FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B). B.35. İKİ NESİLLİ ÜREME TOKSİSİTESİ ÇALIŞMASI YÖNTEM
VERİLER Veriler her bir test grubu için, testin başlangıcındaki hayvan sayısını, doğurgan erkek sayısını, hamile dişilerin sayısını, değişiklik türlerini ve her bir değişiklik türünü gösteren hayvan yüzdesini gösterecek şekilde bir tablo halinde özetlenmelidir. Olası durumlarda, sayısal sonuçlar uygun bir istatistiksel yöntemle değerlendirilmelidir. Bilinen herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılabilir
Test raporu, mümkünse, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B). B.35. İKİ NESİLLİ ÜREME TOKSİSİTESİ ÇALIŞMASI
Bu yöntem OECD TG 416 (2001)’e eşdeğerdir.
İki nesilli üreme test yöntemi, test maddesinin, gonadal (yumurtalıkla ilgili) fonksiyon, estrus döngüsü (yumurtalıklarda bir veya birden fazla yumurtanın olgunlaştırılarak atıldığı ya da bir veya iki defa görülen ve gebe kalınabilecek tek zaman olan devre), çiftleşme davranışı, gebeliğin başlaması, hamilelik, doğum, süt salgılanması, sütten kesilme ve dölün büyümesi ve gelişimini de içine alarak, erkek ve dişi üreme sistemlerinin bütünlüğü ve performansı üzerindeki etkileri hakkında genel bilgi sağlamak için tasarlanmıştır. Çalışma ayrıca test maddesinin neonatal (yeni doğana ait) hastalık, ölüm ve doğum öncesi ve doğum sonrası gelişimsel toksisite hakkında ön bilgi sağlar ve daha sonraki testler için rehberlik yapar. F1 neslinin büyüme ve gelişme çalışmalarına ilaveten, bu test yöntemi erkek ve dişi üreme sistemlerinin bütünlüğünü ve F2 neslinin büyümesini ve gelişmesini değerlendirmesi için tasarlanmıştır. Gelişimsel toksisite ve fonksiyonel bozukluklar hakkında daha fazla bilgi gelişimsel toksisite ve/veya uygunsa gelişimsel nörotoksisite yöntemlerine başvurularak ilave çalışma bölümleri bu protokole eklenebilir ya da bu sonlanma noktaları ayrı bir çalışmada uygun test yöntemleri kullanılarak çalışılabilirler.
Test maddesi kademeli dozlarda çeşitli gruptaki dişi ve erkeklere uygulanır. P nesli erkekleri, büyümeleri süresince ve en az bir spermatojenik döngü boyunca test maddesinin spermatojenez üzerindeki olumsuz etkilerini ortaya çıkarmak için (farelerde yaklaşık 56 gün, sıçanlarda 70 gün) doza maruz kalmalıdırlar. Spermdeki etkiler, (örneğin sperm morfolojisi (canlılarda dış şekillerden bahseden bilgi) ve hareketliliği) sperm parametrelerinin sayısı, doku hazırlığı ve detaylı histopatolojik incelemelerle belirlenir. Daha öncesinde yeterli sürede yürütülmüş örneğin 90 günlük tekrarlı doz çalışmalarından elde edilen spermatojenez verileri mevcutsa, P nesli erkeklerinin değerlendirilmeye dâhil edilmesine gerek yoktur. P neslinin örneklerine veya spermlerine ait kayıtlar (dijital okumalar), daha sonra değerlendirilmek üzere saklanmalıdır. Parental (P) neslin dişileri, test maddesinin estrus üzerindeki olumsuz etkilerini ortaya çıkarmak için en az iki tam estrus döngüsü boyunca doza maruz kalmalıdırlar. Test maddesi parental (P) hayvanlara çiftleşmeleri sırasında, sonuçlanan hamilelikler boyunca ve Fl döllerinin sütten kesilmesi boyunca uygulanır. Sütten kesilme sırasında maddenin uygulanmasına Fl dölü erişkin olup, çiftleşip ve bir F2 nesli meydana getirip, F2 nesli sütten kesilinceya kadar devam edilir. Klinik gözlemler ve patolojik incelemeler, dişi ve erkek üreme sistemlerinin performansı ve dölün büyümesi ve gelişmesi ve bütünlüğü üzerindeki etkilere özel önem verilerek ve toksisite belirtileri için tüm hayvanlara yapılır.
Test için tercih edilen tür sıçandır. Başka türler kullanılırsa, geçerli bir neden belirtilmelidir ve uygun modifikasyonlar gerekli olacaktır. Doğurganlığı düşük olan suşlar veya gelişimsel bozukluk gelişme sıklığının yüksek olduğu iyi bilinen suşlar kullanılmamalıdır. Çalışmanın başında kullanılan hayvanların ağırlık değişimleri en az olmalı ve her bir cinsiyet için ortalama ağırlığın %20’sini geçmemelidir.
Deney hayvanları için oda sıcaklığı 22°C derece (± 3°C) olmalıdır. Ayrıca, bağıl nem oranı en az %30 olmalı ve tercihen odanın temizlenmesi sırası dışında, %70’i geçmemelidir amaç % 50-60 olmalıdır. Yapay ışık sistemi kullanılmalı, 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık şeklinde olmalıdır. Beslenme için, geleneksel laboratuvar yiyecekleri sınırsız içme suyunun sağlanması şartıyla kullanılabilir. Bu yöntemle uygulandığında, test maddesinin uygun bir karışımının temin edilmesi ihtiyacı beslenme şeklinin seçimini etkileyebilir. Hayvanlar ayrı ayrı veya aynı cinsiyetten küçük gruplar halinde kafeslere yerleştirilebilirler. Çiftleşme işlemleri amaca uygun kafeslerde uygulanmalıdır. Çiftleşme kesinleştikten sonra, çiftleştirilen dişiler tek başlarına doğum veya gebelik kafeslerine yerleştirilirler. Çiftleştirilen sıçanlar ayrıca küçük gruplar halinde tutulabilirler ve doğumdan bir veya iki gün önce ayrılırlar. Çiftleştirilen hayvanların doğuma yakın zamanda uygun ve belirlenmiş yuvalara yerleşmeleri sağlanabilir.
En az 5 gün öncesinden laboratuvar şartlarına alıştırılmış ve öncesinde deneysel muameleye maruz kalmamış sağlıklı genç hayvanlar kullanılmalıdır. Test hayvanları tür, ırk, kaynak, cinsiyet, ağırlık ve/veya yaşa göre karakterize edilmelidir. Kardeşlerin çiftleştirilmesinden kaçınılması için hayvanlar arasında herhangi bir kardeş ilişkisi olmalıdır. Hayvanlar kontrol ve muamele grupları olarak gelişigüzel seçilmelidirler (vücut ağırlıklarına göre ayırma tercih edilir) Kafesler, yerleştirilmelerinden meydana gelebilecek olası etkiler en aza indirilecek şekilde ayarlanmalıdır. Her hayvana kendisine özgü kimlik numarası verilmelidir. P nesli için bu, doz uygulamasına başlamadan önce yapılmalıdır. F1 nesli için bu, çiftleşme için seçilen hayvanlar sütten kesildikten sonra yapılmalıdır. Başlangıçtaki bir batında doğan yavruları belirten tüm kayıtlar, seçilen bütün F1 hayvanları için elde edilmelidir. İlaveten,köpek yavrularının ayrı ayrı tartılmaları gerektiğinde veya fonksiyonel testlerin uygulanması düşünüldüğünde, doğumdan hemen sonra köpek yavrularının ayrı ayrı kimliklendirilmeleri tavsiye edilir. Parental (P) hayvanlar doz uygulanmasına başlandığında 5-9 haftalık arasında olmalıdırlar. Tüm test gruplarına ait hayvanlar, olabildiğince aynı yaş ve ağırlıkta olmalıdır.
Her bir test ve kontrol grubu doğumda veya doğuma yakın 20’den az olmayacak şekilde hamile dişiler içermelidir. Bu durum muameleye-bağlı olarak olumsuz etki (örneğin kısırlık, yüksek dozda fazla toksisite) meydana getiren maddeler için mümkün değildir. Amaç, maddenin F1 dölünde gebeliğin başlamasından doğumun meydana gelmesine kadar doğurganlık, hamilelik ve maternal davranışlarla emzirme, büyüme ve gelişimi üzerindeki etki potansiyelini ve döllerinin (F2) gelişiminden emzirmenin sonuna kadarki etkilerini anlamlı şekilde değerlendirmek için yeterli sayıda hamilelik meydana getirmektir. Bu yüzden, istenilen hamile hayvan sayısına (örneğin 20) ulaşılamadığı takdirde, çalışmanın geçersiz kılınmasına gerek yoktur ve vaka vaka değerlendirilmelidir.
Başka bir uygulama yolunun (örneğin dermal (ciltle ilgili) veya solunum) daha uygun olduğu düşünülmedikçe, test maddesinin oral (sonda ile besleme veya diyetle veya içme suyuyla) uygulanması tavsiye edilir. Gerekli olduğunda test maddesi uygun bir taşıyıcıda çözülür veya askıda kalır. Uygun olan her yerde sulu çözelti/süspansiyon kullanımının ilk önce düşünülmesi tavsiye edilir, bunu yağda (örneğin mısır yağı) çözelti/emülsiyon kullanımı ve diğer taşıyıcılardaki uygun çözelti kullanımı izler. Su dışındaki taşıyıcıların toksisite özellikleri bilinmelidir. Test maddesinin taşıyıcıdaki kararlılığı belirlenmelidir.
En az üç doz ve eş zamanlı kontrol kullanılmalıdır. Test maddesinin fizikokimyasal doğası veya biyolojik etkileriyle sınırlanmadıkça, en yüksek doz toksisiteyi indüklemeli fakat parental (anne-baba) (P) hayvanlarda ölüm veya acı oluşturmamalıdır. Beklenmeyen ölüm durumunda, parental (P) hayvanlarda yaklaşık %10’dan daha az bir ölüm hızı kabul edilebilirdir. Dozların azalan dizisi doz-cevap veya olumsuz etkinin gözlemlenmediği seviyeyi (NOAEL) gösterecek şekilde seçilmelidir. İki –dört kat aralıklar azalan doz seviyeleri için genelde en uygunudur ve dördüncü bir test grubunun ilave edilmesi doz grupları arasında geniş aralıklar kullanılmasına (örneğin 10 faktörden daha fazla) genellikle tercih edilir. Beslenmeyle ilgili çalışmalar için doz aralığı 3 kattan daha fazla olmamalıdır. Dozlar, mevcut toksisite verileri ve özellikle de tekrarlı doz çalışmalarından elde edilen veriler dikkate alınarak seçilmelidir. Test bileşiğinin veya ilgili maddelerin metabolizması veya toksikokinetiğiyle ilgili ilave bilgiler de dikkate alınmalıdır. İlaveten bu bilgi, doz uygulama kürünün yeterliliğinin gösterilmesine yardımcı olacaktır. Bu grup, muamele edilmemiş bir kontrol grubu olmalı veya test maddesi uygulanırken taşıyıcı kullanılmışsa taşıyıcı-kontrol grubu olmalıdır. Test maddesiyle muamele edilenler hariç, kontrol grubundaki hayvanlar test grubundakilerle eşit şekilde elde tutulmalıdırlar. Taşıyıcı kullanılmışsa, kontrol grupları kullanılan en yüksek miktarda taşıyıcı alır. Eğer test maddesi diyetle uygulanır ve gıda alımının veya kullanımının azalmasına neden olursa, o zaman çift beslenmiş kontrol grubunun kullanılmasının gerekli olduğu düşünülebilir. Alternatif olarak üremeyle ilgili parametrelerdeki gıda tüketiminin azalmasının etkilerini değerlendirmek için tasarlanan kontrol edilmiş çalışmalardan elde edilen veriler, eş zamanlı eşlenmiş beslenmiş kontrol grubunun yerine kullanılabilir. Taşıyıcı ve diğer katkıların belirtilen özelliklerinin üzerinde durulmalıdır: absorpsiyon (emilim), dağılım, metabolizma veya test maddesinin alıkonması üzerine etkiler, test maddesinin toksisite özelliğini değiştirebilecek olan kimyasal özellikleri üzerine etkiler veya gıda ve su tüketimi veya hayvanların beslenme durumu üzerine etkiler.
En az 1 000 mg/kg vücut ağırlığı tek dozun kullanıldığı bir oral çalışma veya bu çalışma için tanımlanan işlemler kullanılarak diyetle ya da içme suyuyla yapılan bir uygulama için diyet veya içme suyundaki eşit yüzde hem parental hayvanlarda hem de onların döllerinde gözlenebilir bir toksik etki meydana getirmiyorsa ve yapısal olarak benzer maddelerle ilgili verilere dayanılarak toksisite beklenmiyorsa, bu durumda çeşitli dozlar kullanılarak yapılacak kapsamlı bir çalışmaya gerek olmayabilir. Beklenen insan maruz kalması daha yüksek doz kullanılması gerektiğine işaret etmedikçe sınır testi uygulanır. Solunum veya dermal uygulamalar gibi diğer uygulama tipleri için test maddesinin çözünürlük gibi fizikokimyasal özellikleri en fazla ulaşılabilir maruz kalmayı işaret eder ve onu sınırlar.
Hayvanlar test maddesiyle haftanın 7 günü muamele edilerek doza maruz kalmalıdır. Tercih edilen uygulama yolu oral (örneğin, diyeti, içme suyu, sonda ile besleme ) uygulamadır. Başka bir uygulama yolu kullanılacaksa gerekçelendirilir ve uygun modifikasyonlar yapılabilir. Tüm hayvanlar deney süresi boyunca aynı yöntemle doza maruz kalmalıdır. Test maddesi sondayla gavaj yöntemi kullanılarak uygulanmalıdır. Tek seferde uygulanabilecek olan maksimum sıvı hacmi, sulu çözeltiler için 2 ml/100 vücut ağırlığı kullanılabilen durumlar haricinde, 1 ml/l00 g vücut ağırlığını geçmemelidir (mısır yağı için en fazla vücut ağırlığı 0.4 ml/100 g ). Normalde daha yüksek konsantrasyonlarda daha kötü etkiler meydana getiren tahriş edici ve aşındırıcı maddeler haricindeki maddeler için konsantrasyonunun tüm doz seviyelerinde sabit olacak şekilde ayarlanmasıyla test hacmindeki değişkenler en aza indirilmelidir. Sonda ile besleme çalışmalarında köpek yavruları normalde test maddesini sütten kesilmeden sonra doğrudan doz uygulaması başlayıncaya kadar, sadece dolaylı olarak sütten alırlar. İçme suyu veya diyet çalışmalarında süt salgılama periyodunun son haftasında, köpek yavrusu kendileri yemeğe başlayınca ilave olarak test maddesini doğrudan alırlar. Diyet veya içme suyuyla uygulanan maddeler için, gerekli test maddesinin hiçbir miktarının normal beslenme veya su dengesiyle etkileşmediğinin garanti edilmesi önemlidir. Test maddesi ya sabit diyet konsantrasyonu (ppm) ya da hayvanların vücut ağırlığı üzerinden kullanılabilen sabit doz olarak uygulandığında, kullanılan alternatif belirtilmelidir. Sondayla uygulanan maddeler için, doz her gün aynı zamanlarda verilmelidir ve hayvan vücut ağırlığına dayanarak sabit doz elde etmek için gerektiği şekilde ayarlanmalıdır. Ağırlığa bağlı sonda ile besleme dozu dozu ayarlanırken plasental dağılım hakkında bilgi göz önünde bulundurulmalıdır.
Parental (P) erkeklerin ve dişilerin günlük doz uygulamaları, hayvanlar beş-dokuz haftalıkken başlamalıdır. F1 erkek ve dişilerinin günlük doz uygulamaları sütten kesilmeyle başlar, test maddesinin diyet veya içme suyuyla uygulandığı durumlarda, F1 köpek yavrularının test maddesine doğrudan maruz kalması süt salgılama periyodu sırasında zaten gerçekleşmiş olabilir. Her iki cinsiyet için de (P ve F1) doz uygulanmasına çiftleşme sürecinden önce en az 10 hafta devam edilmelidir. Doz uygulanmasına her iki cinsiyette de 2 haftalık çiftleşme süresi boyunca de devam edilir. Erkekler üreme üzerine etkilerin değerlendirimesinde artık ihtiyaç kalmamışsa, insanca öldürülmeli ve incelenmelidirler. Parental (P) dişilerinin günlük doz uygulaması hamilelik boyunca ve F1 dölü sütten kesilinceye kadar devam etmelidir. Test maddesiyle ilgili indüklenme, biyolojik birikim gibi diğer bilgilere dayanılarak doz uygulama planının yeniden düzenlenmesi düşünülebilir. Her bir hayvana uygulanacak doz normalde hayvanların ayrı ayrı alınan en son vücut ağırlıklarına dayanrak belirlenir. Ancak, hamileliğin son üç ayındaki doz ayarlanmasına dikkat edilmelidir. P ve F1 erkek ve dişilerinin muamele edilmelerine deneyin sonlandırılmasına kadar devam edilir. Tüm P ve F1 erişkin erkek ve dişileri üreme üzerine etkilerin değerlendirilmesine artık ihtiyaç kalmadığı zaman insanca öldürülmelidir. Çiftleşme için seçilmeyen F1 dölü ve tüm F2 dölleri sütten kesildikten sonra insanca öldürülmelidir.
Her bir çiftleşme için her bir dişi birleşme gerçekleşinceye veya 2 hafta geçinceye kadar aynı doz grubundan bir erkekle birlikte yerleştirilmelidir (1:1 çiftleşme). Dişiler her gün sperm veya vajinal tıkaçların varlığı için incelenir. Hamileliğin 0 ıncı günü, sperm veya vajinal tıkaçların bulunduğu gün olarak tanımlanır. Çiftleşmenin başarısız olduğu durumlarda, dişilerin aynı gruptan ispatlanmış erkeklerle yeniden çiftleştirilmesi düşünülmelidir. Çiftleşen çiftler verilerde açıkça tanımlanmalıdır. Kardeşlerin çiftleşmesinden kaçınılmalıdır.
F1 dölünün çiftleşmesi için, emzirmenin bitiminde her bir batında doğan yavrulardan, en az bir erkek ve bir dişi aynı dozdaki fakat farklı olan diğer batında doğan yavrularla çiftleştirilerek, F2 nesli oluşturması için en az bir erkek ve bir dişi seçilmelidir. Vücut ağırlıklarında veya yavru çiftlerin görünüşleri arasında önemli değişiklikler gözlenmediğinde, her bir batında doğan yavrunun seçimi rastgele yapılmalıdır. Değişikliklerin gözlendiği durumlarda , her bir batında doğan yavrunun en iyi temsilcisi seçilmelidir. Yararlı olması için en iyisi vücut ağırlığının esas alınmasıdır fakat görünüşün esas alınması daha uygun olabilir. F1 dölü tamamen cinsel olgunluğa erişmeden çiftleştirilmemelidir. Yavrusu olmayan çiftler kısırlığın gözle görülür nedenini belirlemek için değerlendirilmelidir. Bu değerlendirmeye ispatlanmış diğer erkek veya dişilerle çiftleşme fırsatları, üreme organlarının mikroskop altında incelenmesi ve estrus döngüsünün ve spermatogenezin incelenmesi gibi bazı işlemler dahildir.
Muameleye bağlı bir batında yavru büyüklüğü değişiklikleri veya ilk çiftleşmedeki şüpheli etkilerin gözlenmesi gibi, belli durumlarda P veya F1 erişkinlerinin ikinci bir batın meydana getirmesi için tekrar çiftleştirilmeleri tavsiye edilir. Karşı cinsin ispatlanmış damızlıklarıyla yavru meydana getirmeyen dişi veya erkeklerin yeniden çiftleştirilmesi tavsiye edilir. Eğer ikinci bir yavrunun meydana gelmesi her iki nesil için de gerekli görülüyorsa, hayvanlar son yavrunun sütten kesilmesinden yaklaşık bir hafta sonra yeniden çiftleştirilmelidir.
Hayvanlar normal doğum yapmalılar ve döllerini sütten kesilinceye kadar beslemeliler. Yavru büyüklüğünün standardizasyonu isteğe bağlıdır. Standardizasyon yapıldığında, kullanılan yöntem detaylarıyla açıklanmalıdır.
Genel klinik gözlemler her gün yapılmalı ve dozun sondayla uygulandığı durumlarda zamanlama yapılırken doz uygulanmasından sonra beklenen pik süresi dikkate alınmalıdır. Davranış değişiklikleri, zor ve uzamış doğum ve tüm toksisite belirtileri kaydedilmelidir. İlave olarak her bir hayvanın daha detaylı incelenmesi en az haftalık olarak yürütülmeli ve hayvanın tartıldığı zamanki durumuna göre uygulanmalıdır. Günde iki defa, uygunsa, hafta sonunda günde bir defa tüm hayvanlarda hastalık ve ölüm durumları gözlenmelidir.
Parental hayvanlar (P and Fl) dozun uygulandığı ilk gün ve sonrasında en az haftalık olarak tartılmalıdır. Parental dişiler (P and F1) hamileliğin 0, 7, 14 ve 20 veya 21. günlerinde, süt salgılanması sırasında, yavruların tartıldığı günde ve hayvanların öldürüldüğü gün tartılmalıdır. Bu gözlemler, her bir erişkin hayvan için ayrı ayrı rapor edilmelidir. Çiftleşme öncesi ve hamilelik süresinde yiyecek tüketimleri en az haftalık olarak ölçülür. Test maddesi su içinde uygulanmışsa, su tüketimi en az haftalık olarak ölçülür
Estrus döngüsü uzunluğu ve normalliği P ve F1 dişilerinde çiftleşme öncesinde ve isteğe bağlı olarak çiftleşme sırasında çiftleşmenin gerçekleştiğinin kanıtı bulununcaya kadar, vajinal sıvı alınarak değerlendirilir. Vajinal/servikal hücreler elde edilirken, mukozanın bozulmamasına ve yalancı hamileliğin meydana gelmemesine özen gösterilmelidir (1).
Sonuçta P ve F1 erkekleri için, testis ve epididimis ağırlıkları kaydedilir ve her organdan biri histopatolojik inceleme için muhafaza edilir (bakınız kısım 1.5.7, 1.5.8.1). Her bir P ve F1 grubunda en az on erkeğin alt kümesinin kalan testis ve epididimisleri sırasıyla homojenizasyon dirençli spermatitler ve kauda epididimal sperm kaynaklarının sayılması ve sıralanması için kullanılmalıdır. Aynı erkek altkümesi için, cauda epididimides spermleri veya vas deferens (spermi epididimlerden boşaltma bölümüne taşıyan kanal) sperm hareketi ve morfolojisi (yapı bilimi) için toplanmalıdır. Muameleye bağlı etkiler gözlenirse veya diğer çalışmalardan spermatojenez (spermatozoid oluşumu) üzerinde etki görülebileceğinin kanıtları varsa, her bir doz grubundaki tüm erkeklerin spermleri incelenmelidir; aksi takdirde sıralama ve sayılma kontrol ve yüksek doz grubu P ve F1 erkekleriyle sınırlı olacaktır. Homojenizasyon dirençli yumurta şeklindeki spermatitler ve kauda epididimal sperm sıralanmalı ve sayılmalıdır (2)(3). Kauda sperm kaynakları, nitel değerlendirmelerin tamamlanması için kullanılan süspansiyonun içindeki spermin hacim ve konsantrasyonundan türetilebilir ve yeniden toplanan sperm sayısı kalan kauda dokunun kıyılması ve/veya homojenizasyonuyla yapılır. Sayma ve sıralama hayvanlar öldürüldükten hemen sonra video veya dijital kayıt yapılmamışsa veya örnekler dondurulup sonra analiz edilmemişse, doz uygulanan tüm gruplardan seçilen erkeklerin altkümelerinde uygulanmalıdır. Bu durumlarda, ilk önce kontrol ve yüksek doz grupları analiz edilebilir. Muameleye bağlı etkiler (örneğin sperm sayısı, hareketi ve morfolojisi ile ilgili) görülmemişse, diğer doz gruplarının analiz edilmesine gerek yoktur. Yüksek doz grubunda muameleye bağlı etkiler kaydedilmişse, daha düşük doz grupları da ayrıca değerlendirilmelidir. Epididimal (veya deferent) sperm hareketi değerlendirilmelidir veya gözden çıkarıldıktan hemen sonra video kasete alınmalıdır. Hasar en azda tutularak sperm kurtarılır ve uygun yöntemler kullanılarak hareketlilik analizi için seyreltilmelidir (4). Kademeli olarak hareketli sperm yüzdesi öznel ya da nesnel olarak belirlenmelidir. Bilgisayar destekli hareket analizi uygulandığında (5)(6)(7)(8)(9)(10) kademeli hareketliliğin türevi, kullanıcının tanımladığı ortalama yol hızı ve eşik değerlere doğruluk (istikamet) veya doğrusal indekstir. Örnekler videokasete alınırsa (11) veya otopsi anındaki görüntü kaydedilirse, muameleye bağlı etkiler gözlenmedikçe, sonraki analizler sadece kontrol ve yüksek doz P ve F1 erkekleri için uygulanır, bu durumda daha düşük doz gruplarıda değerlendirilmelidir. Video veya dijital görüntü yoksa muamele grubundaki bütün örnekler otopside analiz edilmelidirler. Epididimal (veya vas deferens) sperm örneklerinin morfolojik incelemesi yapılmalıdır. Sperm (örnek başına en az 200) sabitlenmiş, ıslak preparatlar olarak incelenmeli ve hem normal hemde anormal olarak sınıflandırılmalıdır. Morfolojik sperm anomali örnekleri erimiş, ayrılmış ve biçimsiz kafalar ve/veya kuyruk olabilir. Değerlendirme, ya hayvanlar öldürüldükten hemen sonra veya daha sonraki video ve dijital kayıtlara dayanılarak, ileri bir tarihte, tüm doz gruplarının erkek altkümelerinde uygulanmalıdır. Simir (smear) (lam üzerine sürülen madde) bir defa sabitlenir ve sonraki bir zamanda okunabilirler. Bu gibi durumlarda, kontrol ve yüksek doz grupları ilk önce analiz edilir. Muameleye bağlı etki yoksa, (örneğin sperm morfolojisine etkiler) diğer doz gruplarının analiz edilmesine gerek yoktur. Muameleye bağlı etkilerin yüksek doz grubunda görüldüğü durumlarda, düşük doz grupları da ayrıca değerlendirilmelidir. Yukarıdaki sperm değerlendirme parametrelerinden herhangi biri en az 90 günlük bir sistematik toksisite çalışmasının bir kısmı olarak daha önceden değerlendirilmişse, iki nesilli çalışmada tekrar edilmelerine gerek yoktur. Gerekliyse, daha sonraki değerlendirme için P nesline ait sperm örneklerinin veya dijital görüntülerinin saklanması tavsiye edilir.
Köpek yavrusu sayısı ve cinsiyetlerini, ölü doğumları, canlı doğumları ve büyük anomalileri belirlemek için herbir yavru doğumdan hemen sonra (kıktasyon emzirmenin o. Günü) incelenmelidir. 0. günde ölü bulunan köpek yavruları suda bırakılıp yumuşatılmadıysa, olası eksiklikler ve ölüm nedeni için incelenmeli ve muhafaza edilmelidir. Canlı köpek yavruları doğumda (emzirme 0. gün) ve 1. gün ve sonrasında düzenli olarak, emzirmenin 4, 7, 14 ve 21. günlerinde, ayrı ayrı sayılmalı ve tartılmalıdır. Anne ve yavrulardaki fiziksel ve davranışsal anomaliler kaydedilmelidir. Yavruların fiziksel gelişimi özellikle vücut ağırlığı artışı kaydedilmelidir. Diğer fiziksel parametreler (örneğin kulak ve göz açıklıkları, diş döküntüsü, tüylerin büyümesi) tamamlayıcı bilgi sağlayabilir fakat bu veriler tercihen cinsel olgunlukla ilgili veriler bağlamında değerlendirilecektir. ( örneğin vajinal açıklık veya prepüsyal ayrılmada vücut ağırlığı ve yaş) (13). F1 yavrusunun sütten kesilmeden önceki ve sonraki fonksiyonel araştırmaların (motor aktivite, duyu fonksiyonları, refleks ontogenez (organizmanın kaynak ve gelişimi)) özellikle de cinsel olgunlukla ilgili olanlar, eğer bu araştırmalar ayrı bir çalışmanın konusu değilse, yapılması tavsiye edilir. Çiftleşme için seçilen sütten yeni kesilen F1 yavruları için vajinal açıklığın erginliği ve prepüsyal ayrılma belirlenmelidir. F1 cinsiyet oranındaki değişikliklerle ve cinsel olgunluğun zamanlamasıyla tetiklenmişse, anogenital (anusa ve genital bölgeye ait olan) uzaklık doğum sonrasıl 0 ncı günde F2 köpek yavrularında ölçülmelidir. Aksi takdirde çok açık olumsuz etki belirtileri gösterecek olan gruplar için fonksiyonel gözlemler ihmal edilebilir (örneğin kilo alımında anlamlı düşüş vs. ). Fonksiyonel araştırmalar yapılırsa, çiftleşme için seçilen köpek yavrularla yapılmamalıdır.
Sonlandırmada veya çalışma sırasında ölümlerde tüm parental hayvanlar (P and F1), harici anomalileri veya klinik belirtileri olan tüm köpek yavrularıyla beraber F1 ve F2 neslinden rast gele seçilen bir köpek yavrusu/cinsiyet/yavru yapısal anomaliler veya patolojik değişiklikler için incelenir. Üreme sistemi organlarına özel önem verilmelidir. Ölmek üzere olduğu için insani nedenlerle öldürülen ve ölü köpek yavruları olası eksiklikler ve/veya ölüm nedenleri için incelenmeli ve muhafaza edilmelidirler. İlk defa doğuran dişilerin rahimleri implantasyon yerlerinin sayıları ve varlıklarının belirlenmesi için histopatolojik değerlendirmeyle uyuşmayan bir biçimde incelenmelidir.
Sonuçta tüm P and F1 parental hayvanların vücut ağırlığı ve aşağıdaki organların ağırlıkları belirlenir (çift organlar ayrı ayrı tartılır): — döl yatağı(uterus), yumurtalıklar; — testis, epididimler (toplam ve cauda); — prostat; — seminal veziküller ve pıhtılaştırma bezleri ve onların akışkanları ve prostat (bir birim olarak); — beyin, karaciğer, böbrekler, dalak, pituitary, tiroid ve adrenal bezler ve bilinen hedef organlar
Parental (P and F1) hayvanlara ait aşağıdaki dokular ve organlar veya temsili örnekleri histopatolojik inceleme için uygun bir ortamda sabitlenmeli ve saklanmalıdır. — vajina, uterus ve serviks, ve yumurtalıklar (uygun sabitleyicide korunurlar); — bir testis (Bouin veya karşılaştırılabilir bir sabitleyicide korunur), bir epididimis, seminal kese, prostat ve pıhtılaştırma bezi; —çiftleşme için seçilen tüm P ve F1 hayvanlarının daha önceden belirlenen hedef organ(lar)ı
Büyükçe anormal doku ve hedef organlar harici anormallileri ve klinik belirtileri olan tüm köpek yavrularından ve yanında çiftleşme için seçilmeyen F1 ve F2 nesillerinden rastgele seçilen bir köpek yavrusu/cinsiyet/bir batında doğan yavrudan histopatolojik inceleme için alınıp, uygun bir ortamda sabitlenmeli ve saklanmalıdır. Muhafaza edilen dokuların tam histopatolojik sınıflandırması üreme sistemi organlarına özel önem verilerek yapılmalıdır.
|