FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
Yüklə 5,29 Mb.
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.30 KRONİK TOKSİSİTE TESTİ YÖNTEM
- KAYNAKLAR Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.31. PRENATAL GELİŞİMSEL TOKSİSİTE ÇALIŞMASI YÖNTEM
VERİLER Veriler her bir test grubu için, testin başlangıcındaki hayvan sayısını, yara oluşmuş hayvan sayısını, yara tiplerini ve her yara tipine sahip hayvan yüzdesini gösterecek şekilde bir tablo halinde özetlenmelidir. Gözlenen tüm sonuçlar uygun bir istatiksel yöntemle değerlendirilmelidir. Bilinen herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılabilir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Maruz kalma düzeneğinin tarifi: tasarım, tip, boyutlar, hava kaynağı, parçacıklar ve aerosoller yaratan sistem, havalandırma yöntemi, dışarı atılan havanın muamele edilmesi ve bununla hayvanların test odacığında barındırılması için kullanılan yöntemi içerir.. Sıcaklık, nem ve uygun durumlarda aerosol konsantrasyonu veya parçacık büyüklüğünün kararlılığını ölçme techizatı tarif edilmelidir. Maruz kalma verileri: çizelge haline getirilmeli ve ortalama değerler ve değişkenlik ölçümü (ör. standart sapma) ve aşağıda belirtilenler dahil edilmelidir: (a) soluma cihazındaki hava akış hızları (b) havanın nemi ve sıcaklığı; (c) sayısal konsantrasyonlar (solunum cihazına verilen test maddesinin toplam miktarının, havanın hacmine bölümü) (ç) taşıyıcının yapısı, eğer kullanıldıysa; (d) test solunum bölgesindeki gerçek konsantrasyon (e) ortanca parçacık boyutu (uygun olduğunda),
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.30 KRONİK TOKSİSİTE TESTİ
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (A).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (B).
Yok.
Test maddesi, normal olarak çeşitli gruplardaki deney hayvanlarına, grup başına tek doz olacak şekilde haftanın yedi günü uygun bir yolla, yaşam sürelerinin önemli bir kısmında uygulanır. Test maddesine maruz kalma öncesinde ve sonrasında, deney hayvanları toksisite belirtilerine karşı günlük olarak gözlenirler.
Yok.
Hazırlıklar Hayvanlar testten beş gün öncesinden deneysel beslenme ve barınma koşulları altında tutulurlar. Testten önce sağlıklı ve genç hayvanlar rastgele kontrol ve uygulama gruplarına ayrılırlar. Test koşulları Deney hayvanları Tercih edilen tür sıçandır. Daha önceki çalışma sonuçlarına dayanılarak diğer türler (kemirgen veya kemirgen olmayan) kullanılabilir. Genç sağlıklı hayvanların yaygın olarak kullanılan laboratuvar suşları kullanılmalıdır ve dozun uygulanmasına, sütten kesildikten sonra mümkün olduğunca erken başlanmalıdır. Deneyin başında, hayvanlardaki ağırlık değişkenliği her iki cinsiyet için de, uygun ortalama değerin % 20’sini geçmemelidir. Subkronik (belli bir süre devam eden) bir oral toksisite çalışması uzun süreli bir çalışmanın ön çalışması olarak yürütülüyorsa, her iki çalışmada da aynı tür/cins ve ırktan hayvanlar kullanılmalıdır. Sayı ve cinsiyet Kemirgenlerde her bir doz ve eş zamanlı kontrol grubu için en az 40 hayvan (20 dişi ve 20 erkek) kullanılmalıdır. Dişilerin, hiç doğum yapmamış olmaları ve hamile olmamaları gerekir. Eğer aralarda da hayvanların feda edilmesi planlanıyorsa çalışma tamamlanmadan öldürülmesi planlanan hayvan sayısı artırılmalıdır. Kemirgen olmayan hayvanlarda ise, daha az sayıda fakat. her grup ve her cinsiyet başına en az dört hayvan kullanılması kabul edilmiştir. Doz seviyeleri ve maruz kalma sıklığı Eş zamanlı kontrol grubuna ilave olarak en az üç doz kullanılmalıdır. En yüksek doz çok fazla ölüme neden olmadan belirgin toksisite etkisi oluşturmalıdır. En düşük doz herhangi bir toksisite belirtisi oluşturmamalıdır. Ara doz(lar), yüksek ve düşük doz arasında belirlenmelidir. Doz seviyelerinin seçiminde, önceki toksisite testlerinden ve çalışmalarından elde edilen sonuçlar dikkate alınmalıdır. Maruz kalma sıklığı normal şartlarda günlüktür. Eğer kimyasal içme suyuyla veya besinle karıştırılarak veriliyorsa, bu sürekli olmalıdır. Kontroller Test maddesine maruz kalma dışında, uygulama gruplarına her hususta eşdeğer olan eş zamanlı bir kontrol grubu kullanılmalıdır. Aerosolleri (havada asılı sıvı damlacıklar bulunduran hava ortamı) kapsayan solunumla ilgili çalışmalar veya ağız yoluyla ilgili çalışmalarda tanımlanmamış bir biyolojik aktivite emülsiyonlaştırıcısı kullanılması gibi özel durumlarda, eş zamanlı negatif kontrol grubu ayrıca kullanılmalıdır. Negatif kontrol grubu test maddesine veya herhangi bir taşıyıcıya maruz kalmayan hayvanlar haricinde test gruplarıyla aynı şekilde muamele edilir. Uygulama yolu İki ana uygulama yolu ağız ve solunum’dur. Uygulama yolunun seçimi test maddesinin fiziksel ve kimyasal özelliklerine ve insandaki muhtemel maruz kalma yoluna bağlıdır. Deri yolunun kullanılması önemli pratik problemler oluşturur. Perkütan absorbsiyondan kaynaklanan kalıcı sistemik toksisite, normalde ağız yoluyla ilgili başka bir testin sonuçlarından ve daha önceki perkütan toksisite testlerinden elde edilen perkütan absorbsiyonun kapsamına dair bilgilerden çıkartılabilinir. Oral yolla ilgili çalışmalar Test maddesinin mide ve bağırsaklarda emildiği durumlarda ve yutma yolu insanların maruz kalabileceği yollardan biriyse, beklenmedik etkiler olmadığı sürece uygulamanın oral yolla yapılması tercih edilir. Hayvanlar test maddesini besinle, içme suyunda çözünmüş olarak veya kapsül şeklinde alabilirler. İdeal olarak haftada yedi gün, günlük olarak doz uygulaması yapılır çünkü haftada beş gün doz verilmesi, doz verilmeyen sürede toksisite etkilerin iyileşmesine ya da yok olmasına neden olabilir ve bundan dolayı sonuçları ve sonradan yapılan yorumları etkiler. Ancak, pratik düşüncelere dayanarak haftada beş gün doz uygulaması da kabul edilebilir. Solunumla ilgili çalışmalar Solunumla ilgili çalışmalar diğer uygulama yollarından daha karmaşık teknik problemler yarattığından, burada bu uygulama yoluyla ilgili detaylı bir yol gösterim sunulmuştur. Özel durumlarda soluk borusu için solunumun geçerli bir alternatif oluşturacağı not edilmelidir. Uzun süreli maruz kalmalar genellikle planlanmış insan maruz kalmaya göre şekillendirilir. Hayvanlara gerek günlük olarak odacığın dengeye ulaşmasından sonraki altı saat, haftanın beş günü (aralıklı maruz kalma) veya olası çevresel maruziyet ile ilgili olarak haftada yedi gün, günde 22-24 saat (sürekli maruz kalma), yaklaşık olarak bir saat hayvanları günlük olarak besledikten sonra benzer zamanlarda ve odacığın içinde muamele yapılır. Her iki durumda da hayvanlar genellikle test maddesinin sabit derişimlerine maruz kalırlar. Aralıklı ve sürekli maruz kalma arasındaki temel fark, ilkinde hayvanların günlük maruz kalmanın etkilerini iyileştirebilecekleri 17-18 saatlik, hatta hafta sonları için daha uzun bir süre olmasıdır. Aralıklı veya sürekli maruz kalma seçimi çalışmanın amaçlarına ve benzerinin uygulanacağı insan maruz kalımına bağlıdır. Ancak, belli teknik zorluklar göz önünde bulundurulmalıdır. Örneğin, çevresel şartların benzerliği için sürekli maruz kalımınavantajları maruz kalma sırasındaki beslenme ve su içme ihtiyacıyla, uygulanabilir daha karmaşık aerosol ve buhar ihtiyacıyla, izleme tekniklerinin üretilmesiyle dengelenebilir. Maruz kalma odacıkları Hayvanlar, yeterli oksijen içeriği ve eşit olarak dağılmış maruz kalma atmosferi temin etmek için saat başına en az 12 hava değişikliğinde dinamik hava akışı sağlamak amacıyla tasarlanmış soluma odacıklarıyla test edilmelidirler. Kontrol ve maruz kalma odacıklarının yapıları ve tasarımları, test maddesine maruz kalma dışındaki tüm hususlarda maruz kalma koşullarını karşılaştırılabilir kılmak için, eşdeğer olmalıdır. Test maddesinin etrafa kaçak yapmasını engellemek amacıyla, genellikle, odacığın içinde hafif bir negatif basınç sağlanır. Odacıklar, test hayvanlarının sıkışmasını en aza indirmelidir. Genel bir kural olarak, odacığın atmosferinin kararlılığını sağlamak amacıyla test hayvanlarının toplam ‘hacimleri’ test odacığının hacminin % 5’ini geçmemelidir. Ölçümler ve izleme aşağıdaki gibi olmalıdır: (i)Hava akışı: Hava akışının hızı odacık içinde tercihen sürekli izlenmelidir;. (ii)Derişim: Günlük maruz kalma süresi boyunca test maddesinin derişimi, ortalama değerin %±15’inden daha fazla değişkenlik göstermemelidir; (iii)Sıcaklık ve nem: kemirgenler söz konusuysa, test maddesini askıda bırakmak için su kullanılan durumlar haricinde test atmosferinde sıcaklık 22 ±2 °C ve nem oranı da % 30 ve %70 arasında olmalıdır. Tercihen her ikisi de sürekli izlenmelidir; (iv) Parçacık boyutu ölçümleri: parçacık boyutu dağılımı sıvı veya katı aerosol içeren bir odacık ortamında tayin edilmelidir. Aerosol partikülleri kullanılan deney hayvanlarının soluyabileceği büyüklükte olmalıdır. Oda atmosferinden alınan örnekler hayvanların soluk alma bölgesinde olmalıdır. Hava örneği, hayvanların maruz kaldığı parçacık dağılımını yansıtmalı ve gravimetrik temelde askıda kalan tüm aerosolleri, hatta solunabilir olmayanları bile açıklamalıdır. Parçacık boyutu analizleri, aerosolün kararlılığını sağlamak için ve sonrasında da maruz kalmalar sırasında gereken sıklıkta, hayvanların maruz kaldığı parçacık dağılımının tutarlılığını yeterli şekilde tayin etmek için çoğunlukla sistem üretiminin geliştirilmesi sırasında yürütülmelidir. Çalışmanın uzunluğu Uygulama süresinin uzunluğu en az 12 ay olmalıdır. İşlem Gözlemler Günde en az bir kez dikkatli bir klinik inceleme yapılmalıdır. Çalışmada ölen hayvan sayısını en aza indirmek için, örneğin, ölü bulunan hayvanlara nekropsi yapılması, zayıf ya da ölmek üzere olan hayvanların gözden çıkarılmaları, uygun hareket edilerek ilave gözlemler günlük olarak yapılabilir. Toksik etkilerin başlangıcının ve ilerlemesinin belirlenmesi yanında hastalık, otoliz ve birbirlerini yemeden kaynaklanan kayıpları azaltmak için dikkatli gözlemler yapılmalıdır. Ölüm, nörolojik ve gözle görülür değişiklikler yanında klinik belirtiler tüm hayvanlar için kaydedilmelidir. Şüpheli tümörler gibi toksik koşulların başlama ve ilerlemesi kaydedilmelidir. Vücut ağırlıkları tüm hayvanlar için testin ilk 13 haftası boyunca haftada bir defa ve sonrasında da her dört haftada en az bir kere ayrı ayrı kaydedilmelidir. Gıda alımı, çalışmanın ilk 13 haftasında haftalık olarak belirlenmelidir, daha sonra yaklaşık üç aylık aralıklarla sağlık durumu ve vücut ağırlığı durumu aksini gerektirmedikçe ayrı ayrı kaydedilmelidir. Hematolojik incelemeler Hematolojik inceleme (ör. Hemoglobin içeriği; hematokrit, toplam kırmızı kan hücresi, toplam beyaz kan hücresi, trombositler veya pıhtılaşma potansiyelinin diğer ölçümleri) üçüncü ayda, altıncı ayda ve sonrasında da yaklaşık altı aylık aralıklarla ve deney sonlandırılmadan önce yapılmalıdır. İncelemeler kemirgen olmayan hayvanlardan ve 10 sıçan/cinsiyet şeklinde tüm gruplardan alınan kan örneklerinde yapılır. Eğer mümkünse, örnekler aynı aralıkta aynı sıçanlardan alınmalıdır. İlaveten, kemirgen hayvanların haricindeki hayvanlardan ön test için de numune alınmalıdır. Eğer klinik gözlemler çalışma sırasında hayvanın sağlığında kötüye gidiş gösterirse, etkilenen hayvanların türevsel kan sayımları yapılmalıdır. Türevsel kan sayımı en yüksek doz grubundaki hayvanlarla ve kontrol hayvanlarından alınan örneklerde yapılır. Türevsel kan sayımı bir sonraki düşük doz grubu(grupları) için sadece en yüksek grup ve kontrol arasında çok büyük bir tutarsızlık varsa veya böyle bir durum patolojik bulgularla gösteriliyorsa yapılır. İdrar tahlili İdrar örnekleri tüm kemirgen olmayan hayvanlardan ve 10 sıçan/cinsiyet şeklinde tüm gruplardan, eğer mümkünse, hematolojik incelemede olduğu gibi aynı aralıktaki aynı sıçanlardan analiz için toplanmalıdır. Aşağıdaki incelemeler her bir hayvan için ayrı ayrı ya da kemirgenler için bir araya getirilen örnek/cinsiyet/gruplarda yapılır: -görüntü: her bir hayvan için ayrı ayrı hacim ve yoğunluk, -protein, glukoz, ketonlar, gizli kan (yarı-nicel olarak), -sediment mikroskobisi(yarı-nicel olarak),
Kapsamlı otopsi Çalışmadaki deney sırasında ölenler ve ölmek üzere olup öldürülenler de dahil bütün hayvanlara tam teşekküllü nekropsi yapılmalıdır. Hayvanlar gözden çıkarılmalarından önce türevsel kan sayımı için tüm hayvanlardan kan örnekleri toplanmalıdır. Bütün büyük görülebilen yaralar, tümörler veya tümör şüphesi olan yaralar muhafaza edilirler. Büyük ölçekteki gözlemlerle mikroskobik bulgular arasında korelasyon sağlanmasına çalışılmalıdır. Tüm organ ve dokular histopatolojik inceleme için muhafaza edilmelidirler. İncelenen doku ve organlar aşağıdaki gibidir: beyin 3 (omur/omurilikler, beyincik zarı, beyin zarı), hipofiz tiroit (paratiroit dahil), timus, akciğerler (soluk borusu dahil), kalp, aort, tükrük bezleri, karaciğer (3), dalak, böbrekler (3), böbrek üstü bezleri (3), özofagus, mide, oniki parmak bağırsağı, ince bağırsağın üst kısmı, kıvrım bağırsak, kör bağırsak, kalın bağırsak, rektum, mesane, idrar kesesi, lenf nodülleri, pankreas, yumurtalıklar (3), yardımcı cinsiyet organları, dişi meme bezleri, deri, kas sistemi, periferal, sinir, omurilik (servikal, göğüsler, lumbar), kemik iliği ve femurlu göğüs kemiği, (eklem dahil) ve gözler. Akciğerlerin şişirilmesi ve idrar kesesinin sabitleyiciyle muamele edilmesi bu dokuları muhafaza etmek için en iyi yoldur. Solunum çalışmalarında akciğerlerin şişirilmesi uygun histopatolojik inceleme için önemlidir. Solunum çalışmaları gibi özel çalışmalarda burun, yutak ve gırtlak dahil tüm soluk alıp verme yolu çalışılmalıdır. Diğer klinik incelemeler yapıldığı takdirde, bu işlemlerden elde edilecek bilgiler mikroskobik incelemelerden önce elde mevcut olmalıdır çünkü bu bilgiler patologlar için anlamlı bir yol gösterici olabilir. Histopatoloji Gözle görünür bütün değişiklikler özellikle tümörler ve herhangi bir organda oluşan diğer yaralar mikroskobik olarak incelenmelidir. İlaveten, aşağıdaki işlemler tavsiye edilir: (a)Bulunan bütün lezyonları tam olarak tanımlanmış, tüm korunmuş organ ve dokuların mikroskobik incelemeleri: 1. çalışma sırasında ölen ve öldürülen tüm hayvanlar; 2. tüm yüksek doz grubu ve kontroller; (b)Test maddesinden kaynaklanan veya kaynaklanma olasılığı olan organ ve dokularda sergilenen anomaliler de düşük doz gruplarında incelenir; (c)Sonuçlar, hayvanların normal yaşam sürelerinde önemli bir azalma veya toksik cevabı etkileyebilecek bir etki gösteriyorsa, bir sonraki düşük doz yukarıda anlatıldığı gibi incelenmelidir. (d)Kullanılan hayvan ırkında normal yaraların oluşma sıklığıyla ilgili bilgi, aynı laboratuvar koşulları altında, örneğin; geçmişe yönelik kontrol verileri, muamele edilen hayvanlardaki anlamlı değişiklikleri doğru değerlendirmek için vazgeçilmez öneme sahiptir.
Veriler her bir test grubu için, testin başlangıcındaki hayvan sayısını, yaralı hayvan sayısını ve her bir yara türüne ait hayvanların yüzdesini gösterecek şekilde bir tablo halinde özetlenmelidir. Gözlenen tüm sonuçlar uygun bir istatistiksel yöntemle değerlendirilmelidir. Bilinen herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılabilir.
Test raporu, aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Maruz kalma düzeneğinin tarifi: Tasarım, tip, boyutlar, hava kaynağı, parçacık ve aerosol üreten sistem, havalandırma yöntemi, dışarı atılan havanın muamele edilmesi ve bununla hayvanların test odacığında barındırılması için kullanılan yöntemi içerir. Sıcaklık, nem ve uygun durumlarda aerosol derişiminin veya parçacık büyüklüğünün kararlılığını ölçme teçhizatı tarif edilmedilir. Maruz kalma verileri: çizelge haline getirilmeli ve ortalama değerler ve değişkenlik ölçümü (örneğin; standart sapma) ve aşağıda belirtilenler dahil edilmelidir: (a) Soluma cihazındaki hava akış hızları (b) Havanın nemi ve sıcaklığı; (c) Sayısal derişimler (havanın hacmine bölünmüş solunum yapılan cihazdaki test besleme maddesinin toplam miktarı) (d) taşıyıcının yapısı, eğer kullanıldıysa; (e) solunum bölgesindeki gerçek konsantrasyon (f) medyan parçacık boyutu (uygun yerlerde),
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (D).
Bakınız Bölüm B Genel Giriş (E). B.31. PRENATAL GELİŞİMSEL TOKSİSİTE ÇALIŞMASI
Bu yöntem OECD TG 414 (2001)’e eşdeğerdir.
Gelişimsel toksisite test uygulama yöntemi, hamile test hayvanı ve rahimdegelişmekte olan organizma üzerindeki doğum öncesi etkilerine dair genel bilgi sağlamak için tasarlanmıştır; bunlar arasında ölüm gibi maternal etkilerin değerlendirilmesi, yapısal anomali veya fetüsün gelişimiyle ilgili değişiklikler içerebilir. Fonksiyonel bozukluklar, her ne kadar gelişimin önemli bir bölümüyse de, bu yöntemin bütününü oluşturmaz. Ayrı bir çalışmada test edilebilirler veya gelişimsel nörotoksisite için test yöntemleri kullanılarak bu çalışmaya ilave edilebilirler. Fonksiyonel bozukluklar ve diğer doğum sonrası etkilerle ilgili test uygulamaları hakkında bilgi edinmek için iki nesilli üremeye karşı toksisite çalışması olan test yöntemine ve gelişimsel nörotoksisite çalışmalarına başvurulması uygun olacaktır. Bu yöntem bireysel durumlarda test maddesinin örneğin fizikokimyasal ve toksikolojik özellikleriyle ilgili özel bilgilere dayanarak özel uyarlamalar gerektirebilir. Böyle uyarlamalar bilimsel kanıtların, uyarlamanın daha bilgilendirici bir test oluşturduğuna ikna ettiği durumlarda kabul edilebilirdir. Böyle bir durumda, bilimsel kanıt, çalışma raporunda dikkatli bir şekilde belgelendirilmelidir.
Gelişimsel toksikoloji: Gelişmekte olan organizmalardaki döllenmeden önce, doğum öncesi gelişim sırasındaki veya doğum sonrası gelişimden cinsel olgunluğa ulaşıncaya kadar olan maruz kalmalardan kaynaklanan olumsuz etkilerin çalışıldığı alan. Gelişimsel toksisitenin esas göstergeleri 1) organizmanın ölümü, 2) yapısal anomaliler, 3) büyüme değişiklikleri, ve 4) fonksiyonel yetersizlikleri içerir. Gelişimsel toksikoloji daha önceden sıklıkla teratoloji (oluşumundaki biçimsizlik ve anomalileri içeren bilim) olarak bilinen bir terimdir. Olumsuz etki: Organizmanın hayatta kalma, üreme ve çevreye uyum sağlama yeteneğini azaltan herhangi bir muameleye bağlı temelde meydana gelen değişiklik. Gelişimsel toksikoloji göz önünde bulundurularak, kapsamlı algılamada belirlenmiş, konseptüsün (fetüs) doğumdan önceki ve sonraki normal gelişimiyle etkileşen herhangi bir etkiyi içine alır. Büyüme değişiklikleri: dölün organ veya vücut ağırlığında veya büyüklüğünde meydana gelen değişikliklerdir. Değişiklikler (anomaliler): Şekil bozuklukları (malformasyon) ve değişikliklerini içine alan, gelişimdeki yapısal değişiklikler (28). Şekil bozukluğu (Malformasyon)/Büyük Anomali: Hayvanda zararlı (ayrıca öldürücü olabilir) olacağı düşünülen yapısal değişikliktir ve nadir görülür. Varyasyon/Küçük Anomali: Hayvanda zararlı etkisinin çok az olacağı veya olmayacağı düşünülen yapısal değişiklik, geçici olabilir ve göreceli olarak sıkça kontrol popülasyonlarında da görülebilir. Konseptüs (gebelik): Döllenmeden doğuma kadar olan gelişimin herhangi bir aşamasındaki döllenmiş yumurtanın ekstra-embriyonik zarlarla beraber embriyo veya fetüsü de içine alan oluşumlarının toplamı İmplantasyon (nidasyon (aşılanmış yumurtanın uterus mukozasına yerleşmesi) ): Blâstosistin (blastula safhasını izleyen gelişim devresindeki gebelik ürünü) uterusun epitelyal yüzeyine tutulması, rahim epitelyumuna nüfuz etmesi ve endometriyuma (Uterus'un mukozası) gömülmesidir. Embriyo: herhangi bir organizmanın erken veya gelişme safhası, özellikle döllenmiş bir yumurtanın uzun eksen oluşumundan tüm esas yapılar oluşuncaya kadar olan gelişme ürünü Embriyotoksisite: embriyonun normal yapısına, gelişimine, büyümesine ve/veya yaşayabilirliğine zararlı olan. Fetüs: post-embriyonik dönemdeki doğmamış döl. Fötotoksisite: fetüsün normal yapısına, gelişimine, büyümesine ve/vaya yaşayabilirliğine zararlı olan. Düşük: döllenme ürünlerinin, yani embriyo veya fetüsün, yaşayabilir duruma gelmeden uterusun dışına atılması Rezorpsiyon: Uterusta implantasyona uğrayan konseptus sonrasında ölür veya yeniden emilir. Erken rezorpsiyon: embriyo/fetüsün tanınabilir olmadığı aşamada implantasyon olduğunun kanıtı Geç rezorpsiyon: dış dejeneratif (bozunma) değişikliklerin görüldüğü ölü embriyo veya fetüs NOAEL:”Hiçbir olumsuz etkinin gözlemlenmediği seviye
Yok.
Normalde test maddesi hamile hayvanlara en azından implantasyondan itibaren planlanan öldürülmeden bir gün öncesine kadar uygulanır, uygulama doğumun normal gününe olabildiğince yakın olmalıdır ve erken doğumdan kaynaklanan veri kaybı riskine girilmemelidir. Test yöntemi sadece organojenez süresini örneğin kemirgenlerde 5-15 gün, tavşanda 6-18 gün) değil ayrıca, uygun olduğunda, tüm hamilelik süresi boyunca, sezeryandan bir gün öncesine kadar preimplantasyon etkileri de incelenir. Sezeryandan kısa bir süre öncesinde, dişiler öldürülür, rahim içerikleri incelenir ve fetüsler dışardan gözle görülebilir anomaliler ve yumuşak doku ve iskeletsel değişiklikler için incelenir.
Testin en uygun türlerde yapılması tavsiye edilir ve doğum öncesi gelişimsel toksisite testlerinde, yaygın olarak kullanılan laboratuvar türleri ve suşları kullanılır. Tercih edilen kemirgen türü sıçan, kemirgen olmayan tür ise tavşandır. Başka bir tür kullanılacağında gerekçe sunulmalıdır.
Deney hayvanları oda sıcaklığı sıçanlar için 22°C (± 3°C), tavşanlar için 18 ºC (± 3º) olmalıdır. Ayrıca, bağıl nem oranı, odanın temizlenmesi sırası dışında, en az %30 olmalı ve tercihen %70’i geçmemelidir. En uygun bağıl nem oranı %50-60’dır. Yapay ışık sistemi kullanılmalı, 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık şeklinde olmalıdır. Beslenme için, geleneksel laboratuvar yiyecekleri sınırsız içme suyu sağlanmasıyla kullanılabilir. Çiftleşme işlemleri amaca uygun kafeslerde yapılmalıdır. Çiftleştirilen hayvanların ayrı ayrı barındırılması tercih edilirken, küçük gruplar halinde barınmaları da uygun olabilir.
5 gün öncesinden laboratuvar koşullarına alıştırılan ve daha önce deneysel işlemlere maruz kalmamış olan sağlıklı hayvanlar kullanılmalıdır. Test hayvanları, tür, ırk, kaynak, cinsiyet, ağırlık ve/veya yaşa göre karakterize edilmelidir. Tüm test gruplarındaki hayvanlar olabildiğince tek bir ağırlık ve yaşta olmalıdır. Her doz için genç erişkin nulipar (doğum yapmamış) dişiler kullanılmalıdır. Dişiler aynı ırk ve türün erkekleriyle çiftleştirilmeli ve kardeşlerin çiftleştirilmesinden kaçınılmalıdır. Eğer bu teknik kullanılırsa, sıçanlar için hamileliğin sıfırıncı günü, vajinal plug veya spermin gözlendiği gün; tavşanlar içinse genellikle cinsel ilişki veya suni döllenme günüdür. Kafesler yerleştirilmelerinden kaynaklanan etkileri en aza indirecek şekilde düzenlenmelidirler. Her bir hayvan tek bir kimlik numarasına sahip olmalıdır. Çiftleştirilen dişiler tarafsız şekilde kontrol ve muamele gruplarına ayrılırlar ve eğer dişiler yığın halinde çiftleştirilirse, her bir yığındaki hayvanlar karşısında eşit olarak dağıtılmalıdır. Benzer olarak, aynı erkekle suni olarak döllenen dişiler de grupta eşit olarak dağıtılmalıdır.
Otopside, her bir test ve kontrol grubu, implantasyon yerine sahip yaklaşık 20 dişiyle sonuçlanacak yeterli sayıda dişi içermelidir. İmplantasyon yeri olan 16 hayvandan daha az sayıda hayvan içeren gruplar uygun olmayabilir. Maternal ölüm % 10’u geçmediği sürece çalışmanın geçersiz kılınmasına neden olmaz.
Eğer doz uygulamasını kolaylaştırmak için bir taşıyıcı veya diğer katkılar kullanılıyorsa, test maddesinin absorbsiyon (emilim), dağılım, metabolizma ve alıkonulması veya atılımı üzerindeki etkiler, maddenin toksik özelliğini değiştirebilecek olan kimyasal özellikleri ve gıda ve su tüketimiyle ilgili veya hayvanın beslenme durumu üzerine etkiler gibi adı geçen karakteristiklerine önem verilmelidir. Taşıyıcının ne gelişim ne de üreme üzerine toksik etkileri olmamalıdır.
Normalde test maddesi implantasyondan (örneğin çiftleşmeden sonraki 5. gün) sezeryan gerçekleştirilmesi planlanan günün bir gün öncesine kadar günlük olarak uygulanmalıdır. Eğer ön çalışmalar, preimplamantasyon kaybı için yüksek potansiyele işaret etmiyorsa muamele çiftleşmeden başlayarak planlanan öldürmeden bir gün öncesine kadar hamilelik sürecinin tamamını içine alacak şekilde uzatılabilir. Hamilelik sırasındaki uygun olmayan elleçleme veya stres düşükle sonuçlanabilir. Muameleyle ilgili olmayan düşüklerin önüne geçmek için, hamile hayvanların gereksiz elleçleme, gürültü gibi dış faktörlere bağlı stresten kaçınılmalıdır. En az üç doz ve eş zamanlı kontrol kullanılmalıdır. Sağlıklı hayvanlar tarafsız şekilde kontrol ve muamele grubu olarak ayrılmalıdır. Doz seviyeleri giderek artan toksik etkiler oluşturacak şekilde seçilmelidir. Test maddesinin fiziksel/kimyasal doğası veya biyolojik etkileriyle sınırlanmadıkçaen yüksek doz gelişimsel ve/veya maternal toksisiteyesebep olmalı (klinik belirtiler veya vücut ağırlığında azalma) fakat ölüme veya ciddi rahatsızlıkları yol açmamalıdır.. En az bir ara doz gözlenebilir en düşük toksik etki meydana getirmelidir. En düşük doz maternal veya gelişimsel toksisite belirtisi meydana getirmemelidir. Doz seviyelerinin azalan dizisi dozaja bağlı cevap ve hiç olumsuz etkinin görülmediği en düşük düzeyi (NOAEL) gösterecek şekilde seçilmelidir. İki –dört kat aralıklar azalan doz seviyeleri için genelde uygundur ve dördüncü bir test grubunun ilave edilmesi doz grupları arasında geniş aralıklar kullanılmasına (örneğin 10 kattan daha fazla) genellikle tercih edilir. Her ne kadar amaç maternal NOAEL oluşturmaksa da, böyle bir düzeyi oluşturmayan çalışmalar da kabul edilebilir (1). Doz seviyeleri mevcut toksisite verilerinin yanında test maddesinin veya ilgili materyallerin metabolizması veya toksikokinetiğiyle ilgili ilave bilgiler de dikkate alınarak seçilmelidir. Bu bilgi doz kürünün yeterliliğinin gösterilmesine yardımcı olacaktır. Eş zamanlı bir kontrol grubu kullanılmalıdır. Bu grup suni muamele edilmiş bir kontrol grubu olmalı veya test maddesi uygulanırken taşıyıcı kullanılmışsa taşıyıcı-kontrol grubu olmalıdır. Bütün gruplara test maddesi de taşıyıcı da eşit hacimde uygulanmalıdır. Kontrol grubundaki/gruplarındaki hayvan(lar) test grubundakilerle eşit şekilde elleçlenmelidir. Taşıyıcı kontrol grupları taşıyıcıyı kullanılan en yüksek miktarda almalılardır (en düşük muamele grubunda olduğu gibi).
Eğer bir test tek bir doz için, en az 1000 mg/kg vücut ağırlığı/gün’e eşdeğer doz, bu çalışma için tanımlanan işlemler kullanılarak oral (ağız yoluyla) yolla uygulandığında, gerek hamile hayvanda gerek sonraki kuşaklarda hiçbir olumsuz etkinin gözlenmediği durum meydana getiriyorsa ve eğer yapısal ve/veya metabolik olarak benzer maddelerle ilgili verilere dayanılarak toksisite beklenmiyorsa, o zaman üç doz kullanılarak yürütülen tam bir çalışmanın yapılmasına gerek duyulmayabilir. Beklenen insan maruz kalımı sınır testinde daha yüksek oral doz seviyelerinin kullanılması gerektiğine işaret edebilir. İnhalasyon (solunum) ve dermal (deriye ait) uygulama gibi diğer uygulama yolları için, test maddesinin fiziko-kimyasal özellikleri sıklıkla maruz kalmanın en yüksek ulaşılabilir seviyesini işaret eder ve onu sınırlar (örneğin, dermal uygulama ciddi lokal (bölgesel) toksisiteye neden olmamalıdır).
Test maddesi veya taşıyıcı genellikle intübasyonla (boğaza tüp salma) oral olarak uygulanır. Eğer başka bir uygulama yolu kullanılırsa, testi yapan bu uygulama yolu için bir neden belirtmelidir ve bunun yanısıra uygun modifikasyonlar gerekli olabilir (2)(3)(4). Test maddesi her gün yaklaşık aynı zamanda uygulanmalıdır. Hayvanlara ayrı ayrı verilen dozlar normalde hayvanların ayrı ayrı yakın zamanlı vücut ağırlığı ölçümlerine dayanır. Ancak, hamileliğin son üç ayında doz ayarlanırken dikkat edilmelidir. Mevcut veriler daha fazla maternal toksisiteyi engellemek adına doz belirlenmesinde kullanılmalıdır. Ne var ki, eğer muamele edilen dişilerde daha fazla toksisite not edilirse, bu hayvanların insanca öldürülmeleri gerekir. Eğer bazı hamile hayvanlar daha fazla toksisite belirtisi gösterirse o doz grubuna son verilmesi düşünülmelidir. Madde sonda ile besleme yoluyla uygulandığında, tercihen tek doz olarak gavaj yöntemi veya uygun bir boğaza salınan sonda kullanılarak verilir. Tek seferde uygulanabiliecek sıvı hacmi test hayvanının büyüklüğüne bağlıdır. 2 ml/100 g vücut ağırlığı kullanılan sulu çözeltiler dışında, hacim 1 ml/100 g vücut ağırlığını geçmemelidir. Taşıyıcı olarak mısır yağı kullanılan durumlarda hacim 0.4 ml/100 g vücut ağırlığını geçmemelidir. Test hacmindeki değişkenlikler konsantrasyonun tüm doz seviyelerinde sabit olacak şekilde ayarlanmasıyla en aza indirilmelidir.
Klinik gözlemler yapılmalı ve tercihen günün aynı zamanlarında doz uygulandıktan sonraki olumsuz etkilerin tepe süresi de dikkate alınarak günde en az bir defa kaydedilmelidir. Hayvanların koşulları ölüm, ölmek üzere olma, uygun davranışsal değişiklikler ve toksisitenin açık olan tüm belirtileri de dahil kaydedilmelidir.
Zamanla birbirine alıştırılmış hayvanların dışardan bir üreticiden sağlandığı durumlarda, hayvanlar hamileliğin 0 ıncı gününde veya 3 günü geçmeden, doz uygulamasının ilk gününde, doz uygulama süresi boyunca en az her 3 günde ve öldürülmesi planlanan günde tartılmalıdır. Gıda tüketimi üç günlük aralıklarla kaydedilmelidir ve vücut ağırlığı belirlemelerinin yapıldığı günlerle çakışmalıdır.
Dişiler beklenen doğumdan bir gün önce öldürülmeli. Planlanan öldürme gününden önce düşük veya premature (erken doğum) doğum belirtileri gösteren dişiler öldürülmeli ve makroskobik incelemeye tabi tutulmalıdır. Çalışmanın sonunda veya çalışma süresince ölüm anında dişi yapısal anomaliler ve patolojik değişiklikler için makroskobik incelemeye tabi tutulmalıdır. Dişilerin sezeryan sırasındaki değerlendirmesi ve sonraki fetal analizler tercihen önyargıyı en aza indirmek için muamele grubu hakkında bilgi edinmeden yürütülmelidir.
Deney sonlandırıldıktan veya ölümden hemen sonra dölyatağı alınmalı ve hayvanların hamilelik durumu saptanmalıdır. Gebelik görünmeyen dölyatağının hamileliğin olmadığının doğrulanması için tekrar incelenmelidir (5). (örneğin kemirgenler için amonyum sülfit boyama ve tavşanlar için Salewski boyama veya uygun bir alternatif yöntem) Gebe rahim serviksle birlikte tartılmalıdır. Gebe rahmin ağırlıkları çalışma sırasında ölü bulunan hayvanlardan alınmamalıdır. Corpora lutea sayısı hamile hayvanlar için hesaplanmalıdır. Rahim içeriği embriyonik veya fetal ölümler ve yaşayabilir fetüsler için incelenmelidir. Resorpsiyon derecesi, konseptusun bağıl ölüm zamanını tahmin etmek için tanımlanmalıdır (bakınız kısım 1.2).
Her bir fetüsün cinsiyet ve vücut ağırlığı belirlenmelidir. Her bir fetüs dış değişiklikler için incelenmelidir (6). Fetüsler iskeletsel ve yumuşak doku değişiklikleri için incelenmelidir (örneğin varyasyonlar ve şekil bozuklukları veya anomaliler) (7) (8) (9) (10) (11) (12 ) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Fetal değişikliklerin sınıflandırılması tercih edilebilir fakat gerekli değildir. Sınıflandırma yapılırken, her sınıfın tanımlanma ölçütleri açıkça belirtilmelidir. Gelişimsel değişikliklerin belirtilerinin izlenmesi için üreme sistemine özel önem verilmelidir. Kemirgenler için, doğumdan elde edilen yavruların yaklaşık yarısı hazırlanmalı ve iskeletle ilgili değişiklikler için incelenmelidir. Kalan kısım ise yumuşak doku değişiklikleri için hazırlanmalı ve kabul edilmiş veya uygun seri bölme yöntemleri veya dikkatli kaba disseksiyon (bir organı incelemek için parçalara ayırma) teknikleri kullanılarak incelenmelidir. Tavşan gibi kemirgen olmayan hayvanlar için tüm fetüsler hem yumuşak doku hem de iskeletle ilgili değişiklikler için incelenmelidir. Fetüslerin gövdeleri yumuşak doku değişiklikleri ve iskeletle ilgili değişiklikler için dikkatlice kesilip çıkarılarak değerlendirilirler, sonrasında iç kardiyak (kalple ilgili) yapı için ilave işlem gerekebilir (25). Bu durumda yarım fetüslerin kafaları alınmalı ve standart seri bölme yöntemleri (26) veya eşdeğer duyarlı yöntemler kullanılarak yumuşak doku değişim analizleri için incelenirler (gözler, beyin, burun bölgeleri ve dil dahildir). Fetüs gövdeleri ve kalan bozulmuş fetüsler işlenmeli ve iskelet değişiklikleri için kemirgenler için tanımlanan aynı yöntemler kullanılarak incelenmelidir.
|