FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

VERİ

1. 
   Veri
   

Her muamele için, ayrı tekrar test numunelerinden elde edilen veri (örneğin her test maddesi için sınıflandırmayı da içeren OD değerleri ve hesaplanmış hücre canlılık verisi oranı), uygun hallerde tekrar edilen deneylerin verilerini içeren çizelge halinde rapor edilmelidir. Her deneme için ortalama ± standart sapma ek olarak rapor edilmelidir. MTT belirteci ile gözlenen etkileşimler ve renklendirilmiş test maddeleri, her test maddesi için rapor edilmelidir.

2. 
   Sonuçların Yorumlanması
   

Her test numunesi ile elde edilen OD değerleri, % 100’e ayarlanmış olan NC’ye göre canlılık oranını hesaplamak için kullanılabilir. Tahriş edici maddeleri sınıflandırılmamış test maddelerinden ayırt etmeye yarayan hücre canlılık oranının sınır değeri ve sonuçları değerlendirmek ve tahriş edici maddeleri tespit etmek için kullanılan istatistiki usuller açık bir şekilde tanımlanmalı, belgelendirilmeli ve uygun olduğu kanıtlanmalıdır. Geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem ile ilgili tahriş tahmini için sınır değerler aşağıda verilmektedir:

Test maddesi,

1. 
   Eğer maruz kalma ve tedavi sonrası inkübasyondan sonra doku canlılığı, % 50’den daha az ya da eşit ise (≤)
   

BM GHS Kategori 2 gereğince, cilt için tahriş edici olarak nitelendirilir.

2. 
   Eğer maruz kalma ve tedavi sonrası inkübasyondan sonra doku canlılığı, % 50’den daha fazla ise (>)
   

kategorisiz olarak nitelendirilir.

3. 
   RAPORLAMA
   

1. 
   Test Raporu
   

Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir:

Test ve kontrol maddeleri:

• 
  IUPAC ya da CAS adı gibi kimyasal isim(ler) ve eğer biliniyor ise CAS numarası
  
• 
  maddenin saflığı ve kompozisyonu (ağırlıkça yüzde olarak),
  
• 
  çalışmanın yürütülmesi ile ilgili fiziksel – kimyasal özellikler (örn. fiziksel durum, kararlılık ve uçuculuk, pH, eğer biliniyor ise sudaki çözünürlük),
  
• 
  eğer uygulanabilir ise test etmeden önce test/kontrol maddelerinin davranışı (örn. ısıtma, aşındırma),
  
• 
  depolama koşulları.
  

Kullanılan cilt modelinin ve usulün gerekçelendirilmesi.

Test koşulları:

• 
  kullanılan hücre sistemi,
  
• 
  ölçüm gereçleri için kalibrasyon bilgisi ve hücre canlılığının ölçümü için kullanılan bant geçişi (spektrofotometre),
  
• 
  kullanılan belirli cilt modeli için performansı da içeren eksiksiz destekleyici bilgi.
  
• 
  Bunlar aşağıdakileri içermeli ancak bunlarla sınırlı kalmamalıdır:
  

(i)canlılık;

(ii) bariyer fonksiyon;

(iii) morfoloji;

(iv) tekrarlanabilirlik ve belirleyicilik;

(v) modelin kalite kontrolleri (QC);

• 
  kullanılan test usullerinin detayları
  
• 
  kullanılan test yöntemleri, maruz kalma süresi ve muamele sonrası inkübasyon süreci,
  
• 
  test usulunün herhangi bir değişikliğine ilişkin tanımlama,
  
• 
  modelin geçmiş verilerine ilişkin referans.
  

Bunlar aşağıdakileri içermeli ancak bunlarla sınırlı kalmamalıdır:

(i)geçmiş seri verilerine ilişkin kalite kontrolünün kabul edilebilirliği,

(ii)negatif ve pozitif kontrol ortalamaları ve aralıklarına ilişkin pozitif ve negatif kontrol değerlerinin kabul edilebilirliği,

• 
  tahmin modeli için sınır noktaların seçiminde gerekçeleri de içeren kullanılmış değerlendirme kriterinin tanımlanması.
  

Sonuçlar:

• 
  ayrı test numunelerinden elde edilen verinin tabloya aktarılması,
  
• 
  elde edilen diğer etkilerin tanımlanması.
  

Sonuçların tartışılması.

Sonuç.

4. 
   KAYNAKLAR
   

1. 
   United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Available at:
   

http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html.

2. 
   REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Available at:
   

http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en. htm?time=1232447649.

3. 
   Test Yöntemi B.4. Akut Toksisite: Deri Tahrişi /Aşınma.
   
4. 
   Test yöntemi B.40. Ciltte Aşınma
   
5. 
   Test Method B.40 BIS. IN VITRO SKIN CORROSION: HUMAN SKIN MODEL TEST.
   
6. 
   OECD (2006). Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Adopted July 19, 2006. Available at: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html.
   
7. 
   ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Available under Download Study Documents, at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.
   
8. 
   Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes,
   
9. 
   P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, 57-93.
   
10. 
    Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, 765-770.
    
11. 
    Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Opti­ misation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107-114.
    
12. 
    Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005) The Epi­ Derm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, 351-367.
    
13. 
    Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005). The In Vitro Acute Skin Irri­ tation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, 329-249.
    
14. 
    Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Hey­ lings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irrita­ tion Task Force Report 2. ATLA 30,109-129.
    
15. 
    Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integ­ rity Function Test. ATLA 35, 559-601.
    
16. 
    Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 pp. + annexes. Available under Download Study Documents, at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.
    
17. 
    Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35,603-619.
    
18. 
    J. Cotovio, M.-H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and perfor­ mances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol.14, 351-358.
    
19. 
    ESAC statement on updated EpiDerm and similar SkinEthic assays. 5 November 2008.
    
20. 
    EC (2006). Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. Official Journal of the European Union L 396 of 30 December 2006, p. 1. OPOCE, Luxembourg.
    
21. 
    Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63.
    
22. 
    EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (January 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test — 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Available under Download Study Documents, at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.
    
23. 
    EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (October 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Available under Download Study Documents, at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.
    
24. 
    SkinEthic RHE™ SOP. Will be available under Download Study Documents, at:
    
25. 
    http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.
    
26. 
    Harvell, J.D., Lammintausta, K., Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, pp 7-18
    
27. 
    Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, November 13, 2008.
    

Ek-I
Cilt tahrişi için in vitro yeniden yapılandırılmış insan epidermi modelleri öneren performans özelliklerinin değerlendirilmesi

Giriş
Bu test yönteminde kullanım için önerilen prosedürler, güvenilirlik ve doğruluğu temin için, Draize tahriş skorlarının tam aralığını temsil eden maddeler kullanılarak değerlendirilmelidir. Tavsiye edilmiş 20 referans madde kullanılarak değerlendirme yapıldığında (Tablo 2), önerilen prosedür, geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 1 ile karşılaştırılabilir olmalıdır (Tablo 3) (1). Erişilmesi gereken doğruluk ve güvenilirlik standartları, aşağıda II ve III altında yer almaktadır. Önerilen test yönteminin güvenilirliğinin ve performansının (hassasiyet, özgünlük, yanlış negatif oranlar ve yanlış pozitif oranlar ve doğruluk) geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 1 ile karşılaştırılabilmesi için, ilgili kimyasal sınıfları temsil eden sınıflandırılmamış ve sınıflandırılmış (BM GHS kategori 2) maddelerdahil edilmiştir. Test yönteminin güvenilirliği ve BM GHS kategori 2 tahriş edici maddeleri doğru bir şekilde tanımlayan yeterliliği yeni maddelerin test edilmesi için kullanılmadan önce değerlendirilmelidir.

Performans Standartları
Performans standartları şu üç öğeden oluşur; I) Gerekli Test Yöntemi Bileşenleri, II) Referans Maddeler ve III) Tanımlanmış Doğruluk ve Güvenilirlik Değerleri (2). Bu Performans Standartları, ECVAM cilt tahrişi geçerliliği çalışması tamamlandıktan sonra tanımlanan Performans Standartlarına dayanır (3).
(I)Gerekli Test Yöntemi Bileşenleri
Genel model koşulları
Normal insan keratinosidleri, epitelyumun yapılandırması için kullanılmalıdır. Canlı epitel hücrelerin çoklu katmanları (bazal katman, stratum spinosum, stratum granulosum), fonksiyonel korun (stratum corneum) altında gösterilmelidir. Korun (stratum corneum), sitosidal işaretleyici maddelerin (örn. sodyum dodesil sülfat (SDS) ya da Triton X-100) hızlı nüfuz etmesine direnç gösterecek sağlam bir fonksiyonel bariyer üretmek için gerekli yağ kesitini içerecek şekilde çok katmanlı hale getirilmelidir. Bariyer fonksiyonu, ya belirli bir maruz kalma süresindeki işaretleyici bir maddenin doku canlılığını %50 oranda düşürdüğü derişimin (IC50) tayiniyle ya da belirli ve sabit bir derişimde işaretleyici bir maddenin uygulanması ile hücre canlılığını %50 oranda düşürmek için gerekli maruz kalma süresinin (ET50) tayiniyle değerlendirilebilir.
Modelin sınırlama özellikleri, cilt maruz kalmasının kötü modellenmesine neden olan korun (stratum corneum) etrafındaki malzemenin canlı dokuya geçişine engel olmalıdır. Cilt modeli, bakteriler, virüsler, mikoplazma ya da mantar ile kirlenmemiş olmalıdır.
Fonksiyonel model koşulları
Canlılık

Canlılık boyutunun belirlenmesi için tercih edilen analiz MTT dir (4). Negatif kontrol (NC) ile muamele edilmiş olan dokudan özütlenmiş (çözünmüş) boyanın optik yoğunluğu, özütleme çözeltisinin kendi optik yoğunluğundan en az 20 kat daha büyüklük olmalıdır. NC ile muamele edilmiş olan dokunun, test maruz kalma süresince kültürde (benzer canlılık ölçümlerinde) kararlı olduğu belgelendirilmelidir.

Bariyer fonksiyon
Korun (stratum corneum) ve onun yağ bileşimi, sitotoksik işaretleyici maddelerin hızlı nüfuz etmesine direnç göstermeye elverişli olmalıdır(örn. IC50 veya ET50 ile tahmin edilen SDS ya da Triton X-100 gibi ).
Morfoloji
Yeniden yapılandırılmış cildin/epidermisin histolojik analizi, uygun nitelikli personel ile gerçekleştirilmelidir. Bu personel yapıyı, insan cildi/epidermisi-benzeri (çok katmanlı hale getirilmiş stratum corneum içeren) yapı olarak ifade ayırt edebilenedebilmelidir., uygun nitelikli personel ile gerçekleştirilmelidir.
Tekrarlanabilirlik
Belirli bir model kullanan yöntemin sonuçları, tercihen uygun dizi kontrol (değerlendirme) maddesi ile, zaman içerisinde tekrarlanabilirliği göstermelidir.(bkz. Tanımlar, başlık 1.2).
Modelin Kalite Kontrolleri (QC)
Kullanılan her epidermal modelin dizisi, en önemlileri canlılık ve bariyer fonksiyonu olan belirli üretim salım kriterini karşılamalıdır. IC₅₀ ya da ET₅₀ için kabul edilebilir aralık (üst sınır ve alt sınır), cilt model tedarikçisiyle (ya da kurum içi model kullanırken bir tahkik görevlisi ile ) geliştirilmelidir. Dokuların bariyer özellikleri, dokuların alınmasından sonra laboratuvar tarafından doğrulanmalıdır. Sadece nitelikli dokular ile üretilmiş olan sonuçlar tahriş etkilerinin güvenilir tahmini için kabul edilebilir. Örnek olarak geçerliliği kabul edilmiş yöntemler için kabul edilebilir aralık aşağıda verilmektedir.
Tablo 1

Kalite Kontrol Dizi Salım Kriteri Örnekleri

	Alt kabul sınırı	Kabul aralığı ortalaması	Üst kabul sınırı
Geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 1 (SDS ile 18 saat tedavi)	IC50 = 1,0 mg/ml	IC50 = 2,32 mg/ml	IC50 = 3,0 mg/ml
Geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 2 (% 1 Triton X-100)	ET50 = 4,8 saat	ET50 = 6,7 saat	ET50 = 8,7 saat

(II) Referans Maddeler

Heptil butirat	5870-93-9	227-526-5	L	1,7	Kategori Yok	İsteğe bağlı Kategori 3
Hekzil salisilat	6259-76-3	228-408-6	L	2	Kategori Yok	İsteğe bağlı Kategori 3
Tri-izobutil fosfat	126-71-6	204-798-3	L	2	Kategori 2	İsteğe bağlı Kategori 3
1-dekanol	112-30-1	203-956-9	L	2,3	Kategori 2	Kategori 2
Siklamen aldehid	103-95-7	203-161-7	L	2,3	Kategori 2	Kategori 2
1-bromohekzan	111-25-1	203-850-2	L	2,7	Kategori 2	Kategori 2
2-klorometil-3,5-dimetil -4-metoksipiridin hidroklorid	86604-75-3	434-680-9	S	2,7	Kategori 2	Kategori 2
a-terpineol	98-55-5	202-680-6	L	2,7	Kategori 2	Kategori 2
di-n-propildisülfid	629-19-6	211-079-8	L	3	Kategori Yok	Kategori 2
Bütil metakrilat	97-88-1	202-615-1	L	3	Kategori 2	Kategori 2
Benzenetiyol, 5-(1,1-dimetiletil)-2-metil	7340-90-1	438-520-9	L	3,3	Kategori 2	Kategori 2
1-metil – 3-fenil – 1-piperazin	5271-27-2	431-180-2	S	3,3	Kategori 2	Kategori 2
Heptanal	111-71-7	203-898-4	L	4	Kategori 2	Kategori 2

Referans maddeler, in vitro yeniden yapılandırılmış, yapısal ve işlevsel olarak geçerli referans yöntemlerle yeterince benzerlik gösteren veya geçerli referans yöntemin küçük bir modifikasyonunu temsil eden, yeni insan epidermi taslak test yönteminin güvenilirliğinin ve doğruluğunun geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 1 ile kıyaslanabilir olduğunu göstermek için kullanılır. Tablo 2’de listelenen 20 referans madde, BM GHS Kategori 2’de yer alan ve farklı kimyasal sınıflarda olan maddelerden oluşmaktadır. Bu listede, 10 adet BM GHS Kategori 2’de yer alan madde, 3 adet BM GHS isteğe bağlı Kategori 3’de yer alan madde ve 7 adet kategorisi olmayan madde yer almaktadır. Bu test yönteminde isteğe bağlı kategori 3, kategorisi olmayan olarak kabul edilir. Bu referans maddeler, cilt tahrişi için önerilen yeniden yapılandırılmış insan epidermi test yönteminin doğruluğunu ve güvenilirliğini değerlendirmek için kullanılması gereken maddelerin yeter sayısını temsil eder. Listelenmiş maddelerin mevcut olmadığı durumlarda, uygun in vivo referans verisi olan diğer maddeler kullanılabilir. Eğer istenir ise, diğer kimyasal sınıfları temsil eden ve uygun in vivo referans verisi olan ek maddeler, bundan başka önerilen test yönteminin doğruluğunu daha fazla değerlendirmek için referans maddelerin minimum listesineeklenebilir.

Tablo 2

Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermi Cilt Tahrişi Modellerinde Doğruluk ve Güvenilirlik Değerlerinin Tayini için Referans Maddeler

Madde (*)	CAS No	EINECS No	Fiziksel Hal	İn vivo puanı	GHS in vitro kategori	GHS in vivo kategori
1-bromo-4-klorobütan	6940-78-9	230-089-3	L	0	Kategori 2	Kategori Yok
Dietil ftalat	84-66-2	201-550-6	L	0	Kategori Yok	Kategori Yok
Naftalin asetik asit	86-87-3	201-705-8	S	0	Kategori Yok	Kategori Yok
Alil fenoksi asetat	7493-74-5	231-335-2	L	0,3	Kategori Yok	Kategori Yok
Isopropanol	67-63-0	200-661-7	L	0,3	Kategori Yok	Kategori Yok
4-metil-tiyo-benzaldehit	3446-89-7	222-365-7	L	1	Kategori 2	Kategori Yok
Metil stearat	112-61-8	203-990-4	S	1	Kategori Yok	Kategori Yok

(*) 20 referans madde, aslında geçeliliği kabul edilmiş referans yöntem 1’e uygulanan 58 maddenin temsili seçimini ihtiva eder (EpiSkin™). Test maddelerinin tam listesi ve seçim kriteri mevcuttur (5).

Tablo 2’ de listelenen maddeler, ECVAM uluslararası cilt tahriş geçerlilik çalışmasında kullanılan 58 maddenin temsili dağılımını gösterir (1).
Bunların seçimi aşağıdaki kriterlere dayanır:

— maddelerin ticari olarak ulaşılabilir olması,

— Draize tahriş edici puanı tam aralığının temsilcisi olmaları (tahriş edici olmayandan olana kadar),

— iyi tanımlanmış kimyasal yapılarının olması,

— ECVAM geçerlilik çalışmasında belirlendiği üzere geçerliliği kabul edilmiş yöntemin tekrarlanabilirliğinin ve tahmini kapasitesinin temsilcisi olmaları,

— geçerlilik sürecinde kullanılan kimyasal fonksiyonelliğinin temsilcisi olmaları,

— aşırı toksik profil(örn. üreme sistemine toksik ve kanserojen) ile ilişkili olmamaları ve yüksek maliyetli olmamaları.
(III) Tanımlanmış Doğruluk ve Güvenilirlik Değerleri
Önerilen test yönteminin performansı (hassasiyet, özgünlük, yanlış negatif oran, yanlış pozitif oran ve doğruluk), geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 1’e (Tablo 3) karşılaştırılabilir olmalıdır, örneğin hassasiyet %80’e eşit ya da daha büyük olmalıdır, özgünlük %70’e eşit ya da daha büyük olmalıdır ve doğruluk %75’e eşit ya da daha büyük olmalıdır. Performans hesaplaması, farklı katılımcı laboratuvarlarda 20 madde için elde edilmiş olan bütün sınıflandırmaları kullanarak yapılmalıdır. Her laboratuvarda her madde için sınıflandırma, gerçekleştirilen farklı tekrarlar (minimum 3 geçerli tekrar) boyunca canlılığın ortalama değeri kullanılarak elde edilmelidir.
Tablo 3