FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

VERİLER

1. 
   Sonuçların uygulanması
   

Veriler, muamele edilmiş ve kontrol kültürleri için sitotoksisite ve yaşayabilirlik belirlemelerini, koloni sayımlarını ve mutant frekanslarını içermelidir. L5178Y TK^+/- testinde pozitif cevap varsa, koloniler test maddesinin en az bir konsantrasyon değeri için (en yüksek konsantrasyon) ve negatif ve pozitif kontrollerde oluşturulan küçük ve büyük kolonilerin kriterlerine uygun şekilde sayılırlar. Hem küçük hem de büyük koloni mutantların molekül ve hücresel genetik özellikleri detaylı olarak araştırılmalıdır. (23)(24). TK^+/- testinde koloniler normal büyüme(büyük) ve yavaş büyüme (küçük) kolonilerinin kriterleri kullanılarak sayılırlar (25). En geniş genetik hasara sahip mutant hücrelerin ikiye katlanma zamanları uzamıştır ve bu yüzden küçük koloniler oluştururlar. Bu hasar tipik olarak genin tamamen kaybı ile hücre kromozomlarının gösterdiği türe has durum olarak görünen kromozom bozuklukları aralığında yer alır. Küçük koloni mutantlarının indüksiyonu büyük kromozom bozukluklarını indükleyen kimyasallarla ilişkilidir (26). Daha az etkilenen mutant hücreler ana babaya ait hücrelere benzer hızlarda büyürler ve büyük koloniler oluştururlar.

Sağkalım (bağıl klonlama verimlilikleri) veya bağıl toplam büyüme verilmelidir. Mutant frekansı, sağkalan hücrelerin sayısı başına düşen mutant hücrelerin sayısı olarak ifade edilmelidir.
Her bir kültür verisi ayrı ayrı sağlanmalıdır. Ek olarak, bütün veriler tablo halinde özetlenmelidir.
Net bir pozitif cevabın doğrulanmasına gerek yoktur. Belirsiz sonuçlar ilave testlerle, tercihen deneysel koşullar modifiye edilerek netleştirilmelidir. Negatif sonuçların vaka vaka doğrulanması gerekir. Negatif sonuçların teyit edilmesine gerek olmayan durumlarda, gerekçe sağlanmalıdır. Takip eden deneylerde çalışma parametrelerinin değişikliği, değerlendirilen koşulların aralıklarının genişletilmesi, üzerinde düşünülmelidir. Konsantrasyon aralıkları ve metabolik aktivasyon koşulları modifikasyon yapılabilecek çalışma parametreleri arasındadır.

2. 
   Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
   

Pozitif sonuç tayin etmek için konsantrasyona bağlı artış veya mutant frekansında çoğaltılabilir artış gibi, bazı kriterler vardır. Sonuçlar ilk önce biyolojik açıdan değerlendirilmelidir. İstatiksel yöntemler, test sonuçlarını değerlendirirken yardımcı olarak kullanılabilir. İstatiksel değer pozitif bir cevap için tek belirleyici etken olmamalıdır.

Sonuçları yukarıdaki kriterleri karşılamayan bir test maddesinin bu sistemde mutajenik olmadığı düşünülür.

Her ne kadar pek çok çalışma açıkça pozitif ya da negatif sonuçlar verecekse de, nadir durumlarda veri kümeleri test maddesinin aktivitesi hakkında net bir karar verilmesine engel olabilir. Sonuçlar deneyin tekrarlanma sayısından bağımsız olarak şüpheli ve belirsiz olabilir.

In vitro memeli hücresi gen mutasyon testinden elde edilen pozitif sonuçlar, test maddesinin kullanılan kültürlenmiş memeli hücrelerinde gen mutasyonlarını indüklediğine işaret eder. Tekrarlanabilir pozitif bir konsantrasyon-cevap en anlamlısıdır. Negatif sonuçlar test koşulları altında test maddesinin, kullanılan kültürlenmiş memeli hücrelerinde gen mutasyonlarını indüklemediğine işaret eder.

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:

Çözücü/Taşıyıcı

• 
  taşıyıcı/çözücü seçimi için gerekçe;
  
• 
  biliniyorsa, test maddesinin çözücü/taşıyıcı içindeki çözünürlüğü ve kararlılığı;
  

Hücreler:

• 
  hücrelerin kaynağı ve türü;
  
• 
  hücre kültürlerinin sayısı;
  
• 
  uygulanabiliyorsa, hücre pasajları sayısı;
  
• 
  uygulanabiliyorsa, hücre kültürü elde etme yöntemleri;
  
• 
  mikoplazmanın yokluğu;
  

Test koşulları:

• 
  konsantrasyonlar ve içerilen kültürlerin sayısının seçimi için gerekçe, örneğin mevcutsa, sitotoksisite verileri ve çözünürlük sınırlamaları;
  
• 
  ortamın bileşimi, CO2 konsantrasyonu ;
  
• 
  test maddesinin konsantrasyonu;
  
• 
  taşıyıcının ve eklenen test maddesinin hacmi;
  
• 
  inkübasyon sıcaklığı;
  
• 
  inkübasyon süresi;
  
• 
  muamele süresi;
  
• 
  muamele sırasındaki hücre yoğunluğu;
  
• 
  kabul edilebilirlik kriteri de dahil, metabolik aktivasyonsisteminin türü ve bileşimi;
  
• 
  pozitif ve negatif kontroller;
  
• 
  ekspresyon süresinin uzunluğu (ekilen ve altkültürlenen hücre sayısı ve besleme programı, eğer uygunsa dâhil edilir);
  
• 
  seçici ajanlar;
  
• 
  çalışmaların pozitif, negatif veya belirsiz olup olmadığının anlaşılma kriterleri
  
• 
  canlı ve mutant hücrelerin sayılarını belirtmek için kullanılan yöntemler.
  
• 
  büyüklüğü ve türü üzerinde durulan kolonilerin tanımları (uygunsa, “küçük” ve “büyük” koloni kriterleri de dâhildir).
  

Sonuçlar:

• 
  toksisite belirtileri,
  
• 
  çökelti belirtileri;
  
• 
  belirlenebiliyorsa, test maddesinin maruz kalma süresince ozmolalite ve pH verileri;
  
• 
  en az negatif ve pozitif kontroller için sayıldıysa koloni büyüklüğü;
  
• 
  küçük koloni mutantlarını L5178Y TK+/- sistemiyle tespit etmek için laboratuvarın uygunluğu, uygun yerlerde;
  
• 
  doz/cevap ilişkisi, mümkün yerlerde;
  
• 
  istatistiksel analiz, varsa;
  
• 
  eş zamanlı negatif (çözücü/taşıyıcı) ve pozitif kontrol verileri
  
• 
  tarihsel negatif (çözücü/taşıyıcı) ve pozitif kontrol verileri, aralıklar, ortalamalar ve standart sapmalarla birlikte
  
• 
  mutant frekansı.
  

Sonuçların tartışılması.

Sonuçlar.

4. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
   
2. 
   Chu, E.H.Y. and Malling, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.
   
3. 
   Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the Timidin Kinaz Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, 467-485.
   
4. 
   Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, 394-403.
   
5. 
   Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121-128.
   
6. 
   Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. And Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, 235-239.
   
7. 
   Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.
   
8. 
   Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, 225-251.
   
9. 
   Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, 17-36.
   
10. 
    Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O’Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135- 141.
    
11. 
    Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.
    
12. 
    Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.
    
13. 
    Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for the L5178Y/TK+/- - TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268.
    
14. 
    Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, pp. 66-101.
    
15. 
    Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.
    
16. 
    Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.
    
17. 
    Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, 61-108.
    
18. 
    Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173-215.
    
19. 
    Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, 175-177.
    
20. 
    Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
    
21. 
    Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.
    
22. 
    Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 795-801.
    
23. 
    Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Timidin Kinaz Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 51-55.
    
24. 
    Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorotimidin-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, 161-174.
    
25. 
    Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, 89-102.
    
26. 
    Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small- Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- -3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, 609-614.
    

B.18 DNA HASARI VE ONARIMI – MEMELİ HÜCRELERİNDE IN VITRO PROGRAMLANMAMIŞ DNA SENTEZİ

1. 
   YÖNTEM
   

1. 
   Giriş
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (A).

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

3. 
   Referans maddeler
   

Yok.

4. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Programlanmamış DNA Sentezi (Unscheduled DNA Synthesis, UDS) testi, kimyasal ve fiziksel ajanların sebep olduğu hasarlı bölgeyi içeren DNA uzantısının kesildikten ve uzaklaştırıldıktan sonra DNA onarım sentezini ölçer. Test, hücre döngüsünün S-fazında olmayan memeli hücrelerinin DNA’sına (trityumla işaretli timidinin (³H-TdR) birleştirilmesine dayanır. ³H-TdR alımı, muamele edilen hücre DNA’ larının otoradyografisiyle veya sıvı sintilasyon sayılmasıyla (Liquid Scintillation Counting, LSC) belirlenebilir. Kültürdeki memeli hücreleri birincil sıçan karaciğer dokusunu oluşturan hücreler kullanılmadığı sürece, dış kaynaklı metabolik aktivasyon sistemi olmadan test maddesiyle muamele edilirler. UDS ayrıca in vivo sistemlerde de ölçülebilir.

5. 
   Kalite kriterleri
   

Yok.

6. 
   Test yönteminin tanımlaması
   

Hazırlıklar

Test kimyasalları ve kontrol veya referans maddeler yetiştirme ortamında hazırlanmalı veya uygun taşıyıcılarda çözünmeli veya süspansiyon haline getirilmelidir ve daha sonra çalışmada kullanmak üzere yetiştirilme ortamında seyreltilmelidir. Taşıyıcının son konsantrasyonu hücrenin yaşayabilirliğini etkilememelidir.
Yöntemde, sıçan karaciğer dokusunu oluşturan hücreler, insan lenfositlerinin ilk kültürleri veya ( insan diploid fibroblastları (bağ dokusunun ana hücresi) gibi) yerleşik hücre dizileri kullanılabilir.
Hücreler uygun metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda test kimyasalına maruz kalmalıdırlar.
Test koşulları
Kültürlerin sayısı
Otoradyografi için en az iki ve LSC UDS belirlemeleri için altı (veya bilimsel olarak doğrulandığında daha az) hücre kültürü her bir deneysel nokta için gereklidir.
Negatif ve pozitif kontrollerin kullanımı
Metabolik aktivasyonile veya aktivasyon olmadan eş zamanlı pozitif ve negatif (muamele edilmemiş ve/veya taşıyıcı) kontroller her bir deneyde yer almalıdır.

Sıçan karaciğer hücresini oluşturan hücreler ile ilgili yöntem için, pozitif kontrollerin örnekleri 7,12- dimetilbenzantrasen (7,12- DMBA) veya 2-asetilaminofloren (2-AAF) içerir. Yerleşik olarak kullanılan hücre dizileri olduğu takdirde, 4-nitrokinolin-Noksit (4-NQO) metabolik aktivasyon olmadan yürütülen hem otoradyografik yöntem hem de LSC yöntemi için de pozitif kontrol örneğidir; N-dimetilnitrozamin metabolik aktivasyon sistemleri kullanıldığında pozitif kontrol bileşiğine bir örnektir.

Maruz kalma konsantrasyonları
Bir aralık üzerinde cevabını tanımlamak için test maddesinin yeterli çoklu konsantrasyonları kullanılmalıdır. En yüksek konsantrasyon bazı hücre üzerindeki zehirli etkileri ortaya çıkarmalıdır. Nispeten suda çözünmeyen bileşenler çözünürlük sınırına kadar test edilmelidirler. Suda serbestçe çözünen zehirli olmayan kimyasallar için, vaka vaka bakılarak test maddesinin bir üst test kimyasal konsantrasyonu belirlenmelidir.
Hücreler
Kültürlerin elde edilmesinde uygun çoğalma ortamı, CO₂ konsantrasyonu, sıcaklık ve nem sağlanması gerekir. Yerleşik hücre dizileri mikoplazma kontaminasyonu için düzenli olarak kontrol edilmelidir.
Metabolik aktivasyon
Bir metabolik aktivasyon sistemi birincil karaciğer dokusunu oluşturan hücre kültürleriyle birlikte kullanılmaz. Yerleşik olarak kullanılan hücre dizileri ve lenfositler uygun metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda test maddesine maruz bırakılırlar.
İşlem
Kültürlerin hazırlanması
Yerleşik hücre dizileri stok kültürlerden oluşturulurlar (örneğin Tripsinizasyonla veya çalkalayarak) uygun yoğunluktaki kültür kaplarının içine ekilir ve 37 °C derece sıcaklıkta inkübasyon yapılır.
Sıçan hepatositlerinin kısa dönemli kültürleri, uygun bir ortamda yeni ayrılmış karaciğer dokusunu oluşturan hücrelerin kendilerini büyüme yüzeyine tutturmalarıyla oluşturulur. İnsan lenfosit kültürleri uygun teknikler kullanılarak oluşturulur.
Kültürlerin test maddesiyle muamele edilmesi
Birincil sıçan karaciğer dokusunu oluşturan hücreler (hepatositler)
Yeni izole edilen sıçan hepatositleri ³H-TdR içeren bir ortamda uygun bir zaman süresince test maddesiyle muamele edilirler. Muamele sürecinin sonunda, ortam hücrelerden arındırılmalı, durulanmalı, sabitlenmeli ve kurutulmalıdır. Lamlar otoradyografik emülsiyona daldırılmalı (alternatif sıyırma filmleri kullanılabilir), maruz bırakılmalı, geliştirilmeli, boyanmalı ve sayılmalıdır.
Yerleşik hücre dizileri ve lenfositler
Otoradyografik teknikler: Hücre kültürleri ³H-TdR ile uygulamayı takiben uygun sürelerle test maddesine maruz bırakılırlar. Zaman, maddenin doğası, metabolize eden sistemlerin aktivitesi ve hücre tipleriyle ayarlanır. 3H-TdR, UDS piklerini tayin etmek için ya test maddesiyle eş zamanlı ya da test maddesine maruz kaldıktan sonraki birkaç dakika içinde ilave edilmelidir. İki işlem arasındaki seçim test maddesi ve ³H-TdR arasındaki olası etkileşimlerden etkilenecektir. UDS ve yarı-korunumlu (semi-consevative) DNA replikasyonunu ayırt etmek için örneğin arjinin eksikliği bulunan bir ortam kullanılarak, düşük serum içeriği veya kültür ortamındaki hidroksi üreyle daha sonra engellenebilir.
UDS’nin LSC ölçümleri: Test maddesiyle muamele edilmeden önce, hücrelerin S-fazına girmesi yukarıda tarif edildiği gibi baskılanmalıdır; hücreler otoradyografide tanımlandığı gibi test kimyasalına maruz kalmalıdırlar. İnkübasyon süresinin sonunda, DNA hücrelerden ekstrakte edilmemeli ve toplam DNA içeriği ve ³H-TdR uzantısı birlikte belirlenmelidir.

Yukarıdaki tekniklerde insan lenfositleri kullanıldığı zaman, yarı-korunumlu DNA eşleşmesinin baskılanmasının, uyarılmamış kültürlerde gereksiz olduğu not edilmelidir.

Analiz
Otoradyografik belirlemeler
Kültür hücrelerindeki UDS’yi belirlemek için, S-fazındaki çekirdekçik sayılmaz. Konsantrasyon başına en az 50 hücre sayılmalıdır. Lamlar sayılmadan önce kodlanmalıdır. Her bir lamdaki ayrı ayrı genişçe ayrılan alanlar sayılmalıdır. Sitoplâzmada birlikte bulunan ³H-TdR nin miktarı ve sayılan her hücrenin sitoplâzmasındaki üç çekirdek büyüklüğündeki alan sayılarak belirlenmelidir.
LSC belirlemeleri
Her bir konsantrasyonda ve LSC UDS tayinlerinin kontrollerinde, uygun sayıda kültür kullanılmalıdır.
Bütün sonuçlar bağımsız bir deneyle doğrulanmalıdır.

2. 
   VERİLER
   

Veriler çizelge halinde sunulmalıdır.

1. 
   Otoradyografik belirlemeler
   

³H-TdR birlikteliğinin sitoplâzmadaki uzantısı ve hücre çekirdeği üzerinde bulunan tohumların sayısı ayrı ayrı kaydedilmelidir.
Ortalama, medyan ve mod sitoplâzmadaki ³H-TdR birlikteliğinin uzantısının dağılımını ve çekirdek başına düşen tohumların sayısını tanımlamak için kullanılabilir.

2. 
   LSC belirlemeleri
   

LSC belirlemeleri için ³H-TdR birleşmesi dpm/µg DNA olarak rapor edilmelidir. Ortalama dpm/µg DNA standart sapmayla birlikte birleşmelerin dağılımını tanımlamak için kullanılır.

Veriler uygun istatistiksel yöntemler kullanılarak değerlendirilmelidir

3. 
   3. RAPORLAMA
   

1. 
   Test raporu
   

Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:

• 
  kullanılan hücreler, yoğunluk ve uygulama zamanındaki kısım numarası, hücre kültürlerinin sayısı,
  
• 
  ortam, sıcaklık ve CO2 konsantrasyonuyla birlikte hücre kültürlerinin korunması için kullanılan yöntemler,
  
• 
  test maddesi, taşıyıcı, konsantrasyonlar ve yöntemde kullanılan konsantrasyonların seçilme gerekçesi,
  
• 
  metabolik aktivasyon sistemlerinin detayları,
  
• 
  uygulama programı
  
• 
  pozitif ve negatif kontroller,
  
• 
  kullanılan otoradyografik teknik,
  
• 
  hücrelerin S-fazına girmesini engelleyen işlemler,
  
• 
  DNA ekstraksiyonundaki ve LSC tayinindeki toplam DNA içeriğinin tayininde kullanılan işlemler,
  
• 
  mümkün olan durumlarda doz/cevap ilişkisi,
  
• 
  istatistiksel değerlendirilme,
  
• 
  sonuçların tartışılması,
  
• 
  sonuçların yorumlanması
  

2. 
   Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).

4. 
   KAYNAKLAR
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E).

B. 19. IN VITRO KARDEŞ KROMATİD DEĞİŞİMİ

1. 
   YÖNTEM
   

1. 
   Giriş
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (A).

2. 
   Tanımlar ve birimler
   

Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).

3. 
   Referans maddeler
   

Yok.

4. 
   Test yönteminin ilkesi
   

Kardeş Kromatid Değişimi (Sister Chromatid Exchange, SCE) analizi, kopyalanan kromozomların iki kardeş kromatidleri arasındaki DNA nın karşılıklı değişmelerinin belirlendiği bir kısa dönem testidir. SCE’ler, görünüşte homolog lokuslarda (bir genin kromozom üzerinde bulunduğu nokta) olan DNA kopyalanması ürünlerindeki değişmeleri gösterir.

Değişim işlemi molekül temeli hakkında çok az şey bilinmesine rağmen, tahminen DNA kırılması ve birleşmesini içerir. SCE’lerin belirlenmesi, kardeş kromatidlerin farklı olarak işaretlenmesini gerektirir ve bu da iki hücre döngüsü için kromozomal DNA’ya bromodeoksiuridin (BrdU) ilave edilerek sağlanabilir. Uygunsa in vitro memeli hücreleri dış kaynaklı metabolik etkinleştirici sistem olmadan, test kimyasalına maruz kalırlar ve BrdU içeren ortamda iki devir kopyalama için kültürlenirler. Mitozun metafaz benzeri bir aşamasında (c-metafaz) hücrelerin birikmesi için kromozomların iplikcik haline geçmesini engelleyen maddeyle (örneğin kolşisin) muamele edildikten sonra hücreler harmanlanır ve kromozom ile ilgili hazırlıkları yapılır.

5. 
   Kalite kriterleri
   

Yok.

6. 
   Test yönteminin tanımlaması
   

Hazırlıklar

-Birincil kültürler, (insan lenfositleri) veya yerleşik olarak kullanılan hücre dizileri (örneğin hamster yumurtalık hücreleri) denemede kullanılabilir. Hücre dizileri Mikoplazmadaki istenmeyen kontaminasyonlar için kontrol edilmelidir.
-Uygun kültür ortamı ve inkübasyon koşulları (sıcaklık, kültür kapları, CO₂ derişimi,ve nem) kullanılmalıdır,
-Test maddeleri kültür ortamında hazırlanabilir veya hücrelere uygulanmadan önce uygun taşıyıcı içinde çözünebilir veya askıda kalabilir. Kültür sistemindeki taşıyıcının son derişimi hücrenin yaşayabilirliğini veya büyüme hızını anlamlı olarak etkilememeli ve SCE sıklığındaki etkiler çözücü kontrolüyle izlenmelidir,
- Hücreler dış kaynaklı bir memeli metabolik aktivasyon sistemin hem varlığında hem de yokluğunda test maddesine maruz kalmalıdırlar. Alternatif olarak, esas metabolik aktivite ile kullanılan hücre türlerinin aktivitesinin hızı ve doğası test edilen kimyasal sınıfına uygun olmalıdır.
Test koşulları
Kültürlerin sayısı
Her bir deneysel nokta için en az çift kültürler kullanılmalıdır.
Negatif ve pozitif kontrollerin kullanımı
Hem doğrudan rol oynayan bileşiklerin hem de metabolik aktivasyon gerektiren bileşiklerin kullanıldığı pozitif kontroller her deneyde yer almalıdır; taşıyıcı kontrol ayrıca kullanılmalıdır:
Aşağıdaki maddeler pozitif kontrol olarak kullanılabilecek maddelere örnektir:

-direkt olarak rol oynayan bileşik:

-etilmetansülfonat,

-dolaylı olarak rol oynayan bileşik:

-siklofosfamid.
Uygun olduğunda, test edilen kimyasalla aynı kimyasal sınıfa ait ilave bir pozitif kontrol içermelidir.
Maruz kalma konsantrasyonları
Test maddesinin uygun şekilde ayrılmış en az üç konsantrasyonu kullanılmalıdır. En yüksek konsantrasyon zehir etkisi anlamlı olarak artırmalı ancak uygun hücre çoğalmasının meydana gelmesini de sağlamalıdır. Nispeten suda çözünmeyen maddeler uygun işlemler kullanarak çözünürlük sınırına kadar test edilmelidirler. Suda serbestçe çözünen toksik olmayan maddeler için, vaka vaka bakılarak bir üst test maddesinin konsantrasyonu belirlenmelidir.
İşlem
Kültürlerin hazırlanması
Yerleşik hücre dizileri stok kültürlerden oluşturulurlar (örneğin tripsinizasyonla veya çalkalayarak) uygun yoğunluktaki kültür kaplarının içine ekilir ve 37 °C derecede inkübasyon yapılır. Tek tabakalı kültürler için, kültür kabı başına düşen hücrelerin sayısı ayarlanmalıdır, böylece kültürler toplanma zamanında %50’den daha fazla birleşmezler. Alternatif olarak, hücreler süspansiyon kültürde kullanılabilir. İnsan lenfosit kültürleri uygun teknikler kullanılarak, heparinize kandan oluşturulur ve 37 °C derecede inkübasyon yapılırlar.
Uygulama
Büyümenin üstel aşamalarında olan hücreler uygun bir zaman evresinde test maddesine maruz kalırlar; pek çok durumda bir-iki saat etkili olabilir, fakat uygulama süresi belirli durumlarda iki tam hücre döngüsüne kadar uzatılabilir. Yeterli ve kendinden metabolik aktiviteye sahip olmayan hücreler metabolik aktivasyon sisteminin hem varlığında hem de yokluğunda test kimyasalına maruz kalmalıdırlar. Maruz kalma süresinin sonunda, hücreler test maddesinden temizlenerek yıkanırlar ve BrdU varlığında iki replikasyon devri için kültürlenirler. Alternatif olarak işlem hücreleri iki hücre döngüsünün tam kültür süresinin tamamlanması için, eş zamanlı olarak test kimyasalına ve BrdU’ya maruz bırakılabilir.

İnsan lenfosit kültürleri yarı-uyumlu koşullarda muamele edilirler. Hücreler, ikinci muamele-sonrası bölünmede en duyarlı hücre döngüsü aşamalarında kimyasala maruz kalması sağlandıktan sonra analiz edilirler. BrdU ilave edilen bütün kültürler, BrdU-bulunan DNA’nın fotolizini en aza indirmek için hücreler harmanlanıncaya kadar karanlıkta veya parlak lambalardan gelen loş hale getirilmiş ışıkta tutulmalıdırlar.

Hücrelerin toplanması
Hücre kültürleri toplanmadan önce 1-4 saat arasında çubuk şeklinde engelleyicilerle (kolşisin, vs.) muamele edilir Her kültür kromozomların hazırlanması için ayrı ayrı harmanlanır ve işlem görür.
Kromozom hazırlama ve boyama
Kromozomların hazırlanması standart hücre genetiği teknikler kullanılarak yapılır. SCE’leri göstermek için lamların boyanması çeşitli tekniklerle yapılır. (ör. floresans artı Giemsa yöntemi).
Analiz
Analizi yapılan hücrelerin sayısı SCE’nin kendi kendine gerçekleşen kontrol frekansına dayanmalıdır. SCE için genelde, kültür başına en az 25 iyi-dağılmış metafazı analiz edilir. Lamlar analizden önce kodlanır. İnsan lenfositlerinde sadece 46 sentromer içeren metafazların analizi yapılır. Yerleşik hücre dizileri içinde sadece modal sayının metafazlarını içeren +/- 2 sentromer analiz edilir. SCE olarak sonuçlanan kararlı sentomerik anahtar olup olmadığı tanımlanır. Sonuçlar bağımsız bir deney ile doğrulanmalıdır.

2.