FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- B. 36. TOKSİKOKİNETİK YÖNTEM
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B). B. 37. ORGANOFOSFORLU MADDELERE AKUT MARUZ KALMANIN ARDINDAN GECİKMİŞ NÖROTOKSİSİTE ÇALIŞMASI
VERİLER
Veriler ayrı ayrı rapor edilmeli ve her bir test grubu ve nesil için testin başındaki hayvan sayısını, test sırasında ölü bulunan veya insani nedenlerle öldürülen hayvan sayısını, ölüm veya öldürülme zamanı, doğurgan hayvanların sayısı, hamile dişilerin sayısı, toksisite belirtisi gösteren hayvanların sayısını, gözlenen toksisite belirtilerinin, toksik etkilerin başlama zamanı, süresi ve şiddeti dâhil, detaylı tanımlarını, parental (ana) ve yavru (döl) gözlemlerinin türleri, histopatolojik değişiklikleri ve bir batında doğan yavruyla ilgili tüm verili tablo halinde özetlemelidir. Sayısal sonuçlar uygun, genellikle kabul görmüş istatistiksel yöntemlerle değerlendirilmelidir; İstatistiksel yöntemler çalışmanın bir parçası olarak seçilmeli ve doğrulanmalıdırlar. Doz-cevap ilişkisi istatistiksel modelleri veri analizleri için uygun olabilir. Rapor analiz yöntemiyle ilgili yeterli bilgiyi ve uygulanan bilgisayar programını içermelidir böylece bağımsız eleştirmen/istatistikçi analizi yeniden değerlendirilebilir ve yeniden yapabilir.
İki nesilli üreme toksisite testinin sonuçları otopsi ve mikroskobik bulguları içeren gözlenen etkiler temel alınarak değerlendirilmelidir. Değerlendirme, test maddesinin dozu ve anomalilerin varlığı veya yokluğu, oluş sıklığı ve şiddeti arasındaki ilişkiyi kapsar. Bu anomalilar büyük lezyonlar (bir dokunun yapı veya vazifesinin patalojik bir sebeple arızaya uğraması), tanımlanan hedef organlar, etkilenmiş doğurganlık, klinik anomaliler, etkilenmiş üreme ve yavru performansı, vücut ağırlığındaki değişiklikler, ölüm üzerindeki etkiler ve diğer toksik etkilerdir. Test maddesinin fizikokimyasal özellikleri ve mevcutsa, toksisitekinetiği verileri test sonuçları değerlendirilirken göz önünde bulundurulmalıdır. Uygun şekilde yürütülen üreme testi hiçbir olumsuz etkinin gözlemlenmediği düzeyin tahmin edilmesini ve üreme, doğum, salgılama, büyüme ve cinsel gelişim dâhil dogum sonrası gelişim üzerindeki olumsuz etkilerin anlaşılmasını sağlamalıdır.
İki nesilli üreme toksisite çalışması üreme döngüsünün tüm evreleri boyunca maddeye tekrarlı maruz kalma etkileri hakkında bilgi sağlayacaktır. Çalışma özellikle, üreme parametreleri (karakteristik özellik), dölün gelişmesi, büyümesi, olgunlaşması ve yaşaması üzerine bilgi sağlar. Çalışmanın sonuçları subkronik, doğum öncesi gelişme ve toksikokinetik ve diğer mevcut çalışmalardan elde edilen bulgularla birleştirilerek yorumlanmalıdır. Bu çalışmanın sonuçları kimyasalın ilave bir teste ihtiyacı olup olmadığının değerlendirilmesinde kullanılır. Çalışmanın sonuçlarının ekstrapolasyonu (dış değer bulma) bir sınır değere kadar geçerlidir. Bunlar hiç bir etkinin gözlenmediği ve müsaade edilen insan maruz kalması hakkında en iyi bilgiyi sağlarlar (20) (21) (22) (23).
Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir: Test maddesi:
Taşıyıcı ( uygunsa):
Test hayvanları:
Test koşulları:
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York. (2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92-108. (3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54:103-107. (4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. ReproductiveToxicology 5:39 44 (5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat,Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237- 244. (6) Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6:267- 273. (7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology 13:409-421. (8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449-458. (9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333. (10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415. (11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat SpermMotility. Journal of Andrology 8:330-337. (12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505. (13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298303. (14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Yok.
Test maddesi uygun bir yolla uygulanır. Çalışmanın amacına bağlı olarak, madde hayvan gruplarının bir veya birkaç tanesi için belirlenen sürelerin üzerinde tek seferde veya tekrarlanan dozlarda uygulanabilir. Ardından, çalışmanın türüne bağlı olarak madde ve/veya metabolitler (metabolizmadan gelen maddeler) vücut sıvılarında, dokularında ve/veya vücut atıklarında tayin edilir. Çalışmalar, test maddesinin ‘işaretlenmiş’ veya ‘işaretlenmemiş’ halleriyle yapılabilir. İşaretleyici kullanılan durumlarda, işaretleyici, bileşiğin yapısı hakkında en fazla bilgiyi sağlayacak şekilde yerleştirilmelidir.
Yok.
Hazırlıklar Sağlıklı, genç ve yetişkin hayvanlar testten en az beş gün öncesinden laboratuvar koşullarına alıştırılırlar. Test öncesinde, hayvanlar muamele gruplarına rastgele ayrılır ve tayin edilir. Özel durumlarda, çok genç, hamile veya önceden muamele edilmiş hayvanlar kullanılabilir. Test koşulları Deney hayvanları Toksikokinetik çalışmaları bir veya daha fazla uygun hayvan türünde uygulanabilir ve kullanılan türler dikkate alınarak veya aynı test maddesi üzerindeki diğer toksisite çalışmalarında kullanılması tasarlanabilir. Testte kemirgenler kullanıldığında ağırlık değişimi ortalama ağırlığın %20’sini geçmemelidir. Sayı ve cinsiyet Absorbsiyon (emilim) ve atılımla ilgili çalışmalar için, başlangıçtaki her bir doz grubunda dört hayvan olmalıdır. İki cinsten biri kullanılabilir fakat bazı durumlarda her iki cinsiyetin de çalışılması gerekir. Cevaplarda cinsiyete bağlı farklılıklar varsa, o zaman her iki cinsiyetten de dört hayvan test edilmelidir. Çalışmaların kemirgen olmayan hayvanlarla yürütüldüğü durumlarda daha az hayvan kullanılabilir. Dokulardaki dağılımının çalışıldığı durumlarda, zamana bağlı her bir noktadaki gözden çıkarılacak hayvan sayısı ve incelenecek zamana bağlı noktaların sayısı için başlangıçtaki grup büyüklüğü dikkate alınmalıdır. Metabolizma çalışılmaya başlandığında, grup büyüklüğü çalışmanın ihtiyaçlarına bağlıdır. Çoklu doz ve çoklu-zaman nokta çalışmaları için, zamana bağlı noktaların sayısı ve planlı sonlandırmalar için grup büyüklüğü dikkate alınmalıdır, fakat gruplar en az iki hayvandan oluşmalıdır. Grup büyüklüğü test maddesinin ve/veya metabolitinin alımının, ayarının (plato) ve tükenmesinin (uygunsa) kabul edilebilir şekilde açıklanabilmesini sağlamalıdır. Doz Tekli doz uygulama durumlarında en az iki doz kullanılmalıdır. Düşük dozda hiçbir toksik etki gözlenmemelidir, yüksek dozda ise toksikokinetik parametrelerinde değişiklikler olabilir veya toksik etkiler meydana gelebilir. Tekrarlı doz uygulamalarında düşük doz uygulanması genellikle yeterlidir fakat bazı durumlarda yüksek doz kullanılması da gerekebilir. Yönetim planı Toksikokinetik çalışmalar, diğer toksisite çalışmaları için kullanılmışsa veya kullanılacaksa test maddesi aynı taşıyıcı kullanılarak uygulanmalıdır. Test maddesi deney hayvanlarına belirli sürelerle genellikle oral yolla sonda ile besleme veya diyetle uygulanır veya denek hayvan gruplarında, tanımlanan sürelerde solunum yoluyla uygulanabilir. Test maddesinin damar içine uygulaması diğer yollarla gerçekleşen bağıl absorpsiyonun belirlenmesinde faydalı olabilir. İlaveten, maddenin damar içine uygulanmasından hemen sonra dağılımıyla ilgili faydalı bilgiler sağlanabilir. Taşıyıcının test maddesiyle etkileşmesi olasılığı dikkate alınmalıdır. Test maddesinin sonda ile besleme veya diyetle uygulanması arasındaki absorpsiyon farklılıklarına ve özellikle test maddesi diyetle verildiğinde dozun doğru şekilde tayin edilmesi gerekliliğine dikkat edilmelidir Gözlem süresi Tüm hayvanlar günlük olarak gözlemlenerek toksisite belirtileri ve başlama zamanı, derece ve süre gibi ilgili diğer klinik özellikler kaydedilir. İşlem
Absorpsiyon Uygulanan test maddesinin absorpsiyon alanı ve hızı çeşitli yöntemler kullanılarak referans gruplarıyla birlikte ve referans gruplar olmadan, değerlendirilebilir1 örneğin: -idrar gibi vücut atığı, safra, feçes, solunan hava ve iskelet yapısındaki test maddesinin ve/veya metabolitinin miktarının tayin edilmesi -test ve kontrol ve/veya referans grupları arasındaki biyolojik cevabın (ör. akut toksisite çalışmaları) karşılaştırılması, -test ve referans gruplarında böbrek yoluyla atılan maddenin ve/veya metabolitinin miktarlarının karşılaştırılması, -test maddesinin plazma seviyesi/zaman eğrisi altında kalan alanın belirlenmesi ve/veya referans grup verileriyle karşılaştırılması
-hayvanları maruz kaldıktan sonrasındaki çeşitli zamanlarda gözden çıkararak nitel bilgi elde edilmesi ve test maddesinin ve/veya metabolitinin organ ve dokulardaki miktarı. Atılım Atılımla ilgili çalışmalarda, idrar, feçes ve solunan hava ve bazı durumlarda safra toplanır. Bu atıklardaki test maddesinin ve/veya metabolitinin miktarı maruz kaldıktan sonra çeşitli zamanlarda uygulanan dozun % 95’i atılıncaya kadar veya yedi gün için, hangisi daha önce gelirse, ölçülmelidir. Özel durumlarda süt veren test hayvanlarının sütünde test maddesinin atılımı göz önünde bulundurulmalıdır. Metabolizma Metabolizmanın düzeyi ve yolu belirlenirken biyolojik numuneler uygun tekniklerle analiz edilmelidir. Metabolitlerin yapıları açıklanmalıdır ve daha önceki toksikolojik çalışmalarda ortaya çıkan soruların cevaplanması için uygun metabolik yollar önerilmelidir. Metabolik yollarla ilgili bilgi edinmek için çalışmaların in vitro yürütülmesi faydalı olabilir. Metabolizma-toksisite arasındaki ilişkiye dair daha fazla bilgi, metabolize eden enzim sistemlerindeki etkinin belirlenmesi, iç sebeplerden kaynaklanan, protein olmayan sülfidril bileşiklerinin tüketilmesi ve maddenin makromoleküllere (büyük molekül) bağlanması gibi biyokimyasal çalışmalarla elde edilebilir.
Yürütülen çalışmanın türüne bağlı olarak, veriler uygun yerlerde grafiklerle de desteklenerek çizelge halinde özetlenmelidirler. Her bir test grubu için mümkün ise zaman, dozaj ve dokular ve organlara bağlı ölçümlerin ortalama ve istatistiksel değişkenleri uygun olduğunda gösterilmelidir. Absorpsiyon ve atılım hızlarının miktarı uygun yöntemlerle belirlenmelidir. Metabolizma çalışmaları yürütüldüğünde; tanımlanan metabolitlerin yapıları verilmeli ve olası metabolik yollar gösterilmelidir.
Yürütülen çalışmanın türüne bağlı olarak, test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B). B. 37. ORGANOFOSFORLU MADDELERE AKUT MARUZ KALMANIN ARDINDAN GECİKMİŞ NÖROTOKSİSİTE ÇALIŞMASI
Maddenin toksik etkileri ele alınırken ve değerlendirilirken, belli sınıflardaki maddelerin diğer toksisite çalışmalarıyla belirlenemeyen özgün nörotoksisite türlerine neden olma potansiyellerinin üzerinde düşünmek önemlidir. Belli organofosforlu maddelerin gecikmiş nörotoksisiteye neden olduğu gözlenmiştir ve bu maddeler değerlendirme için aday olarak düşünülmelidir. In vitro tarama testlerigecikmiş polinöropatiye (sinir sistemi hastalığı) neden olan maddeleri tanımlamak için uygulanır, ancak, in vitro çalışmalardan elde edilen negatif sonuçlar test maddesinin nörotoksikan (sinir sistemini etkileyen zehirli madde) olmadığının kanıtı değildir. Ayrıca bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Organofosforlu maddeler yüksüz organofosfor esterleri, tiyoesterler veya organofosforik, organofosfonik veya organofosforamidik asitlerin anhidritleri veya ilgili fosforotiyoik, fosfonotiyoik veya fosforotiyoamidik asitler veya bazen bu grup arasında rastlanan, gecikmiş nörotoksisiteye neden olan diğer maddeleri içine alır. Gecikmiş nörotoksisite: uzun süreli gecikmiş ataksi (adalelerde uyum bozukluğu) başlangıcı, omurilik ve periferal sinirlerde distal aksonopatiler ve sinir dokularında nöropati hedef esterazın (NTE) inhibasyonu ve yaşlanması ile beraber görülen bir hastalık tablosudur.
Bir referans madde laboratuardaki test koşulları altında test edilen türlerin cevaplarının önemli ölçüde değişmediğini göstermek amacıyla pozitif kontrol grubuyla test edilebilir. Yaygın olarak kullanılan nörotoksikanlardan biri tri-o-tolil fosfattır (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS isimlendirme: fosforik asit, tris(2–metilfenil)ester) ayrıca tris–o–krezilfosfat olarak da bilinir.
Test maddesi mümkünse tek doz olarak akut kolinerjik etkilerden korunan evcil dişi kuşlara oral yolla uygulanır. Hayvanlar, davranış anomalileri, ataksi ve felç için 21 gün boyunca gözlenirler. Biyokimyasal ölçümler,özellikle nöropati hedef esteraz inhibasyonu (NTE), her gruptan rastgele seçilen dişi kuşlar dozun uygulanmasından normalde 24 ve 48 saat sonra alınırlar. Maruz kalmadan yirmi bir gün sonra kalan dişi kuşlar öldürülür ve alınan sinir dokular histopatolojik incelemelere tabi tutulur.
Virüsün yol açtığı hastalıklar ve tıbbi tedavisi olmayan, yürüyüşünde anomali bulunmayan sağlıklı, genç, erişkin dişi kuşlar rastgele seçilirler ve kontrol ve test grubu olarak ayrılırlar ve çalışmanın başlamasından beş gün önceden laboratuvar şartlarına alıştırılırlar. Kafesler dişi kuşlar rahat hareket etmesini sağlayacak genişlikte olmalıdır ve yürüyüşleri kolayca gözlenebilmelidir. Test maddesiyle doz uygulanması normalde oral gavaj ile, jelatin kapsüller veya karşılaştırılabilir bir yöntem kullanılarak uygulanır. Sıvılar seyreltilmemiş olarak veya mısır yağı gibi uygun bir taşıyıcıda çözünerek verilebilirler; mümkünse, katıların büyük dozları jelatin kapsül içinde yeterince absorblanamayacağı için, katılar çözülmelidir. Sulu olmayan taşıyıcılar için, taşıyıcının toksik etkisi bilinmelidir, bilinmiyorsa da testten önce belirlenmelidir.
8-12 aylık, genç ergen yumurtlayan evcil dişi kuş (Gallus gallus domesticus) tavsiye edilir. Standart büyüklükteki cins ve türler kullanılmalıdır ve kuşlar normalde rahat hareket sağlayan koşullarda yetiştirilmelidir.
Test grubuna ek olarak, hem taşıyıcı kontrol grubu hem de pozitif kontrol grubu kullanılmalıdır. Taşıyıcı kontrol grubu, test maddesinin uygulanmasının gözardı edildiği durumlar haricinde uygulama grubuyla aynı şekilde muamele edilmelidir. Her bir grup için yeterli sayıda dişi kuş kullanılmalıdır böylece biyokimyasal belirlemeler için en az altı (her bir işaret zamanı için üç adet) hayvan öldürülebilir ve altı hayvan da testsonrasındaki patolojik inceleme amaçlı 21-günlük gözlem süresi içinde sağ kalır. Pozitif kontrol grubu eş zamanlı olarak yürütülebilir veya yakın geçmişe dayalı bir grup olabilir. Pozitif kontrol grubu, bilinen bir gecikmiş nörotoksikanla muamele edilmiş en az altı dişi kuş içermelidir, hayvanlardan üçü biyokimya, üçü de patoloji içindir. Daha önceki verilerin periyodik olarak güncellenmesi tavsiye edilir. Testin yürütüldüğü laboratuvarda bazı önemli unsurların (ör. ırk, beslenme, barınma koşulları) değiştirildiği durumlarda, yeni pozitif kontrol verileri geliştirilmelidir.
Yeterli sayıda dişi kuş ve doz grubu kullanılan bir ön çalışma, asıl çalışmada kullanılacak olan düzeyi belirlemek için uygulanmalıdır. Bu ön çalışmada ölüm meydana gelmesi asıl çalışma dozunun doğru olarak belirlenmesi için gereklidir. Ancak, akut kolinerjik etkiye bağlı ölümleri önlemek için atropin veya gecikmiş nörotoksik cevapla etkileşmediği bilinen başka bir koruyucu madde kullanılabilir. Test maddesinin maksimum öldürücü olmayan dozunu tahmin etmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir (bakınız yöntem B.1bis). Dişi kuşla ilgili geçmişe dayalı veriler veya diğer toksikolojik bilgiler de doz seçimi için faydalı olabilir. Test maddesinin asıl çalışmadaki doz, doz seçimi için yapılan ön çalışmadaki sonuçlar dikkate alınarak olabildiğince yüksek olmalıdır, bunun için üst sınır 2,000 mg/kg vücut ağırlığıdır. Meydana gelebilecek bir ölüm, 21 günde biyokimya (altı) ve histopatoloji(altı) için yeter sayıdaki hayvanların hayatta kalmalarını etkilememelidir. Akut kolinerjik(uçlarında asetilkolin açığa çıkan) etkiye bağlı ölümleri önlemek için atropin veya gecikmiş nörotoksik cevapla etkileşmediği bilinen başka bir koruyucu madde kullanılmalıdır.
Bu çalışma için tanımlanan işlemler kullanılarak uygulanan 2000 mg/kg vücut ağırlığı/gün doz seviyeli bir sınır testi gözlenebilen herhangi bir toksik etki meydana getirmiyorsa ve yapısal olarak benzer maddelerle ilgili toksisite beklenmiyorsa bu durumda daha yüksek doz kullanılarak yapılacak kapsamlı bir çalışmaya gerek olmayabilir. Beklenen insan maruz kalması daha yüksek doz kullanılması gerektiğine işaret etmedikçe, sınır testi uygulanır.
Gözlem süresi 21 gün olmalıdır.
Akut kolinerjik etkiye bağlı ölümü önlemek amacıyla koruyucu madde uygulandıktan sonra, test maddesi tek doz olarak uygulanır.
Gözlemlere maruz kalma işleminden hemen sonra başlanmalıdır. Tüm dişi kuşlar ilk 2 gün boyunca birkaç defa ve sonrasında günde en az bir defa 21 gün boyuca veya planlanan öldürme zamanına kadar dikkatlice gözlenmelidirler. Davranışsal bozuklukların başlama zamanı, türü, şiddeti ve süresi gibi tüm toksisite belirtileri kaydedilmelidir. Sıralı dereceli bir ölçekte en az dört dozda ataksi ölçülmelidir ve felç not edilmelidir. Haftada en az iki defa dişi kuşlar kafesin dışına alınmalı ve toksik etkilerin gözlenebilmesini kolaylaştırmak için bir süre merdiven tırmanmak gibi zorlanmış hareket ettirici hareketlere tabi tutulmalıdır. Ölmek üzere (Moribund) olan hayvanlarla şiddetli acı ve ağrı çeken hayvanlar bu durumun farkına varıldığında uzaklaştırılıp, insanca öldürülmeli ve hayvanlara otopsi (nekropsi) yapılmalıdır.
Bütün dişi kuşlar test maddesi uygulanmadan hemen önce ve uygulama sonrasında da haftada en az bir kere tartılmalıdır.
Her bir muamele ve taşıyıcı kontrol grubundan rastgele seçilen altı dişi kuş ve pozitif kontrol grubundan üç dişi kuş doz uygulandıktan sonra birkaç gün içinde öldürülmelidir ve hazırlanan, beyin ve bel omuriliği, nöropati hedef esteraz (NTE) inhibasyon için test edilir. Ek olarak, siyatik sinir dokunun da, nöropati hedef esteraz (NTE) inhibasyon aktivitesi için hazırlanması ve analiz edilmesi faydalı olabilir. Normalde kontrol grubundan ve her bir muamele grubundan üç hayvan 24 saat sonra ve son üç tane de dozun uygulanmasından 48 saat sonra öldürülür. Zehirlenmenin klinik belirtilerinin gözlenmesi (bu durum sıklıkla kolinerjik belirtilerin başlangıç zamanının gözlenmesi vasıtasıyla değerlendirilir) bu toksik ajanın vücuttan çok yavaş atılabildiğine işaret ederse, bu durumda üç kuştan her kuş için iki defa olmak üzere 24 saat ile en geç 72 saat arasında örnek alınması tercih edilebilir. Uygun olduğu düşünülüyorsa, bu örnekler üzerinde ayrıca asetilkolinesteraz (AChE) analizi de yürütülebilir. AChE’nin in vivo kendiliğinden etkinleşmesi gerçekleşebilir ve böylece maddenin AChE inhibitörü olma potansiyeli göz ardı edilir.
Tüm hayvanların otopsisi beyin ve omuriliğin görünümlerinin gözlenmesini de içine alır.
Biyolojik inceleme için kullanılmayacak olan ve gözlem süresinde sağ kalan hayvanlardan alınan sinir doku mikroskop altında incelenmelidir. Dokular perfüzyon (üzerine sıvama) teknikleri kullanılarak doğal durumlarında (in situ) sabitlenmelidir. Kesitler beyincik, medulla oblongata, omurilik ve periferal sinirleri kapsar. Omurilik, üst boyun kesiminden, orta göğüs ve kuyruk sokumu bölgelerinden alınmalıdır. Kaval kemiği sinirlerinin distal bölgesinin kesiti ve baldır ikiz kaslarına uzanan dalları ve kalça sinirlerinin kesiti alınmalıdır. Kesitler miyelin ve aksona- özgü uygun boyalarla boyanmalıdır.
|