FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- B.40. CİLTTE AŞINMA YÖNTEM
VERİLER
Ayrı ayrı lamlar ve hayvan verileri elde edilmelidir. Ek olarak, tüm veriler çizelge halinde özetlenmelidir. Net nükleer granül (NNG) sayımları her bir hücre, her bir hayvan ve her bir doz ve zaman için NG sayımlarından CG sayımları çıkartılarak hesaplanmalıdır. Eğer ‘onarımdaki hücreler’ sayılırsa, tanımlanma kriterleri doğrulanmalı ve geçmişe dayalı veya eşzamanlı negatif kontrol verilerine dayanmalıdır. Sayısal sonuçlar istatistiksel yöntemlerle değerlendirilebilir. Eğer kullanılmışsa, istatistiksel testler seçilmeli ve çalışma yürütülmeden önce gerekçelendirilmelidir.
pozitif/negatif cevapların kriterleri için örnekler: pozitif (i) geçmişe yönelik laboratuvar değerlerine göre doğrulanmış önceden hazırlanan değerlerin üzerindeki NNG değerleri veya (ii) eş zamanlı kontrollerden anlamlı olarak büyük olan NNG değerleri, negatif (i) geçmişe yönelik kontrol eşik değerinin içinde/altında NNG değerleri, veya (ii) eş zamanlı kontrollerden anlamsız olarak büyük olan NNG değerleri, Hayvanlar arasındaki farklılık, doz-cevap ilişkisi ve sitotoksisite parametreleri gibi biyolojik anlamlılık verileri göz önünde bulundurulmalıdır. İstatistiksel yöntemler test sonuçlarının değerlendirilmesinde yardımcı olarak kullanılabilir. Ancak, istatistiksel anlamlılık pozitif bir sonuç için tek belirleyici faktör olmamalıdır Her ne kadar çoğu deney açıkça pozitif veya negatif sonuçlar verse de, çok nadir durumlarda veri kümeleri test maddesinin aktivitesiyle ilgili kesin bir değerlendirme yapılmasına engel olacaktır. Sonuçlar, deneyin tekrarlanma sayısından bağımsız olarak şüpheli veya belirsiz kalabilir. Memeli karaciğer hücrelerindeki in vivo UDS testinin pozitif sonucu, test maddesinin memeli karaciğer hücresinde programlanmamış in vitro DNA senteziyle onarılabilen in vivo DNA hasarını uyardığını gösterir. Negatif bir sonuç, test koşullarında, test maddesinin bu testle gözlenebilir bir DNA hasarını uyarmadığını gösterir. Test maddesinin genel dolaşıma veya özel olarak hedef dokuya (ör., sistemik toksisite) ulaşma olasılığı tartışılmalıdır.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir: Çözücü/Taşıyıcı
Test hayvanları:
Test koşulları:
Sonuçlar:
Sonuçların tartışılması. Sonuçlar.
B.40. CİLTTE AŞINMA
İki In vitro test, sıçan derisinde, deri içinden elektrik direnci (TER) yöntemi ve insan cildine uygulanan test modeli, ciltte aşınma için bilimsel olarak geçerli Alternatif Yöntemlerin Validasyonu için Avrupa Merkezi (ECVAM, Birleşik Araştırma Merkezi Avrupa Komisyonu) tarafından desteklenmiştir(1)(2)(3). ECVAM geçerlilik çalışması her iki testin de bilinen, cildi aşındıran ve aşındırmayan maddelerin ayrımlarının yapılmasında güvenilir olduğunu göstermiştir. Ek olarak, test protokolü, aşındırıcı etkiler arasında doğru bir ayırım sağlayan insan cilt modeline dayanır (ciddi cilt aşındırıcısı olarak bilinir, R35 ve diğer cilt aşındırıcıları, R34) (2). Her iki test için de tanımlar ve yöntemler verilmiştir, hangi testin kullanılacağının seçiminde, özel koşullar ve kullanıcının tercihleri önceliklidir. Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Cilt aşınması: test maddesinin uygulanmasını takiben ciltte geri dönüşümsüz doku hasarlarının oluşması.
Belirtilmemiştir fakat 1.5.3.4 ve 1.7.2.3. başlıklarına bakınız.
Test maddesi, etiğe uygun olarak öldürülen genç sıçanların derilerinden alınan cilt disklerinin epidermal yüzeyine 24 saate kadar uygulanır. Aşındırıcı maddeler normal epidermis alt tabakası bütünlüğünün ve koruma fonksiyonunun kaybolmasını sağlamalarıyla tanımlanırlar. Bu da asıl TER’in eşik değerin altındaki azalması olarak ölçülür (5k) (4)(5). Tahriş edici ve tahriş edici olmayan maddeler TER’i eşik değerinin altına düşürmezler. Yüzey aktif maddeler ve nötral organikler için boya bağlama basamağı test işlemine dâhil edilebilir (tanım için bakınız kaynak (6)) amaç özellikle bu kimyasal türlerinden elde edilen yanlış pozitif sonuçları azaltmaktır (2) (7).
Deri disklerinin hazırlanması için genç (20-23 günlük) sıçanlar (Wistar veya karşılaştırılabilir bir ırk) gereklidir. Hayvanların sırt bölgesindeki tüyler dikkatlice uzaklaştırılır. Daha sonra ilgili alan antibiyotik çözeltisine batırılır (örneğin bakteri gelişmesine engel olacak etkinlikte derişime sahip streptomisin, penisilin, kloramfenikol ve amfoterisin olabilir) hayvanlar dikkatlice silinerek yıkanır. Hayvanlar ilk yıkamadan sonra üçüncü veya dördüncü günde antibiyotiklerle tekrar yıkanır ve 3 gün içinde kullanılırlar (post hazırlanması için kullanılacak hayvanlar 31 günden daha yaşlı olmamalıdır).
Hayvanlar insani şekilde öldürülürler. Her bir hayvanın sırt derisi alınır ve fazla yağ soyularak dikkatlice deriden uzaklaştırılır. Hayvan derisi PTFE (politetrafloroetilen) borunun sonuna yerleştirilir, epidermal yüzeyin boruyla temas etmesi sağlanır. Kauçuk bir ‘O’ halka deriyi tutmak için borunun sonuna yerleştirilir ve fazla doku kesilerek atılır. Boru ve ‘O’ halkasının boyutları Şekil 1’de gösterilmiştir. Kauçuk ‘O’ halkası daha sonra PTFE borunun sonuna vazelinle dikkatlice kapatılır. Boru, magnezyum sülfat çözeltisi (154mM) içeren reseptör odacığının içindeki pensle desteklenir (Şekil 2).
Sıvı test maddeleri (150µl)tüpün içindeki epidermal yüzeye uygulanır. (Şekil 2). Katı maddeler test edilirken, yeterli miktarda katı, epidermisin tüm yüzeyini kaplayacak şekilde diske uygulanır. Daha sonra katının üzerine deiyonize su (150µl) ilave edilir ve yavaş yavaş karıştırılır. Test maddeleri deriyle maksimum temas sağlamalıdır. Bazı katılar bu yüzden 30oC dereceye kadar ısıtılarak eritilir veya ezilerek toz haline getirilir. Her madde için üç deri diski kullanılır. Test maddesi 24 saat boyunca uygulanır (ayrıca bakınız 1.5.3.4). Test maddesi 30oC dereceye kadar çeşme suyuyla hiç madde kalmayıncaya kadar yıkanarak uzaklaştırılır. Borunun içinde katışalan maddeler, 30oC dereceye kadar ılık suyla püskürterek yıkanarak uzaklaştırılır.
TER düşük voltaj kullanılarak ölçülür, dalgalı akım veri bağlantısı (örn.. AIM 401 veya 6401, veya eşdeğeri). Elektriksel direnci ölçmeden önce, epidermisi kaplamak için, yeterli hacimde %70’lik etanol eklenerek derinin yüzey gerilimi azaltılır. Birkaç saniye sonra boru ters çevrilerek etanol uzaklaştırılır ve doku daha sonra 3 mL magnezyum sülfat çözeltisiyle (154 mM) hidratlanır. Veri bağlantı elektrotları k/deri diski olarak direnci ölçmek için deri diskinin her iki tarafına da yerleştirilir (Şekil 2). Bağlantı maşalarının altında görünen elektrot boyutları ve elektrot uzunluğu Şekil 1’de gösterilmektedir. İç (kalın) elektrot, maşa direnç ölçümü sırasında PTFE borusunun üstünde durur ve elektrotun uygun bir uzunluğunun magnezyum sülfat çözeltisinin içinde olması sağlanır. Dış (ince) elektrot, reseptör odacığının içinde yer alır böylece odacığın tabanında durur. Maşanın tabanıyla PTFE borunun tabanı arasındaki uzaklık sabittir (Şekil 1) ve bu uzaklık elde edilen direnci etkiler. Ölçülen direnç 20k,’den büyükse, bu durum deri diskinin epidermal yüzeyini kaplayan test maddesine bağlı olabilir., Örneğin, PTFE boruyu eldivenli başparmakla kapatıp yaklaşık 10 saniye çalkalayarak bu kaplama uzaklaştırılmaya çalışılır; magnezyum sülfat çözeltisi atılır ve direnç ölçümü taze magnezyum sülfat çözeltisiyle tekrarlanır. Ortalama TER sonuçları, eş zamanlı pozitif ve negatif kontrol değerlerinin yöntemde kabul edilebilir değerler olduğu koşullarda kabul edilir. Önerilen kontrol maddeleri ve onların metodoloji için tanımlanan ilgili kabul edilebilir direnç aralığı ve düzenekleri aşağıdaki şekilde tanımlanır:
Yüzey aktif veya organik olan test maddesinin TER değerleri 5k’ye eşit veya bu değerden küçükse, boyanın nüfuz etmesinin değerlendirilmesi dokularda yapılabilir. Bu yöntem, sonuçların yanlış pozitif olup olmadığını belirleyecektir (2).
Test maddesiyle yapılan başlangıç muamelesini takiben, 150μl, saf suyla %10 (w/v) seyreltilmiş Sülforodamin B boyası her bir deri diskinin epidermal yüzeyine 2 saat boyunca uygulanır. Deri diskleri daha sonra oda sıcaklığındaki çeşme suyuyla fazla/bağlanmamış boyayı uzaklaştırmak için yaklaşık 10 dakika püskürterek yıkanır Her bir deri diski PTFE borudan dikkatlice uzaklaştırılır ve deiyonize su içeren (8ml) bir küçük şişeye (ör. 20ml’lik cam sintilasyon şişesi) yerleştirilir. Şişeler fazla/ bağlanmamış boyayı uzaklaştırmak için 5 dakika yavaşça karıştırılır. Bu temizleme yöntemi daha sonra tekrar edilir, deri diskleri uzaklaştırılır ve 5ml, saf suda %30 (w/v) sodyum dodesil sülfat (SDS)içeren küçük şişelere konur ve 60oC derecede bir gece inkübe edilir. İnkübasyondan sonra her bir deri diski uzaklaştırılır ve atılmış ve kalan çözelti 21oC’de 8 dakika santrifüjlenir (bağıl santrifüj kuvveti~175). Süzülen çözeltinin, 1 ml’si 1’e 5 (v/v) oranında [ör. 1ml + 4ml] saf sudaki % 30 (w/v)’luk SDS’le seyreltilir. Çözeltinin optik yoğunluğu (OD) yaklaşık olarak 565nm’de ölçülür.
OD değerlerinden disk başına sülforodamin B boya içeriği hesaplanır (sülforodamin B boyası molar sönüm katsayısı 565nm’de = 8.7 x 104; moleküler ağırlık= 580). Sülforodamin B boya içeriği, her bir deri diski için belirlenir ve daha sonra tekrarlar için ortalama boya içeriği hesaplanır. Ortalama boya bağlanma sonuçları, eşzamanlı kontrol değerlerinin yöntemde kabul edilebilir aralıkta olduğu koşullarda kabul edilir. Kontrol maddeleri ve metodoloji için tanımlanan, önerilen kabul edilebilir boya içeriği aralığı aşağıdaki şekilde tanımlanır:
Test maddeleri, deri disklerine daha kısa sürelerde de(ör. 2 saat) uygulanabilir böylece bu maddelerin ciddi olarak aşındırıcı olanları belirlenir. Ancak, geçerlilik çalışmasında TER yöntemi, bazı test kimyasallarının deri disklerine 2 saat boyunca uygulanmasını takiben aşındırıcı potansiyellerini tahmin etmek için bulunmuştur (2), ayrıca 24 saatlik bir uygulama sonrasında aşındırıcı olan ve olmayan maddelerin tanımlanmasını olanaklı kılmıştır. Test düzeneğinin özellikleri boyutları ve kullanılan deney yöntemi, elde edilen TER değerlerini etkiler. 5kaşındırıcı eşik değeri, özel düzenek ve bu yöntemde tanımlanan işlem kullanılarak elde edilen verilerle oluşturulmuştur. Test koşulları anlamlı olarak değişirse, farklı eşik ve kontrol değerleri uygulanabilir. Bu yüzden metodoloji ve direnç eşik değerleri geçerlilik çalışmasında kullanılan kimyasallardan seçilen bir dizi referans standardının test edilmesiyle kalibre edilir (3).
Test maddesi lokal olarak 4 saat boyunca, üç boyutlu insan cilt modeline (işlevsel bir epidermis alt tabakası ile birlikte yeniden oluşturulmuş epidermis) uygulanır. Aşındırıcı maddeler hücre yaşayabilirliğini, belirlenmiş bir maruz kalma seviyesinde tanımlanan eşik değerin altına düşürme özellikleriyle tanımlıdırlar (belirlendiği gibi, örneğin, MTT indirgeme yöntemi). Yöntemin ilkesi, aşındırıcı olan kimyasalların epidermisin alt tabakasından nüfuz edebildiği (difüzyon veya erozyonla) hipotezine dayanır ve altı çizilen hücre tabakalarında hücre ölümüne neden olacak derecede sitotoksiktir(hücreler için zehirli karakter taşıyan madde).
İnsan cilt modelleri çeşitli kaynaklardan gelebilir fakat belli kriterler karşılanmalıdır. Modelin, canlı bir hücre temel tabakası ile işlevsel bir epidermis alt tabakası olmalıdır. Epidermis alt tabakasının bariyer fonksiyonu uygun olmalıdır. Bu durum hücrelere sitotoksik olduğu bilinen fakat normalde epidermisin alt tabakasından geçmeyen maddelerin uygulanmasını takiben, modellerin sitotoksiteye gösterdikleri dirençle açıklanabilir. Model tanımlanan deney koşullarında tekrarlanabilir sonuçlar vermelidir. Modeldeki canlı hücrelerin yaşayabilirliği, pozitif ve negatif kontrol maddeler arasındaki ayrımı iyi yapacak yeterlilikte olmalıdır. Hücre yaşayabilirliği (örneğin MTT düşüşlerinin miktarı olarak ölçülür, ör. OD değeri) belirli model için negatif kontrol maddesine maruz kalmasını takiben kabul edilebilir sınırlarda olmalıdır. Benzer olarak, pozitif kontrol maddeleriyle birlikte hücre yaşayabilirlik değerleri (negatif kontrol için olanlara göre ) belirlenen sınırlarda olmalıdır. En önemlisi kullanılan tahmin modelinin uluslararası geçerlilik standartlarını karşıladığını göstermelidir.
Sıvı maddeler için, cilt yüzeyini kaplayacak yeterlilikte (en az 25μl/cm²) test maddesi uygulanmalıdır. Katı materyaller için, cilt yüzeyini kaplayacak yeterlilikte test maddesi uygulanmalıdır ve cilde iyi temas etmesi için ıslatılmalıdır, uygun yerlerde, katı uygulanmadan önce ezilerek toz haline getirilmelidir. Uygulama yönteminin geniş bir kimyasal tipi aralığı için uygun olduğu gösterilmelidir. (ör. Bakınız kaynak 2). Maruz kalma süresinin sonunda, test maddesi cilt yüzeyinden tuzlu su çözeltisiyle yıkanarak uzaklaştırılmalıdır.
Herhangi bir nicel, geçerli yöntem hücre yaşayabilirliğini ölçmek için kullanılabilir. En sık kullanılan yöntem çeşitli laboratuarlarda doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar verdiği bilinen MTT indirgemesidir(2). Deri diski 0.3mg/ml’lik MTT çözeltisinde 20-28°C’de 3 saat boyunca tutulur. Çöken mavi formazan ürünü daha sonra ekstrakte edilir (katı ekstraksiyonu) ve formazan derişimi 545 ve 595 nm’de OD belirlenerek ölçülür.
Kullanılan cilt modeli ve maruz kalma süresinin tam protokolü ve yıkama yöntemleri vs.’nin hücre yaşayabilirlik sonuçları üzerinde önemli bir etkisi olacaktır. Yöntemin ve tahmin modelinin ECVAM geçerlilik çalışmasında kullanılan kimyasallardan seçilen bir dizi referans standardının test edilmesiyle kalibre edilmesi tavsiye edilir (3). Kullanılan yöntemin laboratuvarlar içinde ve arasında pek çok kimyasal için Ulusal standartlara uygun olarak tekrarlanabilir olduğunun gösterilmesi önemlidir. En azından yöntem daha önceden tanımlanan bilimsel geçerlilik kriterlerini karşılamalıdır (2) ve böyle bir geçerlilik çalışmasının sonuçları saygınlığı ve güvenilirliği kanıtlanmış bilimsel bir dergide yayınlanmalıdır.
Test maddesi, pozitif ve negatif kontroller ve herhangi bir standart referans kimyasalı için direnç değerleri (k) çizelge halinde rapor edilmelidir. Bu çizelgeye tekrarlar/tekrar edilen deneylerle ilgili veriler, ortalama değerler ve türetilen sınıflandırma da dahil edilmelidir.
Test maddesi için OD değerleri ve hesaplanan yüzde hücre yaşayabilirlik verileri, pozitif ve negatif kontroller ve herhangi bir standart referans kimyasalı, çizelge halinde rapor edilmelidir. Bu çizelgeye tekrarlar/tekrar edilen deneylerle ilgili veriler, ortalama değerler ve türetilen sınıflandırma da dâhil edilmelidir.
Test maddesi için elde edilen ortalama TER değeri 5k’dan büyükse madde aşındırıcı değildir. TER değeri 5k’ya eşit veya ondan küçükse ve test maddesi yüzey aktif veya nötr organik değilse o zaman aşındırıcıdır. TER değerleri 5k’ya eşit veya bundan daha küçük olan yüzey aktif maddeler veya nötr organik çözücüler için, boyanın nüfuz etmesi uygulanabilir. Ortalama disk boya içeriği, eş zamanlı olarak elde edilen %36’lık HCl pozitif kontrolün ortalama disk boya içeriğinden büyükse veya buna eşitse, o zaman test maddesi doğru pozitiftir ve aşındırıcıdır. Ortalama disk boya içeriği, eş zamanlı olarak elde edilen %36’lık HCl pozitif kontrolün ortalama disk boya içeriğinden küçükse, o zaman test maddesi yanlış pozitiftir ve aşındırıcı değildir.
Negatif kontrol OD değeri %100 hücre yaşayabilirliğini ifade eder; bu yüzden her bir test örneği için elde edilen OD değerleri negatif kontrole göre yüzde yaşayabilirlik hesaplanmasında kullanılabilir. Aşındırıcı test maddelerini, aşındırıcı olmayanlardan ayıran (veya farklı aşındırıcı sınıfları arasında ayırım yapan) kesme yüzde, hücre yaşayabilirlik değeri tahmin yönteminde, yöntem geçerli kılınmadan önce açık şekilde tanımlanmalıdır ve sonraki geçerlilik çalışması kesme değerinin uygun olduğunu göstermelidir (ör. bakınız kaynak 2).
Test maddesi aşağıdaki bilgileri içermelidir. Test maddesi:
Test koşulları:
Sonuçlar:
Sonuçların tartışılması. Sonuçlar.
|