FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler

Geçerliliği Kabul Edilmiş Yöntem 1’in Performansı¹

Test Yöntemi	Madde No	Hassasiyet	Özgünlük	Yanlış negatif oran	Yanlış pozitif oran	Doğruluk
Geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 1 (^1)	58	%87,2 (^2)	% 71,1 (^3)	%12,8	%29,9	%74,7
Geçerliliği kabul edilmiş referans yöntem 1 (^1)	20	%90	%73,3	%10	%26,7	%81,7

(1) EpiSkin™

(2) 13 GHS kategori 2 tahriş edicilere göre

(3) 45 GHS kategori 3 tahriş edicilere ya da GHS kategorisi olmayan kimyasallara göreÖnerilen test yönteminin güvenilirliği, geçerliliği kabul edilmiş olan referans yöntemlere kıyaslanabilir olmalıdır.

Laboratuvar içerisinde tekrarlanabilirlik
Laboratuvar içerisinde değişkenliğin değerlendirmesi, bir tek laboratuvar içerisinde 20 referans maddenin farklı, bağımsız testlerdekisınıflandırma uyumu ( kategori 2/kategori yok) %90’a eşit ya da daha fazlaolmalıdır.
Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik
Eğer önerilen test yöntemi sadece bir laboratuvarda kullanılacak ise laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliğin değerlendirmesi gerekli değildir. Laboratuvarlar arasında transfer edilecek olan yöntemler için tercihen minimum üç laboratuvar arasında 20 referans maddenin farklı, bağımsız testlerdeki sınıflandırmaların uyumu ( kategori 2/kategori yok), %80’e eşit ya da daha fazla olmalıdır.
Kaynaklar
1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559-601.

2. OECD (2005) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Paris.

3. ECVAM (2007) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Available under Download Study Documents, at http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Accessed on 27.10.2008.

4. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Yöntems 65, 55-63.

5. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603-619.

B.47. OKÜLER AŞINDIRICILAR VE CİDDİ TAHRİŞ EDİCİLERİ TEŞHİS İÇİN SIĞIR KORNEASI OPAKLIĞI VE GEÇİRGENLİĞİ TEST YÖNTEMİ
GİRİŞ

1. 
   Sığır korneası opaklığı ve geçirgenliği (BCOP) test yöntemi, maddeleri ve karışımları bazı koşullarda ve belli sınırlamalarla “oküler aşındırıcı ve ciddi tahriş edici” olarak tanımlamak için kullanılabilen in vitrobir test yöntemidir (1) (2) (3). Bu test yöntemi açısından ciddi tahriş ediciler, tavşanlara tatbik edildikten sonra en az 21 gün boyunca oküler yaralara yol açan tahriş edicilerdir. BCOP in vivotavşan gözü testine tam bir alternatif olmasa da belli bir uygulama alanında düzenleyici sınıflandırma ve etiketleme için aşamalı test stratejisinin parçası olarak önerilmektedir (4) (5). Test edilen maddeler ve karışımlar (6) tavşanlarda ayrıca test yapmaya gerek kalmadan oküler aşındırıcı veya ciddi tahriş edici olarak kategorize edilebilirler. Test sonucu negatif çıkan maddenin, OECD Test Yönergesi 405 (7) (BuEk’in B. 5 kısmı) gereğince ardışık test stratejisi kullanılarak tavşanlar üzerinde test edilmesine gerek kalmamaktadır.
   

2. 
   Bu test yönteminin amacı, test maddesinin oküler aşındırıcılık veya ciddi tahriş edicilik potansiyelini izole sığır korneası üzerinde opaklığa ve artan geçirgenliğe yol açma düzeyi ölçülmek suretiyle değerlendirecek usulleri belirlemektir. Kornea üzerinde toksik etkiler (i) azalan ışık iletkenliği (opaklık) ve (ii) artan sodyum floresin boya geçişi (geçirgenlik) ölçülerek tespit edilir. Korneanın test materyaline maruz bırakılmasından sonra yapılan kornea opaklık ve geçirgenlik ölçümleri birleştirilerek, test materyalinintahriş edicilik düzeyini sınıflandırmak için kullanılan lnVitroTahriş Edicilik Puanı (IVIS) elde edilir.
   

3. 
   21 günden daha az süreli yaralara yol açan oküler tahriş ediciler ve tahriş edici olmayan maddeler de BCOP test yöntemi kullanılarak test edilmektedir. Ancak, bu kategorilerdeki maddeler için BCOP test yönteminin kesinliği ve güvenilirliği resmi olarak değerlendirilmemiştir.
   

4. 
   Tanımlar Ek-I’de yer almaktadır.
   

ÖNCELİKLİ HUSUSLAR VE SINIRLAR

5. 
   Bu test yöntemi Avrupa Alternatif Yöntemler Değerlendirme Merkezi (ECVAM) ve Japonya Alternatif Yöntemler Değerlendirme Merkezi (JaCVAM) katkılarıyla hazırlanan uluslararası değerlendirme çalışması (4)(5)(9) sonucunda Alternatif Yöntemlerin Değerlendirilmesi Konusunda Kurumlararası Koordinasyon Komitesi (ICCVAM) tarafından oluşturulan BCOP test yöntemi protokolüne (8) dayanmaktadır. Protokol InVitro Bilimler Enstitüsü’nden (IIVS) edinilen bilgiler ile 1997-1998 döneminde Avrupa Topluluğu desteğinde gerçekleştirilen BCOP deneyinin ön değerlendirme çalışmasında kullanılan protokol mahiyetindeki INVITTOX Protokolü 124 (10) temelindedir. Her iki protokol de ilk defa Gautheronv.d. tarafından raporlanan BCOP deney protokolüne dayanmaktadır (11).
   

6. 
   Bu test yönteminin tanımlanmış sınırları, değerlendirme veri tabanında alkoller ve ketonlarda yüksek düzeyde hatalı pozitif ve katı maddelerde yüksek düzeyde hatalı negatif oranlara dayanır (bkz. fıkra 44) (5). Bu kimyasal ve fiziksel vasıftaki maddeler veri tabanından çıkarıldığı zaman AB, EPA ve GHS sınıflandırma sistemleri üzerinden BCOP kesinliği ciddi ölçüde artmaktadır (5). Bu deneyin amacına bağlı olarak, hatalı negatif oranlar kritik düzeyde sayılmaz. Çünkü, (örneğin sadece oküler aşındırıcıların/ciddi tahriş edicilerin teşhisi dikkate alındığında) maddeler daha sonra tavşanlar üzerinde veya düzenleyici koşullara göre doğrulanmış bir diğer in vitroyöntemle, ardışık test stratejisi ve kanıt ağırlığı yaklaşımıyla test edilir. Ayrıca, mevcut değerlendirme veri tabanı bazı kimyasal maddelerin ve karışımlar gibi bazı ürünlerin doğru şekilde değerlendirilmesine olanak sağlamamaktadır. Bununla birlikte, araştırmacılar bu yöntemi kullanmayı oküler aşındırıcı veya ciddi tahriş edici tepkisi olarak pozitif sonuçlar beklenen hallerde her türden test maddesi (karışımlar dahil) için dikkate alabilirler. Yine de ciddi öngörü riski nedeniyle, alkoller ve ketonlar için elde edilen pozitif sonuçlar daha dikkatle yorumlanmalıdır.
   

7. 
   Sığır gözleri ve sığır korneaları ile yapılacak tüm işlemler, hayvansal materyallerin işlemden geçirilmesi için testin yapıldığı tesiste geçerli olan düzenlemeler ve prosedürlere uygun olmalıdır. Hayvansal materyaller, sadece, dokular ve doku sıvıları ile sınırlı değildir. Genel laboratuvar önlemlerinin alınması tavsiye edilir(12).
   

8. 
   Sözkonusu test yönteminin bir eksikliği, tavşan oküler tahriş edicilik test yöntemiyle değerlendirilen bazı oküler etkileri ve belli düzeyde ağırlık durumunu dikkate alsa da, konjonktiv (göz zarı) ve iris lezyonu gözönünde bulundurmamasıdır. Ayrıca, kornea yaralarının düzelmesi BCOP deneyinde başlı başına değerlendirilemese de tavşan gözü çalışmalarına dayanılarak kornea yaralanmasının ilk derinliğine dair değerlendirmenin düzelebilir veya düzelemez nitelikte etkileri ayırt etmekte kullanılabileceği ileri sürülmektedir (13). Son olarak, BCOP gözün maruz kalmasıyla ilgili sistemik toksisite potansiyelinin değerlendirilmesine olanak tanımamaktadır.
   

9. 
   BCOP’nin ciddi olmayan tahriş ediciler ile tahriş edici olmayan maddelerin teşhisinde yararları ve sınırları hakkında tespit çalışmaları halen sürmektedir (ayrıca bkz. paragraf 45). BCOP test yönteminin ciddi olmayan tahriş ediciler ile tahriş edici olmayan maddelerin teşhisi dahil olmak üzere gelecekteki olası kullanımlarının resmi değerlendirmesi için kullanıcıların numuneleri ve/veya bulguları değerlendirme kuruluşlarına göndermeleri önerilmektedir.
   

10. 
    Bu deneyin ilk defa yapılacağı laboratuvarlardaEk-II’de belirtilen test yeterlilik referans kimyasallarının kullanılması gerekmektedir. Laboratuvarlar BCOP deneyi verilerini mevzuata göre zararlılık sınıflandırması için sunmadan önce bu kimyasalları kullanarak BCOP test yöntemini kullanabilme yeterliliklerini ortaya koyabilirler.
    

TEST İLKESİ

11. 
    BCOP test yöntemi sığır korneasının normal fizyolojik ve biyokimyasal fonksiyonunu kısa vadeli olarak in vitro sürdüren organotipik bir modeldir. Bu test yönteminde test maddesinin yol açtığı hasar kornea opaklığındaki değişimin opaklık ölçerle, kornea geçirgenliğindeki değişimin görünür ışık spektrofotometresiyle ölçülmesi sonucu elde edilen nicel verilerle değerlendirme yapılır. Her iki ölçümden elde edilen değerler test maddesinin in vivooküler tahriş olma potansiyelini öngörecek in vitrotahriş edicilik zararlılık sınıflandırma kategorisini belirlemekte kullanılacak olan IVIS değerinin hesaplanmasında kullanılacaktır (bkz. Sonuç kriterleri).
    

12. 
    BCOP test yönteminde yeni kesilmiş sığırların gözlerindeki izole kornea kullanılır. Kornea opaklığı korneadan geçen ışık miktarı üzerinden ölçülür. Geçirgenlik, korneanın tamamından geçerek arka odacıktaki ortamda saptanan sodyum floresin boyası miktarıyla ölçülür. Test maddeleri kornea tutucuları ön odacığına eklenmek suretiyle korneanın epitel yüzeyine tatbik edilirler. BCOP deneyinde kullanılan kornea tutucunun tanımı ve çizimi Ek III’te yer almaktadır. Kornea tutucuları farklı kaynaklardan ticari olarak elde edilebilir veya imal edilebilirler.
    

Sığır Gözlerinin Kaynağı ve Yaşı ile Hayvan Türlerinin Seçimi

13. 
    Mezbahalara gönderilen sığırlar insanlar tarafından tüketilmek veya diğer ticari amaçlar için öldürülmektedir. BCOP uygulaması için yalnızca insan besin zincirinde yer almaya uygun sağlıklı hayvanların korneaları kullanılacaktır. Sığırlarda ırklara, yaşa ve cinsiyete göre ağırlık çok çeşitli olduğundan dolayı hayvanın kesimi için tavsiye edilen bir ağırlık bulunmamaktadır.
    

14. 
    Değişik yaşlarda hayvanlardan alınan kornealar kullanıldığında kornea boyutları da değişik olmaktadır. Yatay çapı >30.5 mm ve orta kornea kalınlığı (CCT) > 1100 µm değerlerinde olan kornealar genellikle sekiz yaşından büyük sığırlardan, Yatay çapı < 28,5 mm ve CCT < 900 µm değerlerinde olan kornealar ise beş yaşından küçük sığırlardan elde edilmektedir (14). Bu nedenle 60 aydan büyük sığırların korneaları çoğunlukla kullanılmamaktadır. 12 aydan küçük sığırların korneaları gözler gelişim aşamasında olduğu ve kornea kalınlığı ile kornea çapı yetişkin sığırlarda bildirilenden çok daha küçük olduğu için kullanılmamaktadır. Ancak, daha kolay bulunabilmesi, dar yaş aralığı ve çalışanların Sığır SponjiyözEnsefalopatisine maruz kalma riskinin düşük olması gibi avantajlar sözkonusu ise küçük hayvanların (6 ila 12 aylık) kornealarının kullanılması da mümkündür (15). Kornea boyu veya kalınlığının aşındırıcı ve tahriş edici maddelere tepkide oynadığı rolün değerlendirilmesi için çalışmada kullanılan korneaların alındığı hayvanların tahmini yaşlarının ve/veya ağırlıklarının da bildirilmesi önerilir.
    

Gözlerin Toplanması ve Laboratuvara Taşınması

15. 
    Gözler mezbaha çalışanlarınca toplanacaktır. Gözlere verilebilecek mekanik veya diğer türden zararları azaltmak için gözler ölümden hemen sonra çıkartılacaktır. Gözlerin tahriş olma potansiyeli bulunan maddelere maruz kalmaması için mezbaha çalışanları hayvan kafalarını yıkarken deterjan kullanmayacaktır.
    

16. 
    Gözler uygun boyda bir kap içinde tamamıyla Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS) batırılacak ve bozulmayı ve/veya bakteriyel kirlenmeyi engellemek için bu şekilde laboratuvara taşınacaktır. Gözler kesim işlemleri sırasında toplandığı için kana ve bakteriler ve diğer mikroorganizmalar gibi biyolojik maddelere maruz kalmış olabilirler. Bu nedenle, kirlenme riskinin azaltılması büyük önem taşımaktadır. Örneğin gözlerin bulunduğu kap ıslak buz üzerinde saklanabilir, gözlerin taşıma sırasında korunduğu HBSS’ye 100 IU/ml penisilin ve 100 µg/ml streptomisin gibi antibiyotikler eklenebilir.
    

17. 
    Korneaların toplanması ile BCOP deneyinde kullanılması arasındaki zaman aralığı en aza indirilmeli (kornealar toplanıldıkları gün kullanılmalı) ve deney sonuçlarına olası etkisi yönünden belirtilmelidir. Bu sonuçlar pozitif ve negatif kontrol tepkilerinin yanı sıra göz seçme kriterleriyle de belirlenmektedir. Deneyde kullanılan gözlerin tamamı belli bir günde toplanmış aynı grup gözlerden olacaktır.
    

BCOP Deneyinde Kullanılacak Gözler İçin Seçme Kriterleri

18. 
    Gözler laboratuvara gelir gelmez, artan opaklık, çizikler ve neovaskülerizasyon kusurları dikkatle incelenecektir. Yalnızca bu türden kusurları bulunmayan gözler kullanılabilir.
    

19. 
    Her korneanın kalitesi deneyin diğer aşamalarında da değerlendirilecektir. Bir saatlik dengeleme süresi sonunda opaklık birimi yediden fazla olan kornealar atılacaktır (NOT: opaklık ölçerin kalibrasyonuopaklık birimini belirlemek için kullanılan opaklık standartlarında yapılacaktır, bkz. Ek III).
    

20. 
    Her bir uygulama grubu (test materyali, eşzamanlı negatif ve pozitif kontroller) en az üç gözden oluşacaktır. BCOP deneyindeki negatif kontrol korneaları için üç kornea kullanılacaktır. Korneaların hepsi bütün göz küresinden kesildiği ve kornea odalarına oturduğu için malzemelerin tekil kornea opaklığı ve geçirgenliği değerlerini (negatif kontrol dahil) tutma potansiyeli mevcuttur. Ayrıca, negatif kontrol kornealarından elde edilen opaklık ve geçirgenlik değerleri IVIS hesaplamalarındaki test maddesini ve pozitif kontrolden gelen kornea opaklığı ve geçirgenliği değerlerini düzeltmek için kullanılmaktadır.
    

İŞLEM
Gözlerin Hazırlanması

21. 
    Kusur bulunmayan kornealar tutmayı kolaylaştırmak için 2 ila 3 mm kenarlı göz akı bırakılacak şekilde kesilirler. Kornea epiteline ve endoteline zarar vermemek için özen gösterilir. İzole kornealar ön ve arka odacıklara sahip, korneanın epitel ve endotel taraflarına ayrı ayrı temas eden özel tasarımlı kornea tutucularına oturtulurlar. Odacıkların her biri önceden ısıtılmış Eagle's Minimum Öz Maddesi (EMEM) ile sonuna kadar doldurulurlar (arka odacık önce olmak üzere). Kabarcık oluşmamasına dikkat edilir. Daha sonra cihazın en az bir saat boyunca 32 ± 1 °C sıcaklıkta dengelemesi yapılarak korneaların maddeyle dengelenmesi ve mümkün olduğunca normal metabolik faaliyete ulaşmaları sağlanır (kornea yüzeyi için in vivoyaklaşık sıcaklık 32 °C).
    

22. 
    Dengeleme süresinden sonra odacıkların ikisine de taze, önceden ısıtılmış EMEM eklenir ve her korneanın taban opaklık değerleri okunur. Makroskopik doku hasarı (örneğin çizikler, pigmentasyon, neovaskülerizasyon) veya opaklık> 7 opaklık birimi görülen kornealar atılır. Dengelenen korneaların tamamının ortalama opaklığı hesaplanır. Opaklık değerleri tüm korneaların ortalama değerine yakın olan en az üç kornea negatif (veya çözücü) kontrol korneaları olarak seçilir. Kalan kornealar tekrar işlem ve pozitif kontrol gruplarına dağıtılır.
    

23. 
    Suyun ısı kapasitesi havanınkinden daha yüksek olduğu için su inkübasyoniçin daha sabit sıcaklık koşulları sağlar. Bu yüzden kornea tutucusunun ve aksamının bakımında 32 ± 1 °C sıcaklıkta su banyosu önerilir. Ancak, sıcaklığı sabit tutmaya özen gösterilerek (örneğin, tutucuları ve maddeyi önceden ısıtarak) hava inkübatörleri kullanılabilir.
    

Test Materyalinin Uygulanması

24. 
    Biri sıvılar ve yüzey aktif maddeler (sıvı veya katı), diğeri yüzey aktif madde olmayan katı maddeler için olmak üzere iki farklı uygulama protokolü kullanılmaktadır.
    

25. 
    Sıvılar seyreltilmeden test edilmekte, yüzey aktif maddeler ise % 10ağırlık/hacim olarak % 0,9sodyum klorür çözeltisi, damıtık su veya test sisteminde olumsuz etki yapmayacağı kanıtlanmış diğer bir çözücüden oluşan çözeltide test edilmektedir. Yarı katılar, kremler ve cilalar sıvı olarak test edilmektedir. Farklı seyreltme çözeltileri kullanıldığında yeterli gerekçelerin sunulması gerekmektedir. Kornealar 10 dakika süreyle sıvılara ve yüzey aktif maddelere maruz bırakılırlar. Diğer maruz bırakma süreleri uygulanmışsa yeterli bilimsel gerekçe sunulması gerekmektedir.
    

26. 
    Yüzey aktif madde olmayan katı maddeler % 20 konsantrasyonla % 0,9 sodyum klorür çözeltisi, damıtık su veya test sisteminde olumsuz etki yapmayacağı kanıtlanmış diğer bir çözücüden oluşan çözeltide test edilmektedir. Bazı hallerde ve uygun bilimsel nedenlerin varlığında katılar kornea yüzeyine doğrudan tatbik etmek ve açık odacık yöntemi kullanılmak suretiyle (bkz.paragraf 29) yalın halde de test edilebilirler. Kornealar katı maddelere dört saat süresince maruz bırakılırlar. Sıvılar ve yüzey aktif maddelerde olduğu gibi diğer maruz bırakma süreleri uygulanmışsa yeterli bilimsel gerekçe sunulması gerekmektedir.
    

27. 
    Test materyalinin fiziksel yapısı ve kimyasal özelliklerine (örneğin katı maddeler, sıvılar, viskoz sıvılar ve viskoz olmayan sıvılar) bağlı olarak değişik uygulama yöntemleri kullanılabilir. Kritik faktör; test materyalinin epitel yüzeyini uygun biçimde kaplaması ve temizleme aşamasında doğru şekilde temizlenebilmesidir. Viskoz olmayan ve az viskoz olan sıvı test materyalleri için genellikle kapalı odacık yöntemi uygulanmaktadır. Yarı viskoz ve tam viskoz sıvı test materyalleri ile yalın katı maddeler için ise açık odacık yöntemi uygulanmaktadır.
    

28. 
    Kapalı odacık yönteminde korneanın epitel tarafını örtmeye yetecek test materyali (750 µl) odacığın üst yüzeyindeki dozaj delikleri kullanılarak arka odacığa verilir ve sonra, maruz kalma sırasında delikler odacık tıpalarıyla kapatılır. Her korneanın test materyaline uygun süre boyunca maruz bırakılması önemlidir.
    

29. 
    Açık odacık yönteminde ön odacığın pencere kapatma halkası ve cam penceresi işlemden önce çıkarılır. Kontrol veya test materyali (750 µlveya korneayı tamamen örtecek test materyali) mikro pipet yardımıyla epitel yüzeyine doğrudan uygulanır. Test materyalinin pipete yerleştirilmesi zor olduğu durumda test materyali dozaja yardımcı pozitif yer değiştirme pipetine basınçla doldurulabilir. Pozitif yer değiştirme pipetinin ucu şırınganın dağıtım ucuna yerleştirilerek yer değiştirme ucuna basınçla doldurulabilir. Aynı zamanda pipet pistonu yukarıya çekilirken şırınga pompası bastırılır. Pipet ucunda hava kabarcıkları belirirse test maddesi kaldırılır (boşaltılır) ve işlem uç hava kabarcığı olmadan doldurulana kadar tekrar edilir. Uygun test materyali hacminin ölçümüne ve kornea epitel yüzeyine daha kolay uygulamasına izin verdiği için gerekirse iğnesiz, normal bir şırınga kullanılabilir. Dozajın ardından cam pencere tekrar ön odacığa yerleştirilir ve kapalı sistem tekrar oluşturulur.
    

Maruz Kalma Sonrası İnkübasyon

30. 
    Maruz kalma süresinden sonra test maddesi, negatif kontrol veya pozitif kontrol maddesi ön odacıktan çıkarılır ve epitel en az üç defa ya da test maddesinden görünür eser kalmayıncaya kadar fenol kırmızılı EMEM ile yıkanır. Asidik veya alkali materyallerin yıkanmasında fenol kırmızısındaki renk değişimi yıkamanın etkinliğini izlemeyi olanaklı kıldığı için yıkama işleminde fenol kırmızısı içeren deney maddesi kullanılır. Fenol kırmızısında renk değişimi (sarı veya mor) gözlenmeye devam ediyorsa veya test maddesi halen görünür haldeyse kornealar üç defadan fazla yıkanır. Ortam test maddesinden tamamen temizlenmişse kornealar fenol kırmızısı içermeyen EMEM ile son kez bir daha yıkanır. EMEM (fenol kırmızısı içermeyen) opaklık ölçümü öncesinde fenol kırmızısının ön odacıktan temizlenmesinde yıkama maddesi olarak kullanılır. Ön odacık daha sonra fenol kırmızısı içermeyen yeni EMEM ile tekrar yıkanır.
    

31. 
    Sıvılar veya yüzey aktif maddelerde yıkama işleminin ardından kornealar 32 ± 1 °C sıcaklıkta iki saat boyunca inkübeedilir. Bazı koşullarda ve durumun gerektirdiği hallerde tatbik sonrası süre daha uzun tutulabilir. Katı maddeler tatbik edilen kornealar dört saatlik maruz kalma süresinin ardından iyice yıkanır ama inkübasyona ihtiyaç yoktur.
    

32. 
    Sıvılar veya yüzey aktif maddelerde tatbik sonrası inkübasyon süresinin, yüzey aktif madde olmayan katı maddelerde dört saatlik maruz kalma süresinin bitiminde her korneanın opaklığı ve geçirgenliği kaydedilir. Ayrıca her kornea görsel olarak incelenir ve ilgili bulgular kaydedilir (doku soyulması, kalan test maddesi, aynı olmayan opaklık yapıları gibi). Opaklık ölçme okumalarında farklılıklara yol açabilecekleri için bu gözlemler önemlidir.
    

Kontrol Maddeleri

33. 
    Her deneyde eşzamanlı negatif veya çözücü/taşıyıcı kontrolleri ve pozitif kontroller yer alacaktır.
    

34. 
    Sıvı bir maddenin % 100oranında test edilmesi durumunda eşzamanlı negatif kontrol (örneğin % 0,9 sodyum klorür çözeltisi veya damıtık su) BCOP test yöntemine test sisteminde görülen özgül olmayan değişimlerin tetkik edilebileceği ve deney sonuçları yönünden taban sağlayacak şekilde dâhil edilir. Ayrıca, deney koşullarının uygun olmayan tahriş edici tepkisine neden olmaması da sağlanmalıdır.
    

35. 
    Seyreltilmiş sıvının, yüzey aktif maddenin veya katı maddenin test edilmesi durumunda eşzamanlıçözücü/taşıyıcı kontrolü BCOP test yöntemine test sisteminde görülen özgül olmayan değişimlerin tetkik edilebileceği ve deney sonuçları yönünden temel hat sağlayacak şekilde dâhil edilir. Yalnızca test sisteminde olumsuz etki yaratmayacağı kanıtlanmış çözücü/taşıyıcı kullanılabilir.
    

36. 
    Uygun tepki oluştuğunu doğrulamak için her deneyde bilinen bir oküler tahriş edici eşzamanlı pozitif kontrol olarak kullanılır. BCOP deneyi bu test yönteminde aşındırıcı veya ciddi tahriş edicileri teşhis etmek için kullanıldığından, pozitif kontrolün ciddi tepkiye yol açan bir madde olması test yönteminde tercih edilir. Ancak, pozitif kontrol tepkisinde zamana göre farklılıkların değerlendirilebilmesi için tahriş edici tepkisi boyutlarının çok ciddi düzeyde olmaması gerekir.
    

37. 
    Sıvı test materyalleri için pozitif kontrol olarak örneğin % 1 sodyum hidroksit kullanılabilir. Katı test materyalleri için pozitif kontrol olarak ise % 0,9 sodyum klorür çözeltisi içinde % 20 (ağırlık/hacim) imidazol kullanılabilir.
    

38. 
    Belirli kimyasal veya ürün sınıfından olup bilinmeyen kimyasalların oküler tahriş edicilik potansiyelini veya belli bir tahriş edici tepki aralığındaki oküler tahriş edicilerin göreceli tahriş edicilik potansiyelini değerlendirirken referans maddelerin kullanılması yararlı olacaktır.