbrekler, dalak, testis, adrenaller, kalp ve büyük doku bozuklukları olan herhangi bir organ veya büyüklükteki değişiklikler) olası histopatolojik inceleme için uygun bir ortamda muhafaza edilmelidir. Akciğerler, eksiksiz alınmalı, tartılmalı ve akciğer yapısını elde etmek için uygun bir saptayıcı ile muamele edilmelidir.
Yüksek konsantrasyon grubuyla kontrol grubunda, muhafaza edilmiş organ ve dokularda histopatolojik inceleme yapılmalıdır. En yüksek dozdaki test maddesinin zarar verdiği organlar, daha düşük dozların verildiği gruplarda incelenmelidir. Herhangi bir ikincil test grubundaki hayvanlar, diğer muamele gruplarında etki gösterdiği teşhis edilen bu organ ve dokulara özel önem gösterilerek histolojik olarak incelenmelidir.
|