FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

Yüklə 5,29 Mb.

səhifə	40/81
tarix	26.08.2018
ölçüsü	5,29 Mb.
	#74879

1 ... 36 37 38 39 40 41 42 43 ... 81

VERİ

Aşağıdaki ölçümler, her bir hayvan için tüm örneklemelerde test kimyasalı ve/veya metabolitler için yapılmalıdır. Her bir veriye ek olarak, numuneleme zamanlarına göre gruplanmış veri, rapor edilmelidir.

koruyucu araçlardan elde edilen miktar,
ciltten çıkartılabilen miktar,
cilt içinden/üstünden temizlenemeyen miktar,
kan numunesi içindeki miktar,
dışkı ve solunmuş hava içindeki miktar (eğer uygun ise),
ayrı analizler için alınmış karkas ve herhangi bir organ içindeki kalan miktarı.

Dışkı, solunmuş hava, kan ve karkas içindeki test maddesi ve/veya metabolit miktarı, belirlenmiş zamanlarda absorbe edilen toplam miktarın belirlenmesini sağlayacaktır. Maruz kalma süresi boyunca test maddesine maruz kalan cildin her cm² alanında absorbe edilen test kimyasalı miktarının hesaplaması yapılabilir.

RAPORLAMA

Test Raporu

Test raporu, kullanılan test sisteminin doğrulanmasını da içeren test protokolünde belirtilen koşullar ile birlikte aşağıdakileri kapsamalıdır:

Test maddesinin:

kimliği (örn. CAS numarası, varsa kaynak, saflık (radyoaktif kimyasalın saflığı), bilinen safsızlık, parti numarası),
fiziksel yapısı, fizikokimyasal özellikleri (örn. pH, uçuculuk, çözünürlük, kararlılık, moleküler ağırlık ve log Pow).

Test karışımı:

formülasyon ve kullanımın gerekçelendirmesi,
test karışımının detayları, uygulanan miktar,erişilen konsantrasyon, taşıyıcı,kararlılıkve homojenlik.

Test hayvanı:

kullanılan tür/cins,
hayvanların sayısı, yaşı ve cinsiyeti,
hayvanların kaynağı,barınma koşulları,beslenmeleri,vb.,
test başlangıcında her bir hayvanın ağırlığı.

Test koşulları:

test karışımının uygulama detayları (uygulama alanı, analiz yöntemleri, oklüzyon/oklüzyon olmayan, hacim, özütleme, tespit),
yiyecek ve su kalitesinin detayları.

Sonuçlar:

herhangi bir toksisite belirtisi,
absorpsiyon verilerinin tablosu (oran, miktarya da yüzde olarak ),
deneyin tüm geri kazanımı,
sonuçların yorumlanması, test bileşiğinin mevcut cilt absorpsiyon verileri ile karşılaştırılması.

Sonuçların tartışılması.

Sonuç.

KAYNAKLAR

Test Yöntemi B.45.Cilt Absorpsiyonu:In vitro Yöntem.
OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris
ECETOC, (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for Ecotoxicologyand Toxicologyof Chemicals, MonographNo 20.
Zendzian R.P. (1989) Skin Penetration Method suggested for Environmental Protection Agency Requirements. J. Am. Coll. Toxicol. 8(5),p. 829-835.
Kemppainen, B.W., Reifenrath WG(1990) Methods for skin absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.
EPA, (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
EPA, (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.
Bronaugh, R.L., Wester, R.C., Bucks,D., MaibachH.I. and Sarason,R., (1990) In vivo percutaneous absorption of fragrance ingredients in reshus monkeys and humans. Fd. Chem. Toxic. 28,p. 369-373.
Feldman, R.J. and Maibach, H.I., (1970) Absorption of some organic compounds through the skin in man. J. Invest Dermatol. 54,p. 399-404.

1: Cilt/deri

2: Japon yapıştırıcısı

3: Vida dişli taban

4: Vida dişli başlık/kapak

5: Aktif kömür filtresi veya tel filtre

Şekil 1
İn vivo ciltten emilim çalışmaları esnasında dermal uygulama alanının tanımlanması ve korunması için kullanılan genel aygıtın tasarım örneği

B.45. DERİ ABSORPSİYONU:İN VİTRO YÖNTEMİ

YÖNTEM

Bu test yöntemi OECD TG428(2004) ile eşdeğerdir.

Giriş

Bu yöntem, kesilen deriye uygulanacak test maddesi absorpsiyonu hakkında bilgi elde etmek için tasarlanmıştır. Bu yöntem, cilt absorpsiyonu için: in vivo yöntem (1) ile birlikte veya ayrı olarak yürütülebilir. Bu yönteme bağlı olarak çalışmaların düzenlenmesinde yardımcı olması amacıyla Cilt Absorpsiyonu Çalışmalarının Yürütülmesi için OECD Kılavuz Dokümanlarına(2) danışılması tavsiye edilmektedir. Bu yöntemle elde edilecek olan sonuçların güvenilirliğini sağlayacak uygun in vitro prosedürlerin seçimi için belirli koşullarda kullanmak üzere bu Kılavuz Doküman hazırlanmıştır.

Cilt absorpsiyonunu ve ciltten dağılımı ölçme yöntemleri iki kategoriye ayrılabilir: in vivo ve in vitro. Cilt absorpsiyonu üzerine in vivo yöntemler iyice anlaşılmış ve hayvan türlerinden farmakokinetik bilgi sağlanmıştır. İn vivo yöntem bir diğer test yönteminde (1) ayrı olarak açıklanmıştır. İn vitro yöntemler, yıllardır cilt absorpsiyonu ölçümü için kullanılmaktadır. Bu test yöntemiyle keşfedilen in vitro yöntemlerin resmi onaylama çalışmaları henüz yapılmamasına rağmen, 1999’da OECD uzmanları in vitro yöntemini (3) destekleyici değerlendirmelerde etkili veri sağlandığı konusunda anlaşmışlardır. Bu desteği ispatlamak amacıyla, kayda değer sayıda in vitro ve in vivo yöntemlerin doğrudan karşılaştırılmalarını içeren daha fazla detay, Kılavuz Doküman (2) ile sağlanmaktadır. Bu konuyu inceleyen ve in vitro yöntem kullanımı üzerine detaylı bir bilgi sağlayan çok sayıda belge bulunmaktadır (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12). In vitro yöntemler, kimyasalların cilt içinden ve üzerinden sıvı rezervlerine dağılmasını ölçer ve canlı olmayan cildi kullanabilir; sadece dağılma ölçümü ya da dağılma ölçümü ile eşzamanlı cilt metabolizması ölçümü için taze, metabolik olarak aktif cilt kullanabilir. Bu yöntemler, farklı formülasyonlardan kimyasalların cilt içinden ve yoluyla gönderilmesini karşılaştırmak için tarama olarak özel kullanım bulmuştur ve insanlarda ciltten emilimin değerlendirilmesi için kullanışlı modeller de sağlayabilir.
İn vitro yöntem, bütün durumlar ve kimyasal sınıflar için kullanılamayabilir. Cilt içine işleme durumunun ilk sayısal değerlendirmesi için in vitro test yöntemini kullanmak mümkündür. Bazı vakalarda bunu in vivo veriler ile takip etmek gerekli olabilir. İn vitro yöntemin uygun olabileceği durumlarla ilgili daha fazla ayrıntı için Kılavuz Dökümana (2) başvurulmalıdır. Kararın desteklenmesi amacıyla ilave detaylı bilgi (3) de sağlanmaktadır. Bu yöntem cilt absorpsiyonu ölçümü için prensipleri ve kesilen cilt kullanarak test maddesinin nasıl uygulanacağını gösterir. İnsan cildini de içeren birçok memeli türünden alınmış cilt kullanılabilir. Cildin geçirgenlik özellikleri, cilt vücuttan kesildikten sonra elde edilir çünkü esas dağılma bariyeri canlı olmayan korundur (stratum corneum); cilt yoluyla aktif kimyasal madde taşınımı henüz tespit edilmemiştir. Cildin, absorpsiyon esnasında (6) bazı kimyasalları metabolize etme özelliği olduğu bilinmektedir. Fakat bu süreç asıl absorbe edilen doz açısından hız sınırlayıcı değildir ancak yine de kan dolaşımına giren maddenin yapısını etkileyebilir.

Tanımlar

Absorbe edilmemiş doz: maruz kalmadan sonra cilt yüzeyinden temizlenen ve maruz kalma esnasında ciltten buharlaşarak oklüzif olmayan örtü üzerinde biriken dozun tümü

Absorbe edilmiş doz (in vitro): belirli bir süre içerisinde alıcı sıvıya veya dolaşım sistemine ulaşmış test maddesi kütlesi
Absorbe edilebilen doz (in vitro):yıkandıktan sonra cilt üzerinde ya da içerisinde kalanıtemsil eder.

Test Yöntemi Kuralları

İstenildiği takdirde radyoaktif olarak işaretlenebilen test maddesi, difüzyon hücresinin iki kısmını ayıran cilt numunesinin yüzeyine uygulanır. Kimyasal, uygun temizleme prosedürleriyle kaldırılmadan önce belirli koşullar altında belirli bir süre cilt yüzeyinde kalır. Alıcı sıvı, deney boyunca değişik zaman noktalarında numunelenir ve test kimyasalı için analiz edilir ve/veya metabolize edilir.

Aktif metabolik sistemler kullanıldığında, test kimyasalının metabolizasyonu uygun yöntemler kullanarak analiz edilebilir. Uygun olduğunda, deneyin bitiminde test kimyasalının ve metabolitlerinin dağılımı nicelik açısından ölçülebilir.
Bu yöntem içinde ve Kılavuz Doküman (2) içinde açıklanan uygun koşullar kullanılarak, verilen zaman süresinde test maddesinin absorpsiyonu, alıcı sıvının ve doz uygulanan cildin analizi ile ölçülebilir. Absorpsiyonun, sadece alıcı sıvının ölçümünden belirlenebileceği kanıtlanamaz ise cilt içinde kalan test maddesi, absorbe edilmiş kabul edilir. Diğer bileşenlerin analizi (cilt yüzeyinden yıkanan ve cilt tabakaları arasında kalan materyaller), toplam test maddesi yapısı ve kısmi iyileşmeyi de içeren ileri veri değerlendirmelerinin yapılabilmesini sağlar.
Testin yapıldığı laboratuvardaki test sisteminin performansını ve güvenilirliğini kanıtlamak için ilgili referans kimyasalların sonuçları mevcut olmalı ve kullanılan yöntem için yayımlanmış kaynaklar ile uygun olmalıdır. Bu gerekliliği yerine getirmek için test maddesi ile aynı zamanda uygun bir referans maddesi (test maddesine yakın lipofilisiteli olması tercih edilir) test edilebilir veya farklı lipofilisiteli birkaç referans maddesi (örn. kafein, benzoik asit ve testosteron) hakkında yeterli bilgi sağlanabilir.

Yöntemin Tanımı

Difüzyon hücresi

Difüzyon hücresi, cildin aralarında konumlandığı bir alıcı bölme ve bir verici bölmeden oluşur (Şekil 1 de genel olarak tasarım örneği gösterilmektedir). Hücre, cildin etrafında iyi bir yalıtım oluşturmalı ve kolay numune alınmasına, alıcı çözeltinin cildin alt kısmı ile temas halinde olup iyice karışabilmesine, hücrenin ve içindekilerin sıcaklık kontrolünün iyi yapılmasına olanak sağlamalıdır. Statik ve sürekli akışlı difüzyon hücrelerinin her ikisi de kabul edilebilir. Normal olarak verici bölmeleri, maruz kalma esnasında test karışımının sınırlı dozu için tam kapatılmadan bırakılır. Bununla birlikte sınırsız dozlar ve bazı sınırlı doz uygulama senaryoları için alıcı bölmeleri kapatılabilir.

Alıcı sıvı

Fizyolojik açıdan yardımcı bir alıcı sıvının kullanılması tercih edilir ancak gerekçe gösterilerek diğer sıvılar da kullanılabilir. Alıcı sıvının bileşimi eksiksiz sağlanmalıdır. Absorpsiyona engel teşkil etmemesi için test kimyasalının alıcı sıvıda yeteri kadar çözündüğü gösterilmelidir. Buna ilaveten, alıcı sıvı, deri hazırlama bütünlüğünü etkilememelidir. Sürekli akışlı bir sistemde, akış hızı test maddesinin alıcı sıvıya difüzyonuna engel olmamalıdır. Statik hücre sisteminde, alıcı sıvı devamlı karıştırılmalı ve düzenli olarak numune alınmalıdır. Metabolizma üzerine çalışılıyor ise, alıcı sıvı deney boyunca derinin canlılığını desteklemelidir.

Cilt karışımları

İnsan ya da hayvan kaynaklı cilt kullanılabilir. İnsan cildi kullanımının ulusal ve uluslararası etik anlayış ve şartlara tabi olduğu kabul edilir. Canlı cilt tercih edilmesine rağmen cilt bütünlüğü ispatlandığı takdirde canlı olmayan cilt de kullanılabilir. Dermatom ile hazırlanan epidermal zarlar (enzimle, ısıyla veya kimyasal yolla ayrılmış) veya ayrık kalınlıktaki cilt (tipik olarak 200-400 μm kalınlıkta olan) kabul edilebilir. Tam kalınlıktaki cilt, cilt yüzeyindeki test kimyasalının tespit edilmesi için özel olarak gerekmiyorsa kullanılabilir fakat aşırı kalınlıktan (yaklaşık olarak > 1 mm) kaçınılmalıdır. Türlerin seçimi, anatomik alan ve hazırlayıcı teknik gerekçelendirilmelidir. Her test karışımı için en az dört tekrar testinden gelen kabul edilebilir veri gereklidir.

Cilt karışımının bütünlüğü

Cildin düzgün bir şekilde hazırlanması temel gereksinimdir. Uygun olmayan kullanım koruna (stratum corneum) zarar verebilir bu nedenle hazırlanan derinin bütünlüğü kontrol edilmelidir. Cilt metabolizması üzerine inceleme yapıldığında, taze kesilen cilt mümkün olduğunca erken ve metabolik aktiviyeti desteklediği bilinen şartlar altında kullanılmalıdır. Genel kılavuz olarak, taze kesilen cilt 24 saat içerisinde kullanılmalıdır fakat kabul edilebilir saklama süresi metabolizasyon ve saklama sıcaklıklarını (13) kapsayan enzim sistemine bağlı olarak değişebilir. Cilt karışımı kullanımdan önce saklandığında, bariyer fonksiyonun korunduğunu gösteren kanıtlar sunulmalıdır.

Test maddesi

Test maddesi, nüfuz etme özellikleri çalışılacak olan birimdir. Test maddesi tercihen radyoaktif olarak işaretlenmelidir.

Test karışımı

Test maddesinin karışımı (örn. cilde uygulanan test kimyasalını içeren saf, seyreltilmiş ya da formüle edilmiş materyal), insan ve diğer potansiyel hedef türlerin maruz kalma olasılığı olan madde ile aynı (veya gerçekçi bir benzeri) olmalıdır. Test karışımında, herhangi bir farklılık olması durumunda bu gerekçelendirilmelidir.

Test maddesi konsantrasyonları ve formülasyonları

Normal olarak, test maddesinin, potansiyel insan maruz kalma sınırlarının üst kısımlarını da içine alan birden fazla konsantrasyonu hazırlanır. Aynı şekilde, tipik formülasyon aralığını test etmek de düşünülmelidir.

Cilde uygulanması

İnsanlar normal koşullar altında kimyasallara sınırlı dozlarla maruz kalırlar. Bu nedenle, insan maruz kalmasını taklit eden uygulama biçimi, yani normalde katılar için cildin 1-5 mg/cm2 si, sıvılar için cildin 10 μ1/cm2 si kullanılmalıdır. Miktar; beklenen kullanım koşullarıyla, çalışmanın amacıyla ya da test karışımının fiziksel özellikleriyle gerekçelendirilmelidir. Örnek olarak birim alanda geniş hacimler uygulanırsa, cilt yüzeyine sınırsız uygulama yapılabilir.

Sıcaklık

Kimyasalların pasif dağılması (ve buna bağlı cilt absorpsiyonları) sıcaklıktan etkilenir. Difüzyon bölümü ve cilt, normal cilt sıcaklığı olan 32 ± 1 oC’ye yakın olarak sabit sıcaklıkta elde edilmelidir. Farklı hücre tasarımları, alıcının/cildin fizyolojik normda olmasını sağlamak için farklı su banyosu ve ısıtılmış blok sıcaklıkları gerektirir. Nem oranı tercihen % 30 ila %70 arasında olmalıdır.

Maruz kalma ve örnekleme süresi

Cilt, test karışımına bütün test süresi veya daha kısa zaman maruz kalabilir (örn, belirli insan maruz kalma biçimine benzetmek için). Cilt, uygun temizleme ürünü ile test karışımının fazlasından temizlenmeli ve temizlikten kalanlar analiz için toplanmalıdır. Test karışımının temizlenmesi prosedürü, beklenen kullanım koşuluna bağlı olacaktır ve gerekçelendirilmelidir. 24 saatlik bir örnekleme süresi, absorpsiyon profilinin uygun karakterizasyonuna izin vermek için gereklidir. Cilt bütünlüğü 24 saatten fazla bir sürede bozulmaya başlayabileceği için örnekleme süresi 24 saati aşmamalıdır. Bu durum, cilde hızlı bir şekilde nüfuz eden test maddelerinde önemli olmayabilir ancak yavaşça nüfuz eden test maddeleri için daha fazla süre gerekebilir. Alıcı sıvının örnekleme sıklığı, test maddesinin absorpsiyon profilinin grafiksel olarak gösterilimine izin verecek şekilde ayarlanmalıdır.

Son işlemler

Test sisteminin bütün bileşenleri ve belirlenecek bulgular analiz edilmelidir. Bu verici bölümünü, temizlenen cilt yüzeyini, cilt karışımını ve alıcı sıvı/bölümünü içerir. Bazı durumlarda, ayrı analizler yapmak amacıyla cilt, maruz kalmış alanlara ve hücre kenarı altındaki cilt alanına, koruna (stratum corneum), epidermis ve dermis parçalarına ayrılabilir.

Analiz

Bütün çalışmalarda yeterli geri kazanım (hedef, radyoaktivitenin ortalama % 100±10’u olmalı ve herhangi bir sapma gerekçelendirilmelidir.) sağlanmalıdır.

Alıcı sıvı, cilt karışımı, cilt yüzeyi yıkamaları ve durulama aparatlarındaki test maddesi miktarı, uygun teknik kullanarak analiz edilmelidir.

VERİ

Alıcı sıvının analizi, test kimyasal maddesinin test sistemindeki dağılımı ve zamanla birlikte absorpsiyon profili sunulmalıdır. Maruz kalmada sonlu dozlar kullanıldığı zaman, ciltten yıkanan miktar, ciltle birleşmiş miktar (ve analiz edilirse farklı cilt tabakalarındaki miktar) ve alıcı sıvı içindeki miktar (uygulanan dozun hızı ve miktarı veya yüzdesi) hesaplanmalıdır. Deri absorpsiyonu, bazen, sadece alıcı sıvı verisi ile ifade edilebilir. Ancak, çalışma sonunda cilt üzerinde test maddesi kalıyorsa, bu da toplam absorbe edilen miktara eklenmelidir (bkz. Referans (3) içinde Paragraf 66). Sonsuz doz koşulları kullanıldığı zaman, veri, geçirgenlik sabitinin (Kp) hesaplanmasına olanak sağlar. Bu gibi durumlarda, absorpsiyon yüzdesi gerekli olmayabilir.

RAPORLAMA

Test raporu

Test raporu, protokolle düzenlenen gereklilikleri, kullanılan test sistemi için gerekçeyi ve aşağıdakileri içermelidir:

Test maddesi:

fiziksel yapı, fizyokimyasal özellikleri (en azından: moleküler ağırlık ve log Pow), saflık (radyokimyasal saflık),
kimlik bilgisi (örn. parti numarası),
alıcı sıvı içerisindeki çözünürlük.

Test karışımı:

formülasyon ve kullanım gerekçesi,
homojenlik.

Test koşulları:

cilt kaynakları ve alanı, karışım yöntemi, kullanımdan önce saklama koşulları, yapılan bütün ön muameleler (temizlik, antibiyotik tedavisi vb.), cilt bütünlüğü ölçümü, metabolik durum, kullanım gerekçesi,
hücre tasarımı, alıcı sıvı bileşimi, alıcı sıvının akış hızı ya da numuneleme süreleri ve prosedürleri,
test karışımı uygulamasının detayları ve uygulanan dozun nicel olarak ölçülmesi,
maruz kalma süresi,
test karışımının ciltten kaldırılma detayları, örn. cildin durulanması,
cilt analizlerinin detayları ve cilt dağılımını göstermek için kullanılan ayrıştırma tekniği,
hücre ve malzeme temizleme prosedürleri,
yardımcı yöntemler, çıkarma teknikleri, araştırma sınırları ve analitik yöntem doğrulama.

Sonuçlar:

deneyin bütün bulguları (Uygulanan doz =Ciltten durulananlar + Cilt + Alıcı sıvı + Hücreden durulananlar),
her bölümdeki ayrı hücre bulgularının tablosu,
absorpsiyon profili,
tabloda gösterilmiş absorpsiyon verisi (hız, miktar ya da yüzde cinsinden).

Sonuçların tartışılması.

Sonuç.

KAYNAKLAR

Test Yöntemi B.44 Deri Absorpsiyonu: İn Vivo Yöntemi
OECD, (2002) Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
OECD, (2000) Report of the Meeting of the OECD Extended Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.
Kemppainen B.W. and Reifenrath W.G., (1990) Methods for skin absorption. CRC Press, Boca Raton.
Bronaugh R.L. and Collier, S.W., (1991) Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Studies, in In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications, RL Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, p. 237-241.
Bronaugh R.L. and Maibach H.I., (1991) In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications. CRC Press, Boca Raton.
European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, (1993) Monograph No 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W., (1999) Test Guidelines for In Vitro Assessment of Dermal Absorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, p. 191-205.
Recommended Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No 65.
Howes, D., Guy, R., Hadgraft, J., Heylings, J.R. et al. (1996). Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Workshop Report ATLA 24, 81 R10.
Schaefer, H. and Redelmeier, T.E., (1996). Skin barrier: principles of percutaneous absorption. Karger, Basel.
Roberts, M.S. and Walters, K.A., (1998). Dermal absorption and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.
Jewell, C., Heylings, J.R., Clowes, H.M. and Williams, F.M. (2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74, p. 356-365.

$c:\documents and settings\isil.orhan\desktop\deney düzeneği.jpg$

Şekil 1 İn vitrociltten absorpsiyon çalışmaları için statik difüzyon hücresinin tipik tasarım örneği

B.46. İN VİTRO CİLT TAHRİŞİ: YENİDEN YAPILANDIRILMIŞ İNSAN EPİDERMİ MODEL TESTİ

YÖNTEM

Giriş

Cilt tahrişi, bir test maddesinin 4 saate kadar uygulanmasıyla ortaya çıkan, tersinir bir zarardır (Birleşmiş Milletler’in sınıflandırma ve etiketlemeye ilişkin Küresel Uyumlaştırılmış Sistemi’nde (UN GHS) tanımlanmıştır (1)). Bu test yöntemi, bilgi gerekliliklerine dayanan ve test stratejisi kapsamında bağımsız değiştirme testi olarak cilt hassaslaştırıcılığının belirlemesini sağlayan, delillerin ağırlığı yaklaşımlı in vitro prosedüre sahiptir(2).

Cilt tahrişinin değerlendirilmesi, genellikle laboratuvar hayvanlarının kullanımını gerektirir (bkz. Yöntem B.4) (3). Hayvan sağlığı ile ilgili kaygılara ilişkin olarak, yöntem B.4 sıralı test stratejisi uygulanarak geçerliliği kabul edilmiş olan in vitro ve ex vivo yöntemler kullanan cilt aşındırıcılığının/tahrişinin belirlenmesine izin vererek hayvanların eziyet ve acı çekmesine mani olunur. Geçerliliği kabul edilmiş olan üç in vitro test yöntemi ya da test rehberleri, B. 40, B. 40bis ve TG 435 (4, 5, 6), B. 4 ün sıralı test stratejisinin aşındırıcılık bölümü için kullanışlıdır.
Bu test yöntemi, örneğin epidermis gibi insan cildinin üst kısımlarının biyokimyasal ve fizyolojik özelliklerine oldukça benzeyen bütün tasarımlarında (hücre zarı, temsili doku ve sitoarşitektoni olarak epidermis keratinosidden elde edilmiş insani kullanım) yeniden yapılandırılmış insan epidermi modellerine dayalıdır. Bu test yöntemi dahilinde tanımlanan prosedür, UN GHS kategori 2 ile uyumlu tahriş edici maddelerin tehlikelerinin belirlenmesini sağlar. Bu Test Yöntemi, benzer ve değiştirilmiş olan yeniden oluşturulmuş insan epidermisi esaslı test yöntemleri için bir grup performans standardını da içerir (7).
Ön geçerlilik, optimizasyon ve geçerlilik çalışmaları, yeniden yapılandırılmış olan insan epidermis modelleri kullanarak EpiSkin™ ve EpiDerm™ gibi ticari olarak mevcut olan iki in vitro test yöntemi (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) için tamamlanmıştır. Bu referanslar R 38’e dayanır. GHS’nin amaçları için yeniden hesaplamaya dair belli bakış açıları, referans 25 içinde ele alınmıştır. EpiSkin™’e denk performansa sahip yöntemler (geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 1), GHS kategori 2 tahriş edici maddelerin sınıflandırılmasında kullanılan tavşan in vivo testi için bağımsız değiştirme test yöntemi olarak tavsiye edilir. EpiDerm™’e denk performansa sahip yöntemler (geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 2), GHS kategori 2 tahriş edici maddelerin sınıflandırılmasında kullanılan tarama test yöntemi olarak ya da delillerin ağırlığı yaklaşımında sıralı test stratejisinin bir bölümü olarak tavsiye edillir. Tahriş edicilik için önerilmiş in vitro yeniden yapılandırılmış insan epidermisi model testi yasal düzenlemeler yapmak amacıyla kullanılmadan önce, bu test yönteminde açıklanan performans standartlarına uygun olarak geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 1 ile mukayese edilebilirliğin sağlanması amacıyla önerilen kullanımının güvenilirliği, ilgisi (doğruluğu) ve kısıtlamaları belirlenmelidir (Ek).
Diğer iki in vitro yeniden yapılandırılmış insan epidermis test yöntemlerinin, bu test yöntemi bünyesindeki gereksinimlere uygun olarak geçerliliği kabul edilmiştir ve geçerliliği kabul edilmiş olan referans yöntem 1’dekine benzer sonuçlar verir(18). Bunlar değiştirilmiş EpiDerm™ test yöntemi (değiştirilmiş referans yöntem 2) ve SkinEthic RHE™ test yöntemidir (me-too yöntem 1).

Tanımlar

Aşağıdaki tanımlar bu test yönteminde kullanılır:

Doğruluk: Test yöntemi sonuçları ve kabul edilen referans değerleri arasındaki uyuşmanın yakınlığıdır. Test yöntem performansının bir ölçütüdür ve ilgili olduğunun göstergesidir. Bu terim, test yönteminin doğru sonuç dağılımını ifade etmek amacıyla uyum içerisinde değiştirilebilir bir biçimde kullanılır.
Seri kontrol maddesi: Dokunun orta seviyeli hücre canlılığına tepkisine neden olan değerlendirme maddesi.
Hücre canlılığı: Hücre popülasyonunun toplam aktivitesini ölçen parametre, örn. ölçülmüş sonlanma noktasına ve kullanılmış test tasarımına dayanan yaşayan hücrelerin toplam sayısı ve/veya canlılığı ile ilişkili canlı boya MTT’yi (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromür, Tiyazol mavi;) azaltmak için hücresel mitokondriyal dehidrojenazlar.
ET50: Belirli, sabit derişimde (bkz. IC50) bir işaretleyici madde uygulanması sonucu hücre canlılığını % 50 oranda azaltmak için gereken maruz kalma süresi.
Yanlış negatiflik oranı: Test yöntemi ile yanlışlıkla negatif olarak tanımlanmış bütün pozitif maddelerin oranı. Test yöntemi performasının bir belirtecidir.
Yanlış pozitiflik oranı: Yanlışlıkla pozitif olarak tanımlanmış olan bütün negatif (aktif olmayan) maddelerin oranı. Test yöntemi performasının bir belirtecidir.
Sınırsız doz: Tamamen ve eşit oranda cilt yüzeyini kaplaması için gereken miktarı geçen, cilde uygulanmış olan test maddesi miktarı.
GHS (Birleşmiş Milletler’in sınıflandırma ve etiketlemeye ilişkin Küresel Uyumlaştırılmış Sistemi): Fiziksel, sağlığa ve çevreye ilişkin zararların standartlaştırılmış çeşitlerine ve seviyelerine göre, maddelerin ve karışımların sınıflandırmasını sağlayan ve zararlılık işaretleri, uyarı kelimeleri, zararlılık ifadeleri, önlem ifadeleri ve güvenlik bilgi formları gibi iletişim araçları ile insan sağlığını (çalışanları, işçileri, taşıyıcıları, tüketicileri ve acil durumda müdahale edenleri içerir) ve çevreyi (1) bunların yan etkilerinden korumaya yönelik bilgileri içeren, Maddelerin ve Karışımların Sınıflandırılması, Etiketlenmesi ve Ambalajlanması Hakkında Yönetmelik ile uygulanan sistemdir.
IC50: Belirli maruz kalma süresinden sonra doku canlılığının % 50 (IC50) oranda azaldığı işaretleyici madde derişimidir, bkz. ET50.
Performans standartları: Mekanik ve fonksiyonel olarak benzer olan önerilmiş bir test yönteminin mukayese edilebilirliğinin değerlendirilmesi için geçerliliği kabul edilmiş referans yönteme dayalı standartlardır. (I)Zaruri test yöntemi bileşenlerini; (II) geçerliliği kabul edilmiş referans yöntemin kabul edilebilir performansını kanıtlamak için kullanılan maddeler arasından seçilen referans maddelerin azami listesini ve (III) geçerliliği kabul görmüş referans yöntemler için elde edilmiş olana dayalı doğruluk ile güvenilirliğin karşılaştırılabilir seviyesini içerir. Burada geçerli referans yöntemden elde edilenlere göre referans maddelerin azami listesi kullanılarak bir değerlendirme yapıldığında önerilen test yöntemi belirtilmelidir.
Güvenilirlik: Aynı protokolü kullanarak uygulandığında, zaman içerisinde laboratuvarlar içinde ve arasında yeniden üretilebilir şekilde uygulanabilen test yönteminin ölçüm kapsamı. Laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası yeniden üretilebilirlik hesaplanarak değerlendirilir.

Duyarlılık: Test ile doğru bir şekilde sınıflandırılmış bütün pozitif/aktif maddelerin oranı. Kategorik sonuçlar üreten bir test yöntemi için doğruluk ölçümüdür ve test yönteminin uygunluk değerlendirmesinde önemli bir etkendir.

Özgüllük: Test ile doğru bir şekilde sınıflandırılmış bütün negatif/inaktif maddelerin oranı. Kategorik sonuçlar üreten bir test yöntemi için doğruluk ölçümüdür ve test yönteminin uygunluk değerlendirmesinde önemli bir etkendir.

Cilt tahrişi: Bir test maddesinin 4 saate kadar uygulanmasıyla ortaya çıkan geri dönüşümü olan cilt zararıdır. Cilt tahrişi, uyarımdan sonra kısa süreliğine görülen lokal olarak yükselen, immunojen olmayan tepkimedir (24). İnflamatuar reaksiyonları ve inflamatuar reaksiyon ile tahrişin (cilt kızarıklığı, ödem, kaşınma ve ağrı) klinik bulgularının çoğunu kapsayan geri dönüştürülebilir süreç bunun temel özelliğidir.

Amaç ve Sınırlandırmalar

Bu test yöntemi kapsamındaki yeniden yapılandırılmış insan epidermi testleri maddelerin sadece BM GHS Kategori 2’ye göre cilt tahriş edici olarak sınıflandırmasını içerir. Bu testler BM GHS’de tanımlandığı üzere maddelerin isteğe bağlı kategori 3’de sınıflandırılmasına izin vermediği için, artan tüm maddeler sınıflandırılmamalıdır (kategori yok). Yasal düzenlemeler yapma ihtiyacına bağlı olarak ve yeni sonlanma noktalarının eklenme olasılığına bağlı olarak, yeni me-too testin ilerlemesi ve gelişimini, bu test yöntemi revize edilebilir.

Bu test yöntemi, tahriş edici tek-bileşenli maddelerin (19) zararlarının tanımlanmasına olanak sağlar, ancak cilt aşındırıcılığına ilişkin yeterli bilgi vermez. Karışımlar, geçerlilik çalışmasında henüz değerlendirilmediğinden gazlar ve aerosoller test edilemez.

Testin İlkesi

Test maddesi; çok katmanlı, yüksek derecede farklılaşmış insan epidermi modeli biçimlendirmek için normal, insan kaynaklı epidermal keratinositlerden oluşan üç boyutlu yeniden yapılandırılmış insan epidermi modeline bölgesel olarak uygulanır. Bu, düzenli bazal, dikenli ve granüler katmanlar ve in vivo’da bulunana benzeyen modellerde düzenlenmiş hücresel lamellar lipid katmanlar içeren çok katmanlanmış korundan (stratum corneumdan) meydana gelmektedir.

Yeniden yapılandırılmış insan epidermi model testinin ilkesi, sitosidal tahriş edici maddelerin difüzyon ile koruna (stratum corneuma) nüfuz edebilmesi ve alttaki katman içindeki hücrelere sitotoksik olması temeline dayanır. Hücre canlılığı, canlı boya MTT’nin [3-(4,5- Dimetiltiazol -2-il)-2,5- difenil tetrazolium bromür, Tiyazol mavi; EINECS numarası 206-069-5, CAS numarası 298-93-1)], dokulardan özütlenmesinden sonra nicel olarak ölçülen mavi formazan tuzlara dehidrojenaz çevrilmesiyle ölçülür (20). Tahriş edici maddeler, tanımlanmış olan eşik düzeyi (örn. BM GHS Kategori 2 Tahriş Edici için ≤ % 50) altında hücre canlılığını azaltabilme yeterlilikleriyle tanımlanırlar. Tanımlanmış olan eşik düzeyi altında hücre canlılığını üreten maddeler sınıflandırılmayacaktır (örn. > % 50, kategori yok).
Yeniden yapılandırılmış insan epidermi model sistemleri, test katılarına, sıvılarına, yarı katı ve mumlarına uygulanabilir. Sıvılar, sulu ya da susuz, su içerisinde çözünür ya da çözünmez olabilirler. Mümkün ise katılar ince bir toz halinde test edilmelidirler. Geniş bir kimyasal sınıf yelpazesini temsil eden dikkatlice seçilmiş 58 madde, yeniden yapılandırılmış insan epidermi model test sistemlerinin geçerliliğinde yer almıştır, test yöntemlerinin genellikle kimyasal sınıflar üzerinden uygulanabilir olması beklenir (16). Geçerli kılma, 13 GHS Kateori 2 Tahriş Edici’yi içerir. Aşındırıcı olmayan asitler, bazlar, tuzlar ve diğer inorganik maddelerin geçerlilik kapsamında olmadığını ve hidroperoksitler, fenoller ve yüzey aktif maddeler gibi bilinen bazı organik tahriş edici sınıfların içerilmediği ya da sınırlı oranda içerildiği dikkate alınmalıdır.

Yeterlilik Gösterimi

Bu test yöntemine bağlı olan geçerliliği kabul edilmiş bir yöntemin rutin kullanımından önce, laboratuvarlar, Tablo 1’de tavsiye edilen 10 test maddesini kullanarak, teknik yeterliliği göstermeyi isteyebilirler. Bu test yöntemi kapsamında, BM GHS isteğe bağlı kategori 3 “kategorisiz” olarak nitelendirilir. Geçerliliği kabul edilmiş olan referans yöntemlere yapısal ve fonksiyonel olarak benzeyen bu test yöntemi kapsamında geliştirilmiş yeni benzer (me-too) test yöntemleri için ya da geçerliliği kabul edilmiş yöntemlerin değişiklikleri için bu test yönteminin ekinde tanımlanmış olan performans standartları, yasal düzenlemeler amacıyla test yapmak için kullanımından önce yeni test yönteminin karşılaştırılabilir güvenilirliğinin ve doğruluğunun gösterimi için kullanılmalıdır.

Tablo 1

Ek içerisinde listelenmiş olan referans maddelerin alt kümesi olan yeterlilik maddeleri

Madde	CAS Numarası	İn vivo puanı	Fiziksel durum	GHS kategorisi
Naftalin asetik asit	86-87-3	⁰	^S	^{Kategori Yok}
^İzopropanol	67-63-0	^0,3	^L	^{Kategori Yok}
^{Metil stearat}	112-61-8	¹	^S	^{Kategori Yok}
^{Heptil butirat}	5870-93-9	^1,7	^L	^{İsteğe bağlı Kategori 3}
^{Hekzil salisilat}	6259-76-3	²	^L	^{İsteğe bağlı Kategori 3}
^{Siklamen aldehit}	103-95-7	^2,3	^L	^{Kategori 2}
^{1- bromohekzan}	111-25-1	^2,7	^L	^{Kategori 2}
^{Bütil metakrilat}	97-88-1	³	^L	^{Kategori 2}
^{1-metil -3 fenil- 1piperazin}	5271-27-2	^3,3	^S	^{Kategori 2}
^Heptanal	111-71-7	⁴	^L	^{Kategori 2}

Yöntemin Tanımı

Cilt tahrişi değerlendirmesi için yeniden yapılandırılmış insan epidermi model testinin usulleri ve bileşenlerinin tanımı aşağıda verilmiştir. Yeniden yapılandırılmış insan epidermi modeli yapılandırılabilir, hazırlanabilir ya da ticari olarak (örn. EpiSkin™, EpiDerm™ ve SkinEthic RHE™) elde edilebilir. EpiSkin™, EpiDerm™ ve SkinEthic RHE™ için standart test yöntemi protokolleri, [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] internet adresinden elde edilebilir (21, 22, 23). Test aşağıdakilere göre yürütülür:

Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermi Modeli Bileşenleri

Genel model koşulları

Normal insan keratinosidleri, epitelyum yapılandırması için kullanılabilir. Canlı epitelyal hücrelerin çoklu katmanları (bazal katman, stratum spinosum, stratum granulosum), fonksiyonel korun (stratum corneum) altında gösterilmelidir. Korun (stratum corneum), sitosidal işaretleyici maddenin hızlı nüfuz direncine karşı bir fonksiyonel bariyer üretmek için temel yağ kesiti içeren çok katmanlı bir yapıya sahip olmalıdır, örn. sodyum dodesil sülfat (SDS) ya da Triton X-100. Bariyer fonksiyon, belirli maruz kalma süresinden sonra dokuların hücre canlılığını %50 (IC50) oranda azaltan işaretleyici madde derişiminin belirlenmesiyle veya belirli ve sabit bir derişimdeki işaretleyici maddenin hücre canlılığını %50 (ET50) oranda azalttığı maruz kalma süresinin tayiniyle değerlendirilebilir. Modelin içerik özellikleri, korun (stratum corneum) etrafındaki materyalin canlı dokuya geçişine engel olmalıdır çünkü bu durum cilt maruz kalmasına ilişkin yetersiz modellemeye yol açar. Cilt modeli, bakteriler, virüsler, mikoplazma ya da mantar ile kirlenmemiş olmalıdır.

Fonksiyonel model koşulları

Canlılık

Canlılık boyutunun belirlenmesi için tercih edilen analiz MTT dir (20). Negatif kontrol (NC) ile muamele edilmiş olan dokudan özütlenmiş (çözünmüş) boyanın optik yoğunluğu (OD), özütleme çözeltisinin kendi optik yoğunluğundan en az 20 kat daha büyüklük olmalıdır. NC ile muamele edilmiş olan dokunun, test maruz kalma süreci boyunca kültürde (benzer canlılık ölçümlerinde) kararlı olduğu belgelendirilmelidir.

Bariyer fonksiyon

Korun (stratum corneum) ve buna ait yağ bileşimi, sitotoksik işaretleyici maddelerin hızlı nüfuzuna karşı direnç gösterebilmelidir.Örneğin IC50 veya ET50 ile tahmin edilen SDS ya da Triton X-100.

Morfoloji

Yeniden yapılandırılmış cildin/epidermisin histolojik analizi, uygun nitelikli personel ile gerçekleştirilmelidir. Bu personel yapıyı, insan cildi/epidermisi benzeri (çok katmanlı hale getirilmiş korun (stratum corneum) içeren) yapı olarak ayırt edebilmelidir.

Tekrarlanabilirlik

Belirli bir model kullanan yöntemin sonuçları, tercihen uygun seri kontrol (değerlendirme) maddesi ile zaman içerisinde tekrarlanabilirliği göstermelidir (bkz. Ek).

Modelin Kalite Kontrolleri (QC)

Kullanılan her epidermal modelin serisi, üretim salım kriterini karşılamalıdır ki bunlardan en ilgiliolanları canlılık (paragraf 1.6.1.2.1) ve bariyer fonksiyon (paragraf 1.6.1.2.2) için olanlardır. IC50 ya da ET50 için kabul edilebilir aralık (üst limit ve alt limit), cilt model tedarikçisiyle (ya da kurum içi model kullanırken bir araştırmacı ile) geliştirilmelidir. Dokuların bariyer özellikleri, dokuların alınmasından sonra laboratuvar tarafından doğrulanmalıdır. Sadece nitelikli dokular ile üretilmiş olan sonuçlar tahriş etkilerinin güvenilir tahmini için kabul edilebilir. Örnek olarak geçerliliği kabul edilmiş yöntemler için kabul edilebilir aralık aşağıda verilmektedir.

Tablo 2

Kalite Kontrol Seri Salım Kriteri Örnekleri

	Alt kabul sınırı	Kabul aralığı ortalaması	Üst kabul sınırı
_{Geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem}₁ (SDS ile 18 saat tedavi)	IC₅₀= 1,0 mg/ml	IC₅₀= 2,32 mg/ml	IC₅₀= 3,0 mg/ml
_{Geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem}₂ (% 1 Triton X-100)	ET₅₀= 4,8 saat	ET₅₀= 6,7 saat	ET₅₀ = 8,7 saat

Test ve Kontrol Maddelerinin Uygulanması

Her muamele ve kontrol için yeterli sayıda (en az üç) tekrar yapılmalıdır. Yeterli miktarda test maddesi,katı maddeler gibi sıvı maddeler için de, sonsuz dozdan kaçınmakla beraber cilt yüzeyini eşit düzeyde kaplamak için uygulanmalıdır, örneğin minimum 25 μL/cm2 ya da 25 mg/cm2 kullanılmalıdır. Katı maddeler için, uygulamadan önce cilt yüzeyi ile iyi temas etmesini sağlamak amacıyla epidermis yüzeyi deiyonize veya damıtılmış su ile nemlendirilmelidir. Mümkün olduğunda katılar ince bir toz halinde test edilmelidir. Maruz kalma sürecinin bitiminde, sulu tampon ya da % 0,9 NaCl ile test maddesi cilt yüzeyinden dikkatli bir şekilde yıkanmalıdır. Kullanılan yeniden yapılandırılmış insan epidermi modeline bağlı olarak, maruz kalma süresi 15 ila 60 dakika arasında ve 20 ila 37 °C arasındaki inkübasyon sıcaklığında değişiklik gösterebilir. Detaylar için, üç yönteme (21, 22, 23) ilişkin olan “Standard Uygulama Usulleri”ne bakınız.

Dokuların canlılık (NC), bariyer fonksiyon ve nihai doku hassasiyetlerinin (PC)geçmişte belirlenen kabul edilebilirlik aralığının içerisinde olduğunugöstermek amacıyla her çalışmada eş zamanlı NC ve pozitif kontroller (PC) kullanılmalıdır. Tavsiye edilen PC madde % 5’lik sulu SDS’dir. Tavsiye edilen NC maddeler, su ya da fosfat ile tamponlanmış tuzlardır (PBS).

Hücre Canlılığı Ölçümleri

Test prosedürünün en önemli elementi, canlılık ölçümlerinin test maddelerine maruz kalmanın hemen ardından yapılmayıp, temiz ortam içerisinde durulanmış dokuların yeterli sürede muamele sonrası inkübasyon periyodundan sonra yapılıyor olmasıdır. Bu periyot, hem zayıf tahriş edici etkilerden kurtulmaya hem de temiz sitosidal etkilerin ortaya çıkmasına izin verir. Test optimizasyon fazı esnasında (9, 10, 11, 12, 13), 42 saat muamele sonrası inkübasyon periyodunun optimal olduğu kanıtlanmış ve bu nedenle referans test yöntemlerinin geçerliliğinde kullanılmıştır.

MIT çevrim deneyi, hücre canlılığını ölçmek için kullanılması gereken ve nicel olarakgeçerliliği kabul edilmiş bir yöntemdir. Bu yöntem, üç boyutlu doku yapılandırılmasında kullanım ile uyumludur. Cilt numunesi, uygun derişimdeki (örn. 0,3-1 mg/mL) MIT çözeltisine 3 saatliğine yerleştirilir. Çöktürülmüş mavi formazan ürün, bir çözücü ile (örn. isopropanol, asidik isopropanol) dokudan uzaklaştırılır ve formazan derişimi maksimum ± 30 nm’lik bant geçirici kullanarak 570 nm’de OD tayiniyle ölçülür.
Test maddesinin optik özellikleri ya da MTT üzerine kimyasal etkisi, canlılığın yanlış tahminine neden olan deney ile çatışabilir (çünkü test maddesi, renk jenerasyonuna neden olmasının yanı sıra buna engel olabilir ya da tersine de çevirebilir). Bu, test maddesi durulama ile ciltten tamamen çıkarılmadığında ya da epidermisin içine nüfuz ettiğinde meydana gelir.
Eğer test maddesi MTT üzerine doğrudan etki eder, doku muamelesi esnasında doğal olarak boyanır ya da boyanmış hale getirilir ise, test maddesi etkileşiminin tespiti ya da doğrulanması amacıyla,canlılık ölçüm tekniği kullanılarak ek kontroller yapılmalıdır. MTT indirgenmesinin doğrudan nasıl yapılacağının detaylı olarak açıklandığı geçerliliği kabul edilmiş referans yöntemler (21, 22, 23) için test yöntemi protokollerine başvurun. Bu etkileşimlerden dolayı özel olmayan renk (NSC), NC’nin % 30’unu geçmemelidir (düzeltmeler için). Eğer NSC %30’dan büyük ise test maddesinin test ile uyumsuz olduğu kabul edilir.

Deney Kabul Edilebilirlik Kriteri

Geçerliliği kabul edilmiş seriler (bakınız paragraf 1.6.1.2.5) kullanan her deney için NC ile muamele edilmiş dokular, taşınması ve kabul adımları ve tahriş protokollerini takip eden dokuların kalitesini yansıtan optik yoğunluk (OD) ortaya koymalıdır. Kontrollerin OD değerleri, önceden belirlenmiş olan alt sınırların altında olmamalıdır. Benzer olarak, PC ile muamele edilmiş olan dokular, örneğin % 5’lik sulu SDS, her bir deneyin kendi koşulları için, dokulardaki hassasiyeti ve tahriş edici bir maddeye olan müdahaleyi yansıtmalıdır (örneğin geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 1 için canlılık ≤ %40 ve geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 2 için canlılık ≤ %20). Doku tekrarları arasında değişebilirliğin ilgili ve uygun ölçümleri açıklanmalıdır (örneğin eğer standart sapmalar kullanılır ise bunlar ≤ %18 olmalıdır).

Yüklə 5,29 Mb.

Dostları ilə paylaş:

1 ... 36 37 38 39 40 41 42 43 ... 81