FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- KAYNAKLAR Bu yöntem OECD TG 418’e eşdeğerdir. B. 38. ORGANOFOSFORLU MADDELERİN GECİKMİŞ NÖROTOKSİSİTESİ- TEKRARLI DOZ ÇALIŞMASI 28 GÜN
- KAYNAKLAR Bu yöntem OECD TG 419’a eşdeğerdir. B.39. MEMELİ KARACİĞER HÜCRELERİNDE IN VIVO PROGRAMLANMAMIŞ DNA SENTEZİ (UDS) TESTİ
VERİLER Bu yöntemde seçilen, sonlanma noktalarındaki negatif sonuçlar (biyokimya, histopatoloji ve davranışsal gözlem) normalde gecikmiş nörotoksisite için daha fazla teste ihtiyaç duymaz. Bu sonlanma noktaları için şüpheli ya da uyumsuz olan sonuçların ayrıca değerlendirilmesi gerekir. Veriler ayrı ayrı sağlanmalıdır. Ek olarak, tüm veriler her bir test grubu için hayvan sayısını, doku bozulmalarının, davranışsal ve biyokimyasal etkileri, bu etkilerin ve doku bozulmalarının türünü ve şiddetini ve her türde ve şiddette doku bozulması hayvan sayısını gösteren çizelge halinde özetlenmelidir. Bu çalışmadaki bulgular davranışsal, biyokimyasal ve histopatolojik etkilerin sıklığı, şiddeti ve ilişkisi ve muamele ve kontrol gruplarında gözlenen diğer etkilerle ilgili olarak değerlendirilmelidir. Rakamsal sonuçlar uygun ve genellikle kabul görmüş istatistiksel yöntemlerle değerlendirilmelidirler. İstatistiksel yöntemler çalışma tasarlanırken belirlenmelidir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir: Test hayvanları:
Test koşulları:
Sonuçlar:
Bu yöntem OECD TG 418’e eşdeğerdir. B. 38. ORGANOFOSFORLU MADDELERİN GECİKMİŞ NÖROTOKSİSİTESİ- TEKRARLI DOZ ÇALIŞMASI 28 GÜN
Maddelerin toksik etkileri ele alınırken ve değerlendirilirken, belirli madde sınıflarının diğer toksisite çalışmalarıyla belirlenemeyen özgün nörotoksisite türlerine neden olma potansiyelleri dikkate alınmalıdır. Belli organofosforlu maddelerin gecikmiş nörotoksisiteye neden olduğu gözlenmiştir ve bu maddeler değerlendirme için aday olarak düşünülmelidir. In vitro tarama testleri gecikmiş polinöropatiye neden olan maddeleri tanımlamak için uygulanır ancak in vitro çalışmalardan elde edilen negatif sonuçlar test maddesinin nörotoksik madde olmadığının kanıtı değildir. 28 gün gecikmiş nörotoksisite testi sınırlı bir süre içinde, tekrarlı maruz kalma sonucu ortaya çıkabilecek olası sağlık zararları hakkında bilgi sağlar. Doz-cevap ilişkisi hakkında bilgi ve maruz kalma için güvenlik kriterlerinin oluşturulmasında kullanılacak olan olumsuz etkinin gözlemlenmediği seviyenin tahmin edilmesini sağlar. Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Organofosforlu maddeler yüksüz organofosfor esterleri, tiyoesterler veya organofosforik, organofosfonik veya organofosforamik asitlerin anhidritleri veya ilgili fosforotiyoik, fosfonotiyoik veya fosforotiyoamidik asit veya bazen bu grup arasında rastlanan, gecikmiş nörotoksisiteye neden olan diğer maddeleri içine alır. Gecikmiş nörotoksisite uzun süreli gecikmiş ataksi başlangıcı, omurilik ve periferal sinirlerde distal aksonopatiler ve sinir dokularında nöropati hedef esterazın (NTE) engellemesi ve eskimesi ile beraber görülen bir sendromdur.
Maddenin günlük dozları ağız yoluyla yerli dişi kuşlara 28 gün boyunca uygulanır. Hayvanlar en azından her gün davranış anomalileri, ataksi ve paraliziçin son dozdan sonraki 14. güne kadar gözlenirler. Biyokimyasal ölçümler, özellikle nöropati hedef esteraz engellenmesi (NTE), her gruptan rastgele seçilen kuşlardan son dozun uygulanmasından normalde 24 ve 48 saat sonra alınırlar. Maruz kalmadan iki hafta sonra kalan kuşlar öldürülür ve alınan sinir dokular histopatolojik incelemelere tabi tutulur.
Viral hastalığı bulunmayan, ilaç verilmeyen, yürüyüşünde anomali bulunmayan sağlıklı, genç, erişkin dişi kuşlar rastgele seçilirler ve kontrol ve muamele grubu olarak ayrılırlar ve çalışmanın başlamasından en az beş gün önce laboratuvar şartlarına alıştırılırlar. Kafesler kuşların rahat hareket etmesini sağlayacak genişlikte olmalıdır ve yürüyüşleri kolayca gözlenebilmelidir. Oral yolla haftada 7 gün boyunca doz uygulanır tercihen sonda kullanarak veya jelâtin kapsülle verilir. Sıvılar seyreltilmemiş olarak veya mısır yağı gibi uygun bir taşıyıcıda çözünerek verilebilirler, eğer mümkünse, katıların büyük dozları jelâtin kapsül içinde yeterince absorblanamayacağı için katılar çözülmelidir. Sulu olmayan taşıyıcılar için, taşıyıcının toksik özellikleri bilinmelidir, bilinmiyorsa da testten önce belirlenmelidir
8–12 aylık, genç ergen yumurtlayan evcil kuşlar (Gallus gallus domesticus) tavsiye edilir. Standart büyüklükteki cins ve türler kullanılmalıdır ve kuşlar normalde rahat hareket sağlayan koşullarda yetiştirilmelidir.
Genellikle üç muamele grubu ve bir taşıyıcı kontrol grubu kullanılmalıdır. Taşıyıcı kontrol grubu test maddesi verilmeden, uygulama grubuyla aynı şekilde muamele edilmelidir. Her bir kuş grubu için yeterli sayıda kuş kullanılmalıdır böylece biyokimyasal belirlemeler için en az altı (her iki zamanlamasında için üç adet) kuş öldürülebilir ve altı kuş da muamele sonrasındaki patolojik inceleme amaçlı 14-günlük gözlem süresi içinde sağ kalır.
Dozlar gecikmiş nörotoksisiteyle ilgili akut test sonuçları ve test bileşiğiyle ilgili mevcut diğer toksisite ve kinetik verileri dikkate alınarak seçilmelidir. En yüksek doz toksisite etkileri tercihen nörotoksisiteyi uyarmak amacıyla seçilmelidir ancak ne ölümü ne de belirgin rahatsızlıkları indüklemesi beklenmez. Bundan sonra doza bağlı cevabı ve en düşük dozda, hiçbir olumsuz etkinin gözlemlenmediği düzeyi gösteren azalan dizi halindeki doz grupları seçilmelidir
Eğer bu çalışma için tanımlanan işlemler kullanılarak uygulanan 1000 mg/kg vücut ağırlığı/gün doz seviyeli bir sınır testi gözlenebilen herhangi bir toksik etki meydana getirmiyorsa ve eğer yapısal olarak benzer maddelerle ilgili verilere dayanılarak toksisite beklenmiyorsa bu durumda daha yüksek doz kullanılarak yapılacak kapsamlı bir çalışmaya gerek olmayabilir.Beklenen insan maruz kalması daha yüksek doz kullanılması gerektiğine işaret etmedikçe, sınır testi uygulanır.
Tüm hayvanlar maruz kalma süresi ve sonraki 14 gün boyunca, günlük olarak, planlanan otopsi zamanına kadar gözlenirler.
Hayvanlara 28 gün boyunca haftada yedi gün test maddesi uygun dozda uygulanır.
Gözlemler uygulamadan hemen sonra başlamalıdır. Tüm kuşlar günde en az bir defa 28 günlük muamele süresince ve doz uygulanmasından sonraki 14 gün boyunca veya planlanan öldürme zamanına kadar dikkatlice gözlenmelidirler. Başlama zamanı, türü, şiddeti ve süresi dâhil tüm toksisite belirtileri kaydedilmelidir. Gözlemlere davranış bozuklukları dâhil olmalı ancak gözlemler bununla sınırlı olmamalıdır. Sıralı dereceli bir ölçekte en az dört dozda ataksi (adalelerde uyum bozukluğu) ölçülmelidir ve paraliz (felç) not edilmelidir. Haftada en az iki defa kuşlar kafesin dışına alınmalı ve minimum toksik etkilerin gözlenebilmesini kolaylaştırmak için bir süre merdiven tırmanmak gibi zorlanmış motor hareketlerine tabi tutulmalıdır. Ölmek üzere olan hayvanlarla şiddetli acı ve ağrı çeken hayvanlar bu durumun farkına varıldığında uzaklaştırılıp, insanca öldürülmeli ve hayvanlara otopsi yapılmalıdır.
Bütün kuşlar test maddesinin ilk uygulamasından hemen önce ve uygulama sonrasında da haftada en az bir kere tartılmalıdır.
Her bir muamele ve taşıyıcı kontrol grubundan rastgele seçilen altı kuşlar doz uygulandıktan sonra birkaç gün içinde öldürülmelidir ve hazırlanan, beyin ve bel omuriliği nöropati hedef esteraz (NTE) engelleme etkinliği için test edilir. Ek olarak, siyatik sinir dokununda nöropati hedef esteraz (NTE) engelleme etkinliği için hazırlanması ve analiz edilmesi faydalı olabilir. Normalde kontrol grubundan ve her bir muamele grubundan üç hayvan 24 saat sonra üç tane de son dozun uygulanmasından 48 saat sonra öldürülür. Eğer akut toksisite veya diğer çalışmalardan (ör.toksikokinetik) elde edilen veriler son dozun uygulanmasından sonraki diğer öldürme zamanlarının tercih edilebilir olduğuna işaret ederse, bu zamanlar kullanılmalı ve bunun için gerekçe sunulmalıdır. Eğer uygun olduğu düşünülüyorsa, bu örnekler üzerinde ayrıca asetilkolinesteraz (AChE) analizi de yürütülebilir. AChE’nin in vivo çalışmasında kendiliğinden etkinleşmesi gerçekleşebilir ve böylece maddenin AChE inhibitörü olma potansiyeli göz ardı edilir.
Tüm hayvanların otopsisi beyin ve omuriliğin görünümlerinin gözlenmesini de içine alır.
Biyolojik inceleme için kullanılmayacak olan ve gözlem süresinde sağ kalan hayvanlardan alınan sinir doku mikroskop altında incelenmelidir. Dokular perfüzyon teknikleri kullanılarak in situ sabitlenmelidir. Kesitler beyincik medulla oblongata, omurilik ve periferal sinirleri kapsar. Omurilik üst boyun kesimden, orta göğüs ve kuyruk sokumu bölgelerinden alınmalıdır. Kaval kemiği sinirlerinin distal bölgesinin kesiti ve baldır ikiz kaslarına uzanan dalları ve kalça sinirlerinin kesiti alınmalıdır. Kesitler miyelin ve aksona- özgü uygun boyalarla boyanmalıdır. Başlangıç olarak, mikroskobik incelemeler kontrol grubu ve yüksek doz grubundaki tüm hayvanlardan elde edilen dokularda yürütülmelidir. Yüksek doz grubunda etkilere dair kanıtlar varsa, mikroskobik inceleme ara ve düşük doz gruplarındaki hayvanlar için de ayrıca yürütülmelidir.
Bu yöntemde seçilen sonlanma noktalarındaki negatif sonuçlar için (biyokimya, histopatoloji ve davranışsal gözlem) normalde daha fazla gecikmiş nörotoksisite testine ihtiyaç duyulmaz. Bu sonlanma noktaları için şüpheli ya da uyumsuz olan sonuçların ayrıca değerlendirilmesi gerekebilir. Her bir veri ayrı ayrı sağlanmalıdır. Ek olarak, tüm veriler her bir test grubu için hayvan sayısını, doku bozulmalarına, davranışsal ve biyokimyasal etkileri, bu etkilerin ve doku bozulmalarının türünü ve şiddetini ve her türde ve şiddette doku bozulması gösteren hayvan sayısını gösteren çizelge halinde özetlenmelidir. Bu çalışmadaki bulgular davranışsal, biyokimyasal ve histopatolojik etkilerin sıklığı, şiddeti ve ilişkisi ve muamele ve kontrol gruplarında gözlenen diğer etkilerle ilgili olarak değerlendirilmelidir. Rakamsal sonuçlar uygun ve genellikle kabul görmüş istatistiksel yöntemlerle değerlendirilmelidirler. İstatistiksel yöntemler çalışma tasarlanırken belirlenmelidir.
Test raporu, mümkünse, aşağıdaki bilgileri içermelidir: Test hayvanları:
Test koşulları:
Sonuçlar:
Sonuçların tartışılması Sonuçlar.
Bu yöntem OECD TG 419’a eşdeğerdir. B.39. MEMELİ KARACİĞER HÜCRELERİNDE IN VIVO PROGRAMLANMAMIŞ DNA SENTEZİ (UDS) TESTİ
Bu yöntem OECD TG 486, Memeli Karaciğer Hücrelerinde in vivo Programlanmamış DNA Sentezi (UDS) Testi (1997) ‘ne eşdeğerdir.
Memeli Karaciğer Hücrelerinde in vivo Programlanmamış DNA Sentezi (UDS) Testi’nin amacı uygulama yapılan hayvanların karaciğer hücrelerinde DNA onarımını uyaran test maddelerinin tespit edilmesidir (bakınız 1,2,3,4). Bu in vivo test, kimyasalların karaciğer üzerindeki genotoksik etkilerinin araştırılmasını sağlar. Ölçülen son nokta, karaciğerdeki DNA hasarının ve sonrasındaki onarımın göstergesidir. Karaciğer absorblanan bileşiklerin metabolizması için temel organdır. Bu yüzden DNA hasarının in vivo ölçülmesi için de uygundur. Eğer test maddesinin hedef dokuya ulaşamayacağı düşünülüyorsa, bu testin kullanılması uygun değildir. Programlanmamış DNA sentezinin son noktası (UDS), planlı olarak (S fazı) DNA sentezine gitmeyen hücrelerdeki işaretli nükleozidlerin alımlarının belirlenmesiyle ölçülür. En yaygın olarak kullanılan teknik trityumla işaretlenmiş timidin (3H-TdR) alımının otoradyografiyle belirlenmesidir. In vivo UDS testlerinde tercihen sıçan karaciğeri kullanılır. Karaciğer dokularından başkadokular da kullanılabilir, fakat bu testte yer almamaktadır. Bir UDS cevabının tespit edilmesi, hasar yerinde çıkarılan ve yer değiştiren DNA bazlarının sayısına bağlıdır. Bu yüzden, UDS testi maddeyle uyarılmış uzun yama onarım (longpatch repair) (20–30 baz) tespitinde oldukça önemlidir. Tersine, kısa yama onarım (1–3 baz) daha az duyarlılıkla tespit edilir. Bundan başka, mutajenik olaylar, DNA hasarlarının onarılamaz, yanlış onarılmış veya yanlış eşleşmesine uğramış olmalarından kaynaklanabilir. UDS cevabının derecesi, onarım işleminin doğruluğu ve uygunluğu hakkında herhangi bir gösterge sunmaz. Ek olarak, şu da münkündür, mutajen DNA ile reaksiyona girer fakat DNA hasarı eksizyon (kesip çıkarma) onarım işlemiyle onarılmaz. UDS testiyle elde edilen mutajenik etkinlik ile ilgili bilgi eksikliği bu son noktanın potansiyel duyarlılığının belirlenebilmesiyle telafi edilmiştir çünkü son nokta tüm genom için ölçülmüştür. Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Onarımdaki hücreler: Testin yürütüldüğü laboratuvarda önceden doğrulanmış olan değerden daha yüksek olan net nükleer granül (NNG) Net nükleer granül (NNG): Otoradyografik UDS testlerindeki hücrelerin UDS etkinliklerinin nicel ölçümüdür, nükleer granül (NG) sayısından, çekirdek-eşdeğeri sitoplazmik alanlardaki ortalama sitoplazmik granül sayısının çıkarılmasıyla hesaplanır: NNG = NG - CG. NNG sayımları her bir hücre için hesaplanır ve sonrasında kültürdeki, paralel kültürlerdeki vs. hücreler için bir araya getirilir. Programlanmamış DNA Sentezi (UDS): Kimyasal maddelerle veya fiziksel ajanlarla uyarılmış hasarlı bölgenin DNA’dan çıkarılıp uzaklaştırılmasından sonraki DNA onarım sentezi.
Memeli karaciğeri in vivo UDS testi, kimyasal maddelerle veya fiziksel etkenlerle uyarılmış hasarlı bölgenin DNA’dan çıkarılıp uzaklaştırılmasından sonraki DNA onarım sentezine işaret eder. Test, genellikle 3H-TdR’nin hücre döngüsünün S-fazındaki düşük frekanslı karaciğer hücrelerinin DNA’sına katılmasına dayanır. 3H-TdR alımı genellikle otoradyografiyle belirlenir çünkü bu teknik S-fazından gelen etkileşimlere, örneğin sıvı sintilasyon sayımı kadar duyarlı değildir.
Yaygın olarak sıçanlar kullanılır ancak diğer uygun memeli türleri de kullanılabilir. Genç, sağlıklı, erişkin hayvanların yaygın olarak kullanılan laboratuvar suşları kullanılmalıdır. Deneyin başında, hayvanlardaki ağırlık değişkenliği aralığı her iki cins için de, uygun ortalama değerin % 20’sini geçmemelidir.
Genel koşullar, Genel Giriş Kısım B’de belirtildiği şekilde uygulanır, nemlilik % 50–60 arasında olmalıdır.
Sağlıklı genç yetişkin hayvanlar rastgele kontrol ve muamele gruplarına ayrılırlar. Kafesler yerleştirilmelerinden kaynaklanacak olası etkileri en az indirecek şekilde yerleştirilirler. Hayvanlar ayrı ayrı kimliklendirilirler ve kafeslerine, laboratuvar koşullarına alışmaları için en az beş gün önceden konulurlar.
Eğer uygunsa, hayvanlara doz uygulaması yapılmadan önce, katı test maddesi uygun çözücüler veya taşıyıcılar içinde çözülmeli veya askıda kalmalı ve seyreltilmelidir. Sıvı test maddeleri doğrudan doz verilebilir veya seyreltilebilirler. Kararlılıklarıyla ilgili veriler, saklanmasının uygun olduğunu göstermedikçe test maddesinin taze hazırlanmış olanları uygulanmalıdır.
Çözücü/taşıyıcı kullanılan doz seviyelerinde toksik etki meydana getirmemelidir ve test maddesiyle kimyasal reaksiyona gireceğinden şüphe duyulmamalıdır. Eğer çok iyi bilinen çözücüler/taşıyıcılar dışındakiler kullanılırsa, içerikleri uyumluluklarını gösteren verilerle desteklenmelidir. Uygun olan her yerde, sulu çözelti/taşıyıcının kullanılmasının düşünülmesi tavsiye edilir.
Deneyin bağımsız olarak uygulanan her bir bölümünde eş zamanlı pozitif ve negatif (çözücü veya taşıyıcı) kontroller olmalıdır. Test maddesiyle muamele haricinde, kontrol grubundaki hayvanlar, muamele grubundaki hayvanlarla eşit şartlarda tutulmalıdırlar. Pozitif kontrollerin, arka planda tespit edilebilir artış sağlaması beklenen maruz kalma seviyelerinde uygulandığında, UDS oluşturması beklenir. Metabolik aktivasyona ihtiyaç duyan pozitif kontroller, orta şiddette cevap ortaya çıkaran dozlarda kullanılmalıdır (4). Dozlar etkilerin açıkça görülebileceği şekilde seçilebilir, fakat işaretli lamların okuyucu tarafından hemen anlaşılabilmesini sağlamaz. Pozitif kontrol madde örnekleri:
Diğer uygun pozitif kontrol maddeleri kullanılabilir. Pozitif kontrolün test maddesinden farklı bir yolla uygulanması kabul edilebilir.
Test cevabındaki doğal biyolojik çeşitliliği dikkate almak adına yeterli sayıda hayvan kullanılmalıdır. Analiz edilecek hayvanların sayısı grup başına en az 3 olmalıdır. Geçmişe yönelik anlamlı bir veritabanının oluşturulduğu durumlarda, eşzamanlı negatif ve pozitif kontrol grupları için sadece 1 veya 2 hayvan yeterlidir. Çalışma sırasında aynı türde yapılmış ve aynı uygulama yolunun kullanıldığı çalışmalara ait veriler varsa ve bu veriler cinsiyetler arasında toksisite açısından belirgin bir fark olmadığını gösteriyorsa, tek bir cinsiyetle, tercihen erkek hayvanlarla, testin uygulanması yeterli olacaktır. İnsanların kimyasallara maruz kalması bazı farmasötik maddeler için cinsiyete özgü olabilir, böyle durumlarda test uygun cinsiyetdeki hayvanla yürütülmelidir.
Test maddeleri genelde tek uygulama şeklinde verilirler.
Normalde en az iki doz kullanılır. En yüksek doz, toksisite belirtileri meydana getiren doz olarak tanımlanır öyle ki daha yüksek dozlarının aynı doz kürü uygulanarak ölüm meydana getirmesi beklenir. Genelde, daha düşük dozların yüksek dozun %25-50’si arasında olması beklenir. Toksik olmayan dozlarda özel biyolojik aktivite gösteren maddeler (hormonlar, mitojenler) doz hazırlama kriterleri için istisna olabilir ve ayrı ayrı değerlendirilmelidir. Eğer elde veri mevcut olmadığından bir aralık bulma çalışması uygulanırsa, bu uygulama asıl çalışmanın yapılacağı laboratuvarda, asıl çalışmada kullanılacak ırk, tür, ve doz kürü kullanılarak yapılmalıdır. En yüksek doz ayrıca karaciğerde bazı toksisite belirtileri meydana getiren doz olarak da tanımlanabilir. (ör. piknotik çekirdekler)
Eğer bir testten tek 2000 mg/kg vücut ağırlığı doz tek bir muamelede veya aynı günde iki muamelede uygulandığında, gözlenebilen herhangi bir toksik etki meydana getirmiyorsa ve yapısal olarak ilgili maddelerden elde edilen verilere dayanılarak genotoksisite beklenmiyorsa bu durumda daha yüksek doz kullanılarak yapılacak kapsamlı bir çalışmaya gerek olmayabilir. İnsanda beklenen maruz kalma, sınır testinde daha yüksek doz kullanılması gerektiğine işaret edebilir.
Test maddesi genellikle gavaj yöntemi kullanılarak sonda ile beslemeyle veya mideye uygun bir elastik boru sokulmasıyla uygulanır. Diğer maruz kalma yolları da gerekçelendirildikleri takdirde kabul edilebilir olabilir. Ne var ki karın içine enjeksiyon yolu tavsiye edilmez çünkü madde dolaşım sistemine girmeden, karaciğer doğrudan maddeye maruz kalır. Sonda ile veya enjeksiyonla tek seferde uygulanabilecek maksimum sıvı hacmi test hayvanının büyüklüğüne bağlıdır. Hacim 2 ml/100g vücut ağırlığını geçmemelidir. Bundan daha büyük hacimlerin kullanılması gerekçelendirilmelidir. Normalde daha yüksek konsantrasyonlarda daha kötü etkiler meydana getiren tahriş edici ve aşındırıcı maddeler haricindeki maddeler için konsantrasyonun tüm doz seviyelerinde sabit olacak şekilde ayarlanmasıyla test hacmindeki değişkenlik en aza indirilmelidir.
Karaciğer hücreleri doz uygulaması yapılan hayvanlardan normalde doz uygulanmasından 12–16 saat sonra hazırlanır. 12–16 saatte açık bir pozitif cevap olmadığı sürece ilave olarak daha öncesinde örnek alınması (normalde muameleden 2–4 saat sonra) gerekir. Ancak, alternatif örnek alma zamanları toksikokinetik verilere dayanılarak gerekçelendirildiği takdirde kullanılabilir. Memeli karaciğer hücrelerinin kısa süreli kültürleri genellikle karaciğerin kollajenazla doğal durumda(in situ) perfüzyonuyla oluşturulur ve yeni ayrıştırılan karaciğer hücrelerinin uygun bir yüzeye tutunması sağlanır. Negatif kontrol hayvanlarından elde edilen karaciğer hücrelerinin yaşama kabiliyeti (5) en az yüzde 50 olmalıdır.
Yeni izole edilmiş memeli karaciğer hücreleri genellikle 3H-TdR içeren bir ortamda 3-8 saat gibi uygun bir zaman uzunluğunda inkübe edilir. İnkübasyon süresi sonunda, fazladan işaretlenmemiş timidin içeren hücreler birleşik olmayan radyoaktiviteyi (soğuk izleme) azaltmak için ortamdan uzaklaştırılmalıdır. Hücreler daha sonra durulanır, sabitlenir ve kurutulur. Daha da uzun inkübasyon süreleri için soğuk izleme gerekli olmayabilir. Lamlar otoradyografik emülsiyona daldırılır, karanlığa maruz bırakılırlar (7-14 gün buzdolabında saklanır), geliştirilir, boyanır ve maruz kalan gümüş granüller sayılır. Her bir hayvandan iki veya üç lam hazırlanır.
Lam örnekleri, UDS’nin anlamlı değerlendirilmesini sağlayacak normal morfolojideki hücrelerden yeterince içermelidir. Örnekler açık şekilde görülen sitotoksisite belirtileri için mikroskobik olarak incelenirler. (ör. piknoz, düşük seviyede radyo işaretleyicili). Lamlar granüllerin sayılmasından önce işaretlenirler. Normalde her bir hayvandan en az iki lam için 100 hücre sayılır, 100 hücre/hayvan’dan daha az sayımların gerekçesi belirtilmelidir. Granül sayımları S-fazı çekirdekleri için yapılmaz, fakat S-fazı hücrelerinin oranı kaydedilebilir. Gümüş granüllerin birikmesiyle ortaya çıkan (morfolojik olarak normal olan hücrelerde ve çekirdeklerdeki )3H-TdR katılım miktarı uygun yöntemler kullanılarak belirlenmelidir. Granül sayımları çekirdekler (nükleer granüller, NG) ve sitoplazmadaki çekirdek eşdeğeri alanlarda (sitoplazmik granüller, CG) üzerinden belirlenir. CG sayımları sitoplazmanın en yoğun işaretlenmiş alanı veya çekirdeğe bitişik rastgele iki veya üç sitoplazmik granül ortalaması alınarak ölçülür. Diğer sayma yöntemleri (ör.tam hücre sayımı) eğer gerekçelendirilirse, kullanılabilir (6).
|