FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- B.27. SUB-KRONİK ORAL TOKSİSİTE TESTİ KEMİRGENLER DIŞINDA 90 – GÜN TEKRARLI DOZ ORAL TOKSİSİTE ÇALIŞMASI YÖNTEM
- VERİLER VE RAPORLAMA
VERİLER VE RAPORLAMA
Her bir veri ayrı ayrı sağlanmalıdır. İlaveten bütün veriler her test grubu için testin başındaki hayvan sayısını, test sırasında ölen veya insani gerekçelerle öldürülen hayvan sayısını, toksisite belirtisi gösteren hayvan sayısını, gözlenen toksisite belirtilerinin tanımlarını-başlama zamanı,, süreklilik ve herhangi bir toksik etki için önem içermeli- lezyonları olan hayvan sayısını, lezyonların türünü ve herbir lezyon için hayvan yüzdesini gösteren çizelge halinde özetlenmelidir. Uygulanabilir olduğunda sayısal sonuçlar uygun ve genellikle kabul görmüş istatistiksel yöntemlerle değerlendirilmelidirler. İstatistiksel yöntemler ve analiz edilecek veriler çalışmanın tasarlanması sırasında seçilmelidir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Sonuçların tartışılması Yorumlar
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. (2) Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003. (3) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704. (4) Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, 267-283. (5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, 233-236. (6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609. (7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). "Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies", Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198-201.
Bu sub-kronik oral toksisite test yöntemi OECD TG 409 (1998)’e eşdeğerdir.
Kimyasalın toksik özelliklerinin değerlendirilmesinde, tekrarlı dozlar verilerek sub-kronik oral toksisite belirlenmesi, akut veya 28-gün tekrarlı doz toksisite testlerinden kimyasalın toksisitesi hakkında başlangıç bilgisi elde edildikten sonra yapılmalıdır. 90 günlük çalışma sütten kesilme sonrası olgunlaşmayı ve erişkinliğe geçişi içine alan uzamış bir zaman aralığının da üstünde tekrarlı maruz kalmadan kaynaklanabilecek olası sağlık tehlikeleriyle ilgili bilgi sağlar. Çalışma başlıca toksik etkileri hakkında bilgi sağlayacak, hedef organlara ve birikim olasılığına işaret eder ve kronik çalışmalar için doz seviyelerinin belirlenmesinde ve insan maruz kalmasında güvenlik kriterlerinin oluşturulmasında kullanılan hiçbir olumsuz etkinin gözlenmediği dozun tahmin edilmesini sağlar. Bu yöntem, kimyasal maruz kalmasının kemirgen olmayan türlerdeki olumsuz etkilerinin belirlenmesine olanak sağlar ve sadece, –diğer çalışmalarda gözlenen etkilerin, kemirgen olmayan ikinci bir türde netleştirilmesi/tanımlanması gerektiğine işaret ettiği durumlarda, veya – toksikokinetik çalışmalarının kemirgen haricinde özgün bir türün en uygun laboratuvar hayvanı olduğunu gösterdiği durumlarda veya –kemirgen olmayan türlerin kullanılmasını tanımlayan diğer özel nedenlerin olduğu durumlarda, kullanılmalıdır. Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Doz: Uygulanan test maddesinin miktarıdır. Doz, ağırlık (g, mg) veya test hayvanının birim ağırlığı başına düşen test maddesi ağırlığı (örneğin, mg/kg) veya sabit diyet derişimi olarak (ppm) ifade edilir. Dozaj: doz, doz frekansı ve doz uygulanma süresini içine alan genel ifadedir. NOAEL: Olumsuz etkinin gözlemlenmediği seviye.
Test maddesi deney hayvanlarının muhtelif gruplarına oral yolla kademeli dozlarla, grup başına bir doz olacak şekilde, 90 gün boyunca uygulanır. Uygulama süresi boyunca hayvanlar toksisite belirtileri için yakından gözlenirler. Test sırasında ölen ya da öldürülen hayvanlara otopsi yapılır, ayrıca testin sonunda sağ kalan hayvanlar da öldürülerek onlara da otopsi yapılır.
Yaygın olarak kullanılan, tanımlı bir cinse ait olanve kemirgen olmayan tür köpektir, tazıda sıkça kullanılır. Diğer türler, örneğin, domuz ailesi, küçük domuz türleri ayrıca kullanılabilir. Primatlar tavsiye edilmez ve kullanımları gerekçelendirilmelidir. Genç, sağlıklı hayvanlar kullanılmalıdır ve köpek kullanılan durumlarda doz uygulamaları tercihen hayvan 4-6 aylıkken ve 9 aylığı geçmeden yapılmalıdır. Çalışmanın daha uzun süreli kronik bir çalışmanın ön çalışması olduğu durumlarda her iki çalışmada da aynı tür/cins kullanılmalıdır.
Laboratuvar koşullarına en az 5 gün uyum sağlamış ve daha önceden deneysel işlemlere maruz kalmamış sağlıklı hayvanlar kullanılmalıdır. Uyum süresi seçilen test hayvanlarının tür ve kaynağına bağlıdır. Köpekler veya yerleşik bir koloniden domuz yavrularının çoğaltılması amacıyla, en az 5 gün ve yine bu hayvanlar için eğer dış kaynaklar söz konusuysa iki hafta tavsiye edilmektedir. Test hayvanları tür, ırk, kaynak, cinsiyet, ağırlık ve/veya yaşlarına göre tanımlanmalıdır. Hayvanlar rastgele kontrol ve uygulama gruplarına ayrılırlar. Kafesler, yerleştirilmelerinden meydana gelebilecek olası etkiler en aza indirilecek şekilde ayarlanmalıdır. Her hayvana kendisine özgü bir kimlik numarası verilir.
Test maddesi sonda ile besin, içme suyu veya kapsülle uygulanabilir. Oral yolla uygulama yötemi, bu çalışmanın amacına ve test maddesinin fiziksel/klimyasal özelliklerine bağlıdır. Gerekli yerlerde test maddesi uygun bir taşıyıcı içinde çözünebilir veya askıda kalabilir. Gerekli olduğunda test maddesi çözülür veya uygun bir taşıyıcıda askıda kalır. Uygun olan her yerde öncelikle sulu çözelti/süspansiyon kullanımı tavsiye edilir, bunu yağda (ör.mısır yağı) çözelti/emülsiyon (dağılma şeklinde) kullanımı ve diğer taşıyıcılardaki olası çözelti kullanımı izler. Su dışındaki taşıyıcıların toksik özellikleri bilinmelidir. Test maddesinin uygulama koşullarındaki kararlılığı belirlenmelidir.
Her bir doz için en az 8 hayvan (dört dişi ve dört erkek) kullanılmalıdır. Arada yaşamlarını sonlandırma planlanmıyorsa, çalışma tamamlanmadan önce sağ kalımı planlanan hayvan sayısı artırılmalıdır. Çalışmanın sonundaki hayvan sayısı toksik etkilerin anlamlı bir değerlendirilmesinin yapılabilmesi için uygun sayıda olmalıdır. Bir kimyasal ya da yakın bir benzeri ile ilgili daha önceki bilgilere dayanılarak, muamele süresi sonrasında toksik etkilerin tersinirlikleri veya kalıcılıklarının gözlenebilmesi için kontrol ve en yüksek doz grubu için 8 (cinsiyet başına dört) hayvandan oluşan ilave bir uydu grubun yer alması üzerinde düşünülmelidir. Muamele sonrasındaki bu sürenin uzunluğu gözlenen etkilere bağlı olarak uygun şekilde sabitlenmelidir.
Sınır testinin yürütüldüğü durumlar haricinde (bakınız 1.5.3), en az üç doz ve eş zamanlı kontrol kullanılır. Doz seviyeleri tekrarlı doz veya aralık bulma çalışmalarının sonuçlarına dayanabilir. Test bileşiğinin veya ilgili materyallerin metabolizması veya toksikokinetiğiyle ilgili ilave bilgiler de dikkate alınmalıdır. Test maddesinin fizikokimyasal doğası veya biyolojik etkileri tarafından sınırlanmadıkça, seçilecek en yüksek doz toksisiteyi uyarmalı fakat ölüm ve şiddetli rahatsızlıkları uyarmamalıdır. Doz seviyelerinin azalan dizisi dozaja bağlı cevabı veya olumsuz etkinin gözlemlenmediği en düşük düzeyi (NOAEL) gösterecek şekilde seçilmelidir. İki –dört katlı aralıklar azalan doz seviyeleri için genelde en uygun olanıdır. Dördüncü bir test grubunun ilave edilmesi doz grupları arasında geniş aralıklar kullanılmasına (ör. 6-10 kattan daha fazla) genellikle tercih edilir. Kontrol grubu, muamele edilmemiş bir kontrol grubu olmalı veya test maddesi uygulanırken taşıyıcı kullanılmışsa taşıyıcı-kontrol grubu olmalıdır. Test maddesiyle muamele edilenler hariç, kontrol grubundaki hayvanlar test grubundakilerle benzer şekilde muamele edilmelidir. Eğer taşıyıcı kullanılmışsa, kontrol grupları taşıyıcıyı kullanılan en yüksek miktarda alır. Eğer test maddesi diyetle uygulanır ve gıda alımının azalmasına neden olursa, o zaman çift-besleme kontrol grubunun kullanılması test modelindeki toksikolojik değişikliklere bağlı azalmaların ayırt edilmesi için faydalı olabilir. Taşıyıcı ve diğer katkı maddelerinin absorpsiyon, dağılım, metabolizma veya test maddesinin alıkonması üzerindeki etkiler, test maddesinin zehirli özelliğini değiştirebilecek olan kimyasal özellikleri üzerine etkiler veya gıda ve su tüketimi veya hayvanların beslenme durumu üzerine etkiler gibi özelliklerinin üzerinde durulmalıdır.
Bir test tek bir dozda, en az 1000 mg/kg vücut ağırlığı/gün’e eşdeğer, çalışma için tanımlanan yöntemler kullanılarak, hiçbir olumsuz etkinin gözlenmediği durum meydana geliyorsa ve yapısal olarak benzer maddelerle ilgili verilere dayanılarak toksisite beklenmiyorsa, o zaman üç doz kullanılarak yürütülen tam bir çalışmanın yapılmasına gerek duyulmayabilir. Sınır testi, insan maruz kalımının daha yüksek bir dozun kullanılması gerekliliğine işaret ettiği durumlar haricinde uygulanır.
Hayvanlar test maddesiyle 90 gün boyunca haftanın her günü muamele edilerek doza maruz bırakılırlar. Başka bir doz kürü, örneğin haftada beş gün, kullanılacaksa tanımlanmaya ihtiyaç duyulur. Test maddesinin sonda ile uygulandığında tek doz halinde, gavaj yöntemi kullanılarak veya uygun entübasyon kanülüyle (bir elastik boru enjeksiyonu) kullanılarak yapılmalıdır. Tek seferde uygulanabilen maksimum sıvı hacmi, test hayvanının büyüklüğüne bağlıdır.Hacim olabildiğince küçük tutulmalıdır. Normalde daha yüksek derişimlerde daha kötü etkiler meydana getiren tahriş edici ve aşındırıcı maddeler haricindeki maddeler için derişimin tüm doz seviyelerinde sabit olacak şekilde ayarlanmasıyla test hacmindeki değişkenlilik en aza indirilmelidir. Diyet veya içme suyuyla uygulanan maddeler için, test maddesi içeriğinin hiçbir miktarlarının normal beslenme veya su dengesiyle etkileşmediğinden emin olmak gerekir.. Test maddesi ya sabit diyet konsantrasyonu (ppm) ya da hayvanların vücut ağırlığı üzerinden kullanılabilen sabit doz olarak uygulandığında, kullanılan alternatif belirtilmelidir. Sonda ile uygulanan maddeler için, doz her gün yakın saatlerde verilmelidir ve hayvan vücut ağırlığına dayanarak sabit doz elde etmek için gerektiği şekilde ayarlanmalıdır. 90-günlük bir çalışma uzun süreli bir kronik toksisite çalışmasının hazırlık aşaması olarak kullanılıyorsa, her iki çalışmada da benzer diyetler kullanılmalıdır.
Gözlem süresi en az 90 gün olmalıdır. İkincil gruptaki takip eden gözlemler için planlanan hayvanlar uygun bir süre daha herhangi bir muamele yapılmadan, kalıcı toksik etkiler veya toksik etkilerin düzelme durumu için gözlem altında tutulmalıdır. Genel klinik gözlemler, günde en az bir defa tercihen günün aynı saatlerinde ve doz uygulamasından sonraki beklenen etkilerin pik süreleri göz önünde bulundurularak yapılmalıdır. Hayvanların klinik koşulları kaydedilmelidir. Günde en az iki defa, genellikle çalışmanın başında ve sonunda, tüm hayvanlar hastalık ve ölüm belirtileri açısından incelenirler. İlk maruz kalmadan önce bir defa (karşılaştırılmalarına olanak sağlar) ve daha sonra da haftada en az bir defa, tüm hayvanlara detaylı klinik gözlemler yapılmalıdır. Bu gözlemler kafeslerin dışındaki standart bir ortamda tercihen her seferinde aynı saatlerde yapılmalıdır. Gözlemler dikkatlice, test uygulama laboratuvarı tarafından açıkça anlatılan skorlama sistemleri kullanılarak kaydedilmelidir. Test koşullarındaki değişimlerin en az olması ve gözlemlerin gözlemciler tarafından yapıldığının teyid edilmesi için çaba gösterilmelidir. Not alınan belirtiler ciltteki, kürkteki, gözlerdeki, mukoz membranlardaki değişiklikleri, salgılama başlaması, atılım ve otonomik aktiviteyi (lakrimasyon, piloereksiyon, gözbebeği büyüklüğü, solunumla ilgili olağan dışı durumlar) içermeli ancak bunlarla sınırlı olmamalıdır.Yürüyüşteki değişiklik, duruş ve klonik veya tonik hareketlerin varlığı yanında dokunmaya cevap, stereotipler (aşırı tımarlanma, rutin olarak kendi etrafında dönme) veya tuhaf davranışı (örneğin: kendini sakatlama, geriye doğru yürüme) ayrıca kaydedilmelidir (1). Oftalmoskop(göz kontrolü için kullanılan cihaz) ve eşdeğeri uygun bir alet kullanılarak yapılan oftalmolojik (göz muayenesine dayanan) incelemeler test maddesine maruz kalmadan önce ve çalışma sonlandırılırken, tercihen tüm hayvanlara en azından yüksek doz ve kontrol grubundakilere yapılmalıdır. Gözlerde değişikliğe rastlanırsa, tüm hayvanlar incelenmelidir.
Bütün hayvanlar en az bir hafta önce tartılmalıdırlar. Gıda ve su tüketimiyle ilgili ölçümler en az haftada bir yapılmalıdır. Test maddesi içme suyuyla uygulanıyorsa, su tüketimi ayrıca en az haftada bir yapılmalıdır. Su tüketimi ayrıca içme aktivitesinin değiştiği beslenme veya gavaj çalışmalarında da göz önünde bulundurulmalıdır.
Uygulanabiliyorsa kan örnekleri, uygun koşullar altında adı belirtilen bölgeden alınmalı ve saklanmalıdır. Test süresinin sonunda kan örnekleri hayvanların öldürülmelerinden hemen önce ya da öldürme işleminin bir parçası olarak alınırlar. Hematokrit, hemoglobin derişimi, eritrosit sayımı, toplam ve türevsel (farklılaşmış) lökosit sayımını içeren hematolojik incelemeler ve protrombin süresi veya tromboplastin süresi gibi bir pıhtılaşma potansiyeli ölçümü çalışmanın başında araştırılmalıdır, daha sonra test süresi boyunca aylık aralıklarla ya da testin ortasında, ve sonuç olarak test süresinin sonunda yapılmalıdır. Dokulardaki, özellikle de böbrek ve karaciğerdeki, temel toksik etkileri araştırmak için test süresi boyunca testin başında, sonra aylık aralıklarla veya testin ortasında ve sonuç olarak testin sonunda alınan kan örneklerinde klinik biyokimya tayinleri yapılmalıdır. Üzerinde durulacak test alanları, elektrolit dengesi, karbonhidrat metabolizması ve karaciğer ve böbrek fonksiyonlarıdır. Özel testlerin seçimi test maddesinin etki şekliyle ilgili gözlem sonuçlarından etkilenir. Hayvanlar kan örnekleri alınmadan önce türe uygun bir süre için aç bırakılmalıdırlar. Önerilen tayinler kalsiyum, fosfor, klorür, açlık şekeri, alanin aminotransferaz, aspartat aminotransferaz, ornitin, dekarboksilaz, gama glutamil transpeptidaz, üre, azot, albümin, kan kreatini, toplam bilirubin ve toplam serum proteini ölçümlerini içermektedir. Üriner analiz belirlemeleri çalışmanın en azından başında, sonra ortasında ve nihayet sonunda zamana bağlı idrar hacmi toplamı kullanılarak yapılmalıdır. Üriner analiz tayinleri, görüntü, osmolite veya özgül ağırlık, pH, protein, glikoz ve kan/kan hücreleri tayinlerini içerir. İlave olarak, gözlenen etkilerin araştırılmasını genişletmek için gerekliyse ek parametreler de çalışılabilir. Genel doku hasarlarının serum göstergelerini araştırmak için de çalışmalar yapılmalıdır. Toksikolojik değerlendirme için gerekli olan diğer tayinler lipitler, hormonlar, asit/baz dengesi, metahemoglobin ve kolinesteraz inhibisyonunu içermektedir. Gözlenen etkilerin araştırılmasını genişletmek için gerekliyse ek klinik biyokimya incelemeleri yapılabilir. Bunlar, belli sınıftaki kimyasalların duruma göre tanımlanmasına ihtiyaç duyarlar. Sonuç olarak, türlere ve verilen bir maddenin gözlenen ve/veya beklenen etkisine bağlı olarak esnek bir yaklaşıma ihtiyaç vardır.
Çalışmadaki bütün hayvanlara tam teşekküllü otopsi yapılmalıdır. Buna, vücudun dış yüzeyindeki tüm orifislerin, kafatası, göğüs ve karın boşluklarının ve bunların içeriklerinin incelenmesi dâhildir. Tüm hayvanların karaciğer ve safra kesesi, böbrekler, adrenaller, testis, epididimis, yumurtalıklar, mesane, tiroit (paratiroitle birlikte), timus, dalak, beyin ve kalbi (ölmek üzere bulunanlar ve/veya çalışma esnasında öldürülenlerden başka) yapışık dokulardan ayrılmalı, parçalara ayrıldıktan sonra kurumasından olabildiğince kaçınılarak ıslak ağırlıkları tartılmalıdır. Aşağıdaki dokular her iki doku tipi için de uygun sabitleyici ortamda muhafaza edilmelidir. Sonrasında bütün büyük lezyonların, beyin (tipik bölgeler- medulla/pons, serebrum, serebellum), omurilik (üç düzeyde – boyna ait(servikal) orta göğüs(mid-torasik) ve lumbar), hipofiz, tiroit/paratiroit, timus, özofagus, tükrük salgıları, mide, ince ve kalın bağırsak (Peyer plakları dâhildir), karaciğer, pankreas, böbrekler, böbreküstü bezi, dalak, kalp, soluk borusu, akciğerler aort, yumurtalıklar, mesane, yardımcı cinsiyet organları, dişi meme bezi, prostat, idrar torbası, safra kesesi, lenf nodülleri (tercihen bir lenf nodülü uygulama planını kapsar, diğeri ise uygulama yolundan uzakta, sistemik etkileri kapsar), periferal sinir (siyatik veya tibiyal) tercihen kasa oldukça yakın kemik iliği kesiti (ve/veya taze kemik iliği aspiratı ) ve deri. Histopatolojik incelemelerinin yapılması istenir. Klinik ve diğer bulgular başka dokuların da incelenmesi gerektiğini önerebilir. Ayrıca, test maddesinin bilinen özelliklerine dayanılarak hedef organ olabileceği düşünülen herhangi bir organ muhafaza edilmelidir.
Yüksek doz grubunun ve kontrol grubunun muhafaza edilen organ ve dokularda histopatolojik incelemeler yapılmalıdır. Yüksek doz grubunda muameleye bağlı değişikliler gözlenirse, bu incelemeler diğer dozaj gruplarına ait hayvanlara da yapılmalıdır. Bütün büyük lezyonlar incelenmelidir. İkincil izleme grubu kullanılıyorsa, muamele edilen gruplarda etki gözlendiği belirlenen organların histopatolojik incelemeleri yapılmalıdır.
Her bir veri ayrı ayrı sağlanmalıdır. Bütün veriler her test grubu için testin başındaki hayvan sayısını, test sırasında ölen veya insani gerekçelerle öldürülen hayvan sayısını, toksisite belirtisi gösteren hayvan sayısını, gözlenen toksisite belirtilerinin tanımlarını- yaraları olan hayvan sayısını, yaraların türünü ve herbir yara için hayvan yüzdesini gösteren çizelge halinde özetlenmelidir. Mümkünse sayısal sonuçlar uygun ve genellikle kabul görmüş istatiksel yöntemlerle değerlendirilmelidirler. İstatistiksel yöntemler ve analiz edilecek veriler çalışmanın tasarlanması sırasında seçilmelidir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Sonuçların tartışılması. Yorum. Yüklə 5,29 Mb. Dostları ilə paylaş:
|