Lékařská fakulta, Masarykova Univerzita

Diskuse: Technika RFA asistované resekce začíná být široce využívána nejen v jaterní chirurgii (Smith GL 2007, Kala 2007) . Lze využít jak monopolární režim, tak bipolární režim, dnes s využitím firemního nástroje speciálně pro ošetření resekční linie Habib Sealer 4X. Na naší klinice jsme byli jedni z prvních na světě, kdo publikoval zkušenosti s jaterní resekcí usnadněnou RFA. (Kala-Kysela 2003, Kala-Válek 2003) Zkušenosti publikované z jiných světových pracovišť přicházejí prakticky ve stejné době (Zacharoulis 2003, Weber 2002). Již od počátku byla diskutována radikalita této metody a především efekt na systémovou zánětlivou reakci. Publikace ohledně efektu na produkci cytokinů vycházející ze sledování po RFA bez resekce nádoru nezjistily signifikantní elevaci zánětlivých markerů (Schell 2002), nemluvě o tom, že nebyla zatím prokázána klinicky významná zánětlivá reakce organismu na RFA asistovanou resekci. V našem souboru jsme nezaznamenali klinicky významný statisticky signifikantní rozdíl v pooperačním průběhu pacientů resekovaných „klasicky“ a resekovaných metodou RFA. Byly však zaznamenány rozdíly v laboratorních parametrech, které dosahovaly maxima mezi 1.-3. pooperačním dnem a do 5. den od operace se oba soubory prakticky srovnaly. Vliv na jaterní funkce – měřeno hladinou bilirubinu a koagulačních parametrů, byl větší u pacientů resekovaných RFA, nebyl však klinicky významný. Nedošlo ani k prodloužení pobytu v nemocnici, ani k vyššímu výskytu krvácivých komplikací. Zdá se tak, že trauma jater je při tomto způsobu resekce větší. Narozdíl od klasické techniky, kde se liší trauma jater podle velikosti resekce, nebylo toto zaznamenáno u RFA techniky. Vliv na poškození samotného jaterního parenchymu měřený hladinou parenchymatosních enzymů – ALT a AST byl také větší u RFA resekcí. Opět nebyl klinicky významný a do 5. dne od operace tento rozdíl vymizel. Ve skupině RFA byla dosahována vyšší hladina těchto enzymů v pooperačním období a docházelo k pomalejší normalizaci o 1-2 dny. Lze si to vysvětlit ponechaným lemem RF ablací ošetřené jaterní tkáně, zatímco u klasické resekce je tento lem poškozené tkáně jen minimální. Na rozdíl o klasické techniky, je větší šance na postižní výživy ponechaných segmentů.

Někdy je jako hlavní přednost resekce pomocí RFA uváděna nižší krevní ztráta. Přestože jsme zaznamenali určitou tendenci k nižším krevním ztrátám u resekcí pomocí Habib 4X, tyto byly zcela klinicky bezvýznamné, neboť nevedly k redukci nutnosti krevních převodů. Statisticky (nikoliv však klinicky) signifikantní byly tyto ztráty pouze u malých resekcí včetně segmentektomií II, III, VI a VIII. Velmi zajímavé je, že i literatura hodnotící pozitivní efekt RF asistované jaterní resekce na krevní ztráty nesrovnává nikdy dva srovnatelné soubory – jeden s konvenční disekcí jaterního parenchymu a jeden pomocí RF proudu, a to i na vlastním pracovišti prof. Habiba, kde byl vytvořen specifický nástroj pro RF asistované resekce jater (Bachellier 2007, Ayav 2007). Ve skupině resekované klasicky jsme trvali na nízkém CVT, k čemuž bylo využito hypovolemické hemodiluce a případně podpory diurézy diuretiky. Vrácená krev po skončení resekce takto mohla relativně zvednout hodnoty aktuálního hemoglobinu proti skupině resekované pomocí Habib 4X. To by také mohlo vysvětlit (statisticky i klinicky zcela nevýznamné) lehce nižší pooperační Hb u RF asistence, zvláště u velkých resekcí, kde hlavními zdroji krevních ztrát nebývá obvykle difuzní krvácení z ranné plochy ale drobná chirurgická nehoda s poraněním větví jaterních žil.

Zkrácení operačního času je nevýznamné, i když může činit až 20 minut – je dáno především tím, že u RFA resekce není nutno tolik uvolňovat játra a preparovat struktury hilu, spíše než zrychlením disekce jaterního parenchymu.

Vývoj CRP vpodstatě odpovídá základním charakteristikám CRP jako proteinu akutní fáze se signifikantní elevací od 6 hodin po inzultu a s maximem 48 hodin od inzultu. Jeho poločas v plasmě je konstantní prakticky za každých podmínek včetně jaterní nebo renální insuficience a činí 19 hodin. Hladina CRP se nelišila statisticky signifikantně mezi oběmi skupinami až do 3. dne (p  0,05), kdy nabyla lehké statistické významnosti ve prospěch RFA resekce (p  0,05). Vysvětlení není jednoduché. Buď mohou být játra při klasické resekci vzhledem k delší době operace a větší manipulaci a většímu uvolnění více traumatizována, nebo jde jen o větší funkční kapacitu jater po klasické resekci k produkci CRP. Může docházet k větší traumatizaci hepatocytů v oblasti resekční linie, které může být větší u klasické resekce, zatímco u RFA resekce je hepatocyt v oblasti resekční linie buď koagulován, nebo je traumatizován jen minimálně. Vzhledem k tomu, že CRP je syntetizován prakticky pouze hepatocyty, může mít na jeho hladiny vliv jak Pringleho manévr, tak i přímé trauma jater, případně reperfuze. Fibrinogen jako další protein akutní fáze byl lehce více elevován u RFA resekce (1. pooperační den p  0,05), jinak se mezi jednotlivými typy disekce vůbec nelišil, a není proto ani zahrnut do tabulek výše. Tento jev může být vysvětlen spíše než větší systémovou zánětlivou reakcí větší konsumpcí fibrinogenu po klasických resekcích v oblasti resekční linie. Otázkou zůstává protichůdné chování INR a aPTT, kde jsou sice rozdíly již od prvního dne signifikantní, ale každý parametr je zhoršen u jiného typu jaterní disekce. Samozřejmě může být tento výsledek způsoben chybou malých čísel.

Obecně lze říci, že způsob disekce jaterního parenchymu je jen podružným stimulem pro rozvoj systémové zánětlivé reakce v porovnání s ostatními – jako celková anestezie, hladovění, laparotomie, obecně zákrok na játrech. Souhra faktorů spolupodílejících se na reakci organismu na stres a poranění je tak složitá a funkce jednotlivých faktorů tak různorodé, že usuzovat na tíži vyvolávající příčiny podle jejich sérových hladin je nejspíše zcela nesmyslné. Co má význam, je klinická odpověď, která se u obou skupina nelišila ani v pooperačním průběhu a délce hospitalizace, tak v délce přežití nebo vzniku lokálních recidiv.

V poslední době se také vede diskuze ohledně zvýšené incidence recidiv v oblasti resekční linie. V našem souboru jsme nenalezli rozdíl v počtu lokálních recidiv ani v přežití. Myslím si, že v jiných pracích je vyšší výskyt recidiv způsoben především nedodržením resekční linie 5-10mm. Děje se tak částečně díky spoléhání se na dostatečný efekt RFA v ponechané tkáni, částečně díky zhoršené anatomické kontrole v oblasti nádoru a možnému mechanickému rozsevu nádorových buněk do oblasti resekční linie samotnými elektrodami při tangenciálním poranění hranice nádoru. Pokud nelze dosáhnout radikality a no touch přístupu pomocí nástroje 4X, je nutné postupovat klasicky. Pokud ani to nejde, může mít snad pacient užitek z neradikálního ošetření pomocí Habib 4X nože, ale standardní RFA bude vždy účinnější. V resekční linii pak dochází vlivem reparace k významné humorální stimulaci růstu a angiogeneze. Největší publikované soubory pacientů (Navarra 2005) se zhodnocením krátkodobých i dlouhodobých výsledků také neprokazují vyšší rekurence v resekční linii. V našem souboru není rozdíl v křivkách disease free intervalu mezi oběmi skupinami. Metoda je jistě kompromitována zdáním snadnosti. Infekční komplikace relativně často popisované na pracovištích s menšími zkušenostmi jistě vyplývají z technické chyby při operaci. Mohl být ponechán větší okrsek jater zbavený výživy. Tento okrsek je nutné vždy buď doresekovat, nebo důkladně ošetřit RFA. V každém případě umožňuje metoda jaterní resekci bez předchozí preparace cévních struktur. Toto považujeme za hlavní důvod lehce zkrácené doby operace oproti klasickému postupu. Doba samotné disekce jaterního parenchymu se však neliší. Při nedostatečné anatomické orientaci může docházet snadněji k nehodám. Metoda je velmi vhodná pro rozšíření především laparoskopicky asistovaných periferních resekcí jater. V centrálních segmentech je však nutností laparoskopický peroperační UZ.

Možnosti využití Habib 4X nebo obecně RFA v jaterní chirurgii jsou však daleko širší. Sami jsme několikrát vyzkoušeli efektivitu Habib 4X při ošetření poranění jater, kdy kombinace Pringleho manévru s manuální kompresí v oblasti trhliny a aplikace RF proudu asi 0,5cm od hranice trhliny vede spolehlivě ke stavění krvácení a metoda se zdá v tomto případě zhmožděných a přetrhaných okrajů cév a žlučovodů daleko účinnější než cílené opichy, kompresivní stehy a rychlejší než resekce. Je tedy zřejmé, že při dodržení všech zásad techniky resekce lze tuto metodu doporučit k širokému použití v chirurgii jater. Na základě našich zkušeností lze doporučit následující způsob použití.
Zásady techniky resekce pomocí Habib 4X :

1. 
   Využití výkonů kolem 80W má nejlepší výsledky. V oblasti s velkou cévou nebo těsném okolí tumoru je vhodné snížit energie k 60W – zvětší se ošetřený bezpečnostní lem kolem nádoru a zlepší se koagulační schopnost na velké cévy
   
2. 
   Pokud možno nezačít přerušovat jaterní parenchym před kompletním ošetřením resekční linie RF proudem.
   
3. 
   Pokud máme peroperační ultrazvuk, je vhodné po vymezení resekční linie na povrchu jater cíleně Habibovým nožem uzavřít velké cévní kmeny jdoucí do resekovaného úseku jater. Předejde se jejich často komplikované preparaci s rizikem poranění a ztrát, a předejde se drobnému krvácení při přerušování parenchymu z odstraňované oblasti živené těmito cévami, než dojde k jejich úplnému uzávěru během resekce.
   
4. 
   Při přerušování větší tloušťky tkáně nejprve ošetřit povrchovou asi 2-3cm vrstvu, teprve následně zasunout nástroj hlouběji a ošetřit hlubokou vrstvu. Předejde se ztrátám energie do okolí a nedostatečné koagulaci tkáně.
   
5. 
   V případě krvácení ze vpichů při ošetřování resekční linie, případně z resekční linie jsou tyto možnosti:
   
   1. 
      komprese jaterního parenchymu – postačující a účinná v případě krvácení žilního, navíc se kompresí dotknou stěny cév a dojde lépe k jejich zatavení.
      
   2. 
      snížit výkon RF proudu a opakovaně aplikovat v oblasti, která krvácí, s lehce změněnou polohou, případně i centrálněji. Krvácející céva může být zachycena pouze tangenciálně.
      
   3. 
      Pringleho manévr. Dočasný Pringleho manévr lze použít i k usnadnění cílené koagulace větších kmenů pod UZ kontrolou.
      
6. 
   Lze použít s velkou opatrností i v případě centrálněji uložených nádorů, nebo centrální resekce, pak s těmito omezeními:
   
   1. 
      kompletně RF asistovaná resekce – nepreparujeme cévy, výhodná je UZ kontrola polohy vůči důležitým strukturám, je nutná dobrá anatomická orientace. Onkologická radikalita není dosažena samotnou resekcí – resekční linie může jit po hraně tumoru, onkologická radikalita spoléhá na efekt RFA na okraje nádoru, který je ovšem sporný, zvláště v oblasti velkých cév, kde dochází k významnému ochlazování protékající krví.
      
   2. 
      přerušení většiny parenchymu bez nutnosti Pringleho manévru pomocí Habib 4X k zabránění drobných kapilárních ztrát se standardní preparací velkých struktur s jejich případnou standardní resekcí a rekonstrukcí. Tomuto postupu dáváme přednost.
      
7. 
   V případě jednoznačné změny barvy části ponechaného jaterního parenchymu po resekci je nutno tento úsek také odstranit k zamezení vzniku hnisavých komplikací (tento úsek nejspíše přišel naším počínáním o výživu a má vysokou šanci, že podlehne nekróze se vznikem abscesu).
   
8. 
   Zásadně nelze doporučit k zajištění radikality výkonu radiofrekvenční ablaci ponechaných ložisek nebo části nádoru zařízením Habib 4X. V bipolárním módu dochází jen k velmi malé zóně koagulované tkáně v okolí a ošetřena je prakticky jen část v místě mezi elektrodami!!!
   
9. 
   Zásadně se vyhýbáme proniknutí elektrod do nádoru. Může dojít k rozsevu nádorových buněk z pláště nádoru (většinou právě tato část je zodpovědná za růst nádoru) do parenchymu mimo oblast resekce!!!
   

*VIII. Význam Kombinace Chirurgického Zákroku a Ablačních Metod
Úvod: Z předchozích kapitol je zřejmé, že každá z metod má svá určitá omezení. Jedině chirurgická resekce odstraní jak kmenové buňky, tak ostatní nádorové buňky, nicméně není schopna zaručit totální odstranění všech nádorových buněk z organismu, protože je nedokážeme zatím ani detekovat. Chirurgický zákrok sám osobě, zvláště delší než 2 hodiny, případě spojený s podchlazením pacienta, působí významnou imunodepresi. Následné reparační pochody v resekovaných játrech mohou stimulovat růst zatím inaparentních metastatických ložisek. Po RFA nebyla prokázána žádná významná systémová zánětlivá odpověď organismu a nedochází k takové imunodepresi. Naopak chirurgická resekce je schopna většinou zajistit větší bezpečnostní lem než RFA. Přestože mikroskopická hranice metastázy prakticky nikdy nepřesahuje více než 5mm za makroskopickou hranici, mikrosatelitní ložiska lze nalézt až 4cm od hranice nádoru. Ošetření mikrosatelitů je pro RFA zcela nemožné, zatímco při větších resekcích jsou tyto mikrosatelity spolehlivě odstraněny (alespoň v odstraňovaném parenchymu). Pravděpodobnost mikrosatelitního postižení významně narůstá s počtem a velikosti makroskopických metastáz. Při počtu metastáz 3 a velikosti nad 5cm se již stává klinicky významnou, o čemž svědčí i výsledky chirurgické resekce u pacientů s méně než 3 metastázami do 5cm velikosti a u pacientů nesplňujících tyto parametry (Nordlinger 1996, www.livermetsurvey.com). Chemoterapie působí spíše stochasticky, na každou subpopulaci nádoru jinak, nicméně podle výše popsaných výsledků se zdá, že dokáže účinně působit i na nedetekovatelné buňky v organismu, které se mohou nacházet kdekoliv. Jmenovitě v případě HAI i v jaterním parenchymu ponechaném po resekci. Vyvstává tedy otázka zda a jak jednotlivé metody kombinovat k dosažení ideálních výsledků. Bylo prokázáno, že profit pacientů z rizikové chirurgické resekce je významně menší v případě přítomnosti některých faktorů, jejichž výčet a vliv na přežití viz Dodatek 7 (Fong 1999, Nordlinger 1996, Minagawa 2007). Při současných výsledcích chemoterapie, kdy je dosahováno 5-leté přežití v kombinaci lokoregionální a systémové terapie téměř srovnatelné s chirurgickou resekcí, a podobných výsledků lze dosáhnout v případě použití lokálních ablačních technik, se nastoluje otázka zda a které pacienty vystavovat zatěžující chirurgické resekci, zvláště v případě, kdy je nutno chirurgickou resekci stejně kombinovat s některou z adjuvantních metod.

Konkrétně neoadjuvantní chemoterapie před jaterní resekcí ano nebo ne? Jen systémová nebo i lokoregionální? Nebo pouze u pacientů nesplňujících dobrá prognostická kritéria resekce? Má smysl kombinovat účinnější metodu chirurgické resekce s méně účinnou jako třeba RFA nebo chemoembolizace, nebo je lepší v těchto případech od operace úplně ustoupit?

Až na některé specfické případy je účinnost všech lokálně ablačníh technik plně srovnatelná. Jako reprezetant těchto metod byla zvolena RFA, se kterou máme ve FN Brno dlouhodobé zkušenosti. Následující rozbor výsledků se pokusí dát odpověď alespoň na některé kladené otázky.
Materiál a Metodika:

V letech 2000-2007 bylo do prospektivní, nerandomizované, nicméně statisticky párované studie zařazeno 132 pacientů s metastatickým onemocněním jater kolorektálním karcinomem. Pacienti byli stratifikováni do následujících skupin tak, aby byly tyto skupiny srovnatelné co se týká věku, komorbidit, zastoupení mužů a žen, zastoupení pacientů s počtem metastáz do 3 včetně a více, velikost největší metastázy do 5cm včetně a více, velikost největší metastázy do 3cm včetně a více, a v zastoupení bilobárního versus unilobárního postižení (ověřeno ² testem - p  0,05). Důvod neresekability byl většinou věk a komorbidity, případně centrální lokalizace ložiska znemožňující jak RFA, tak resekci.

Všichni pacienti podstoupili standardní systémovou chemoterapii většinou FUFA případně výjimečně FOLFIRI. Byly vytvořeny tyto skupiny pacientů:

1. Léčených kompletní R0 chirurgickou resekcí (36 pacientů).

2. Resekovaných po PVE ( 16 pacientů)

2. Ošetření všech jaterních lézí kombinací resekce a RFA (18 pacientů)

3. Ošetření všech jaterních lézí jen RFA (21 pacientů)

4. Léčených pouze paliativní chemoterapií (47 pacientů).

5. Dvoudobé resekce (8 pacientů)

Byla provedena analýza přežití křivkou přežití a logrank testem.

Výsledky:

V jednotlivých skupinách bylo dosaženo následujícího 5-ti letého přežití. Ve skupině chirurgické R0 resekce 50%, ve skupině kombinace chirurgické resekce a RFA to bylo 43%. Ve skupině portální embolizace s následnou kompletní chirurgickou resekcí bylo dosaženo 40% 5-ti letého přežití a při využití two-stage hepatektomie 35%. U pacientů. kteří nemohli resekci podstoupit bylo 5-ti leté přežití pouhých 5%.

Při vynesení křivky přežití a logrank analýze dosahoval rozdíl mezi průběhem přežívání u pouze resekovaných oproti kombinacím resekce s ostatními metodami hladiny významnosti p < 0,05. Rozdíl mezi resekovanými a neresekovanými byl dokonce p < 0,01. Jednotlivé křivky přežití u skupin s kombinací chirurgické resekce s ostatními metodami se vzájemně významně nelišily ( p  0,05). Tyto výsledky ilustruje následující graf. (Graf VIII-1):
Graf VIII-1: Křivky přežití v souboru pacientů podle způsobu řešení metastatického onemocnění jater.

K eliminaci vlivu rozdílné léčby na dlouhodobé výsledky, byla provedena mimo skupinu paliativní chemoterapie analýza doby do rekurence onemocnění (doby do progrese v případě užití RFA) (Graf VIII-2).

Graf VIII-2: Křivky doby do progrese (případně disease free u resekovaných) podle způsobu kombinace metod k řešení metastatického postižení jater.

V případě doby do progrese přestal být významný rozdíl mezi pouhou resekcí a nutností kombinace resekce s některou z adjuvantních metod (p  0,05). Zůstal rozdíl mezi resekcí v libovolné kombinaci a pouhou RFA ložisek (p < 0,05).

Diskuse: Otázka zda kombinovat resekci s RFA ponechaných ložisek či nikoliv je velice složitá. Na jedné straně vzhledem k účinnosti RFA u malých lézí do 2-3cm v průměru a na základě výsledků přežití z databáze livermetsurvey se lze přiklonit k variantě kombinace obou metod. Nicméně, zde činí relativně malé množství pacientů ošetřených v kombinaci s RFA nespolehlivou právě tu zajímavější část dlouhodobějších výsledků.

Na druhé straně vyvstává otázka, zda vystavovat pacienty větší morbiditou zatížené chirurgické resekci , když jejich přežití bude dáno tím slabším článkem řetězu – tedy RFA. Zda tedy neošetřit všechny léze v játrech jen RFA. Již nutnost použití kombinace resekce a RFA napovídá o pokročilosti onemocnění s horší prognózou i po úplné resekci. Zajímavý výsledek publikoval Livraghi u studie svých 88 pacientů léčených RFA jako předstupeň před chirurgickou resekcí (Livraghi 2003). Kompletní ablace nádoru bylo dosaženo jen v 58%, a z nich 98% již nepotřebovalo plánovanou resekci, protože buď zůstali disease free, nebo progredovali do neresekabilního stádia. U některých pacientů byl také prokázán srovnatelný dlouhodobý efekt RFA a chirurgické resekce u pacientů se solitární metastázou dosahující 3-letého přežití 52% vs 55% (Oshowo 2003). Naše výsledky ukazují lepší přežití u pacientů, kteří nevyžadovali kombinaci jiných metod k R0 chirurgické resekci (a toto potvrzuje i nyní nejnovější statistika z livermetsurvey). Je možné, že je to způsobeno pacienty, u kterých byla metastáza ošetřená pomocí RFA větší než 2 cm, a že u pacientů s metastázami do 2cm ošetřených RFA by mohly být dlouhodobé výsledky při nutnosti kombinace obou metod i u primárně resekabilních pacientů shodné. Vzhledem k malému počtu takových pacientů v našem souboru toto nemohlo být statisticky ověřeno. Dle našich výsledků se zdá, že pouze RFA má horší výsledky než kombinace RFA a chirurgické resekce, a ta má o něco horší výsledky než úplná chirurgická resekce. Léčba případné rekurence v souboru byla individuální a nebylo možno provézt analýzu vlivu této léčby na výsledné přežití. Tato léčba mohla také významně ovlivnit dlouhodobé výsledky a přežití. Například pacienti primárně léčení jen RFA nebo paliativní chemoterapií jistě neměli provedenu resekci případné rekurence, zatímco v ostatních případech bylo možno někdy nabídnout pacientům reresekci. Počty takto ošetřených pacientů byly příliš nízké na to, aby mohly být validně statisticky vyhodnoceny rozdíly mezi skupinami. Proto byla provedena také analýza doby do progrese onemocnění (doby do rekurence). Tato analýza pak mohla být zkreslena interpretací zobrazovacích metod k posouzení případně progrese v případě využití RFA léčby. Je známo že RECIST kritéria v tomto případě selhávají. Rozhodnutí o progresi onemocnění bylo prováděno na základě zhodnocení multidisciplinární komise, která hodnotila výsledky zobrazovacích metod spolu s vývojem laboratorních hodnot především dynamiky onkomarkerů. Je zde vidět, že rozdíly mezi resekcí v kombinaci s jakoukoliv adjuvantní metodou se snižují, prohlubuje se rozdíl mezi pouhou RFA a mezi resekcí s libovolnou adjuvantní metodou. To znamená, že nejkratší interval mezi progresí onemocnění a smrtí je u pacientů na paliativní chemoterapii. Zde totiž nebyla nejspíše ložiska nikdy zcela eradikována, a dochází k postupné rezistenci na chemoterapii, která pak již nemůže zvrátit nepříznivý vývoj. U pacientů léčených pouze RFA není obvykle možná případná reresekce, progrese je dána spíše nedostatečným efektem RFA u větších ložisek, a tak paliativní chemoterapie je schopna prodloužit dobu od progrese onemocnění do úmrtí. U pacientů s kombinací resekce a některé adjuvantní metody je možnost další intervenční léčby již omezená, zatímco u pouze resekovaných lze nabídnout celé spektrum lokálně ablačních metod, které taktéž prodlouží interval od recidivy onemocnění do úmrtí. Je také vidět, že pacienti, kteří jsou bez recidivy po 72 měsících (6-ti letech) již prakticky nerelabují a tito pacienti mohou být považování za kompletně vyléčené (vzhledem k systémové povaze každého onkologického onemocnění je snad lépe říkat, že jsou v kompletní remisi).

Protože jsou výsledky využití kombinace RFA a resekce, PVE a resekce, a dvoudobé resekce prakticky shodné, může být vhodné dát přednost kombinaci chirurgické resekce a RFA, pokud je to možné, před ostatními dvěmi kombinacemi, vzhledem k riziku progrese do neresekabilního stádia v mezidobí po PVE nebo mezi jednotlivými resekcemi u dvoudobých výkonů. V našich podmínkách dáváme nyní u těchto metod přednost současnému perkutánnímu nebo peroperačnímu ošetření ponechaných metastáz RFA.

IX. Livermetsurvey
S vývojem různých modalit léčby pacientů s kolorektálním karcinomem do jater vyvstává potřeba produkce validních dat, která by pomohla zhodnotit tu kterou proceduru. Tato data je potřeba produkovat a zpracovávat v reálném čase, tak aby poskytovala vždy aktuální informaci. Mimo národních onkologických registrů je možným řešením on-line multicentrická volná databáze spravovaná mezinárodní komisí. Nevýhody národních registrů jsou několikeré. Jsou pouze národní, nemohou tedy obsahovat v některých diagnózách dostatek pacientů k validnímu statistickému hodnocení. Jsou příliš široké, tak aby mohly pojmout co nejširší spektrum různých onkologických diagnóz. Nejsou schopny se flexibilně přizpůsobovat aktuálním diagnosticko-terapeutickým postupům. Tato data nejsou zcela přirozeně dostupná všem odborníkům v dané oblasti. Není zajištěno zpracování těchto dat v aktuálním čase se vztahem ke specifickým potřebám té které diagnózy.
Popis databáze LiverMetSurvey a současný stav: Mezinárodní databáze LiverMetSurvey (www.livermetsurvey.org) je volná nefiremní databáze pacientů plánovaných k resekci jaterní metastázy kolorektálního karcinomu, jejíž součástí je i naše pracoviště. Logistika je podporována firmou Sanofi-aventis. Databáze je spravována nezávislou mezinárodní komisí odborníků v níž má alespoň jednoho člena každá účastnící se země. Tato komise zajišťuje flexibilitu databáze s ohledem na řešení aktuálních otázek. Do databáze může vstoupit kdokoliv bez ohledu na počet provedených jaterních resekcí. Je pouze nutné zajistit kontinuitu poskytovaných dat, tj. aby se pacienti z databáze neztráceli a data o jejich zdravotním stavu byla dodávána nejpozději pololetně do konce jejich života. Vkládaná data by měla být preferenčně prospektivní. Není možné v rámci této databáze srovnávat výsledky jednotlivých pracovišť navzájem, je možné srovnat vlastní výsledky vůči globálním datům. Výhody takovéto databáze jsou několikeré. Umožňuje:

1. 
   Obejít problémy s počtem pacientů ve studii
   
2. 
   Obejít etický problém přiřazování léčebných větví jednotlivým pacientům na základě protokolu studie. V tomto případě jsou jednotlivé větve dány zvyky a postupy na jednotlivých pracovištích a v jednotlivých zemích.
   
3. 
   Poskytnout robustní data nutná k objektivnímu zhodnocení výsledků léčby v reálném čase.
   
4. 
   Mít dostatečně flexibilní strukturu, která v reálném čase reaguje na nové léčebné postupy a hypotézy týkající se jaterních metastáz kolorektálního karcinomu.
   
5. 
   On line přístup ke globálním i vlastním datům.
   

Pak samozřejmě existuje ještě několik dobrých důvodů pro pracoviště z České republiky, proč se účastnit:

1. 
   Zvýšení mezinárodní prestiže
   
2. 
   Lepší kontrola vlastních výsledků
   
3. 
   Přístup k nejčerstvějším výsledkům různých léčebných postupů
   
4. 
   Možnost ovlivnit strukturu databáze a interpretaci výsledků
   

Součástí této nadnárodní databáze je také naše pracoviště FN Brno.

V současnosti představuje tato databáze data od největšího počtu prospektivně sledovaných pacientů. Nevýhodou může být jistá nehomogenita dat, ale ta je u všech multicentrických dat. Kontrola úplnosti vkládaných dat je zajištěna dobrovolností účasti a spolehlivostí týmů, které se této databáze účastní. Pro ilustraci možností databáze dávat odpovědi na různé otázky je možné uvézt následující závěry:

1. 
   Statisticky významné horší dlouhodobé přežití po kompletní R0 resekcí jaterních metastáz u pacientů s vyšším počtem lézí než 3
   
2. 
   Statisticky významné horší dlouhodobé přežití po kompletní R0 resekcí jaterních metastáz u pacientů s metastázou větší než 50mm
   
3. 
   Statistiky stejná pravděpodobnost dlouhodobého přežití u pacientů s opakovanými resekcemi po každé nové resekci recidivy.
   
4. 
   Spíše horší dlouhodobé výsledky po resekci jaterních metastáz v případě neoadiuvantní chemoterapie (statisticky nevýznamné) a to i v případě většího počtu metastáz nebo větší velikosti (nad 50mm).
   
5. 
   Statisticky významně horší přežití po R0 resekci po neoadiuvantní chemoterapii, pokud byla delší než 6 cyklů.
   

X. Závěr
Ve vztahu k vysloveným hypotézám se podařilo prokázat že:

1. 
   Na základě rozboru literárních dat, principů jednotlivých diagnostických metod a klinických zkušeností vyplývá, že v současnosti používané diagnostické metody nestačí na dostatečně přesné určení typu, stádia a biologických vlastností nádorů nutných k sestavení ideální léčby na míru. Existují však metody, které lze v různém časovém horizontu zavést do běžné klinické praxe, které tyto nedostatky dokážou překonat.
   
2. 
   Klinická odpověď na chemoterapii je v dobré korelaci s in vitro zjištěnou chemorezistencí nádoru k použitým cytostatikům. Lze ji tak využít k detekci důležitých charakteristik nádoru a sestavení léčby na míru.
   
3. 
   Lokoregionální chemoterpie jater spolu se systémovou chemoterapií má potenciál dosažení vyšší sekundární resekability i léčebné odpovědi s odpovídajícím efektem na přežití a dobu do progrese, a má proto smysl ji zařadit jako neoadiuvantní u primárně neresekabilních pacientů, jako 2. linii léčby u pacientů se selháním léčby 1. linie, i jako adiuvance po jaterní resekci.
   
4. 
   Byl skonstruován a klinicky úspěšně vyzkoušen katetr k endovaskulární aplikaci radiofrekvenčního proudu k uzávěu tepen živících nádor. Bylo prokázáno, že jeho použití je bezpečné a efektivní. Klinický dopad však vyžaduje další zhodnocení.
   
5. 
   Embolizace pravé větve portální žíly je schopna dosáhnout sekundární resekability u jinak neresekovatelných nádorů jater i s dopadem na délku přežití nebo disease free interval pacientů. Je však v případě neúspěchu zatížena rizikem akcelerace růstu jaterních metastáz.
   
6. 
   Disekce jaterního parenchymu pomocí radiofrekvenčního proudu (Habib 4X) není šetrnější než klasická disekce. Zkrácení doby disekce a snížení krevních ztrát nebylo prokázáno. Publikované komplikace jsou opravdu dány špatnou technikou použití. .
   
7. 
   Má smysl kombinovat u neresekabilních onemocnění jater lokálně ablační techniky a chirurgickou resekci – dosažený výsledek bude vždy lepší než u použití pouze ablačních technik. Všechny metody k dosažení sekundární resekability včetné lokálních ablací jsou srovnatelné.
   

Navíc výsledky této práce potvrzují jak přímé (detekce povrchových antigenů- např. CD 133+ cytokeratin-) tak nepřímé důkazy (průběh přežití, chování metastáz po léčbě) o existenci privilegované skupiny nádorových kmenových buněk. Do budoucna je nutno diagnostiku a léčbu cílit převážně na tyto buňky. Je možné, že pokud by se podařilo zlikvidovat všechny kmenové buňky, bude regenerační schopnost ostatního nádoru velmi omezená a dojde ke spontánní regresi nádoru. Na základě prezentovaných výsledků je také velmi pravděpodobné že krátkodobý efekt léčby v řádech do 3-4 let je dán efektem na většinovou populaci nádorové tkáně bez ohledu na to, zda jsou ničeny i kmenové buňky. Dlouhodobý – potenciálně kurativní efekt s výhledem nad 4 roky je však dán pouze efektem na kmenové buňky (které nemusejí dokonce ani ležet přímo v játrech). Jeví se tak v současné době jako nevyhnutné identifikovat tyto buňky v nádorové tkáni a v těle pacienta. Na základě výše prezentovaných výsledků je zřejmé, že v dnešní době již k tomu máme prostředky.

XI. Dodatky
XI-1. Dodatek 1 – Geny postižené různými mechanismy kancerogeneze
Tabulka XI-1: Mechanismy karcinogeneze u HCC umožňující detekci rizika jeho vzniku

Stresor	Mechanismus	Výsledek
HBV infekce	Inzerce HBV DNA	Chromozomální instabilita
	Inzerce HBV DNA do specifických míst	Porucha regulace exprese vlastních genů buňky – ß-receptor kyseliny retinové, A-cyklinu a mevalonát syntázy – dnes známo až 15 genů
	Exprese virových proteinů jako např. Hbx	Modulace buněčného cyklu, vazba na p53 s inaktivací p53 indukované apoptózy
aflatoxin B1 expozice	Transformace AFB1 na aktivní metabolity v játrech	DNA adukty
		reakce AFB1 epoxidu s guaninem v DNA – GC-TA konverze vedoucí k záměně R-S na kodonu 249.
vinyl chlorid	K-ras-2 mutace ve 33%	Spíše angiosarkom než HCC,
adenom	Bialelická mutace transkripčního faktoru 1(TCF1) kódující jaterní nukleární faktor 1α (HNF1 α) v 60% adenomů	Inaktivace TCF1
nespecifické faktory	Chromozomální aberace a) Delece chromozomálních ramínek 17p, 8p, 16q, 16p, 4q, 9p, 13q, 1p, 6q b) Inzerce 1q, 7q, 8q, 17q vedoucí k inaktivaci tumor supresorových genů	Defekt tumorsupresoru p53 (17p) Retinoblastom 1 (13q) Axis inhibitor protein 1 (16p) CDKN2A (9p) IGF2R (6q)
*CDKN2A – 2A inhibitor cyklin-dependentní kinázy

Tabulka XI-2: Geny spolupodílející se na HNPCC

gen	chromozóm	% nádorů s mutací	Typ genu
hMSH2	2p15-16	70%	MMS
hMLH1	3p21		MMS
hPMS1	2q31		MMS
hPMS2	7q22		MMS
hMSH6/GTBP			MMS
myc	8	2	onkogen
K-ras	12	50	onkogen
p53	17	nad 70	tumorsupresor
DCC	18	nad 70	tumorsupresor
APC	5q21	nad 70	tumorsupresor

XI-2. Dodatek 2 – Antigeny produkované nádorovými buňkami
Tabulka XI-3: Rodina adhezivních molekul

Imunoglubuliny (dle genů které spolukódují Ig	N-CAM (Myelin protein 0), ICAM (1-4), VCAM-1, PE-CAM, L1-CAM
Kadheriny	Desmoglein, (T,E,P,N)-kadheriny
Selektiny	(E, L, P)- selektiny
Integriny	LFA-1, integrin 2, integriny 1-8, Makrofág-1 antigen, VLA-4, IIb/IIIa glykoprotein destiček
Ostatní	CEA, 5T4, CD22, CD24, CD44, CD146, CD164

Tabulka XI-4: Antigeny ve zvýšené míře exprimované nádorem uvolňované do séra

Skupina	Konkrétní antigeny	Poznámky
fetální antigeny	CEA, 5T4, AFP, HCG, CA 72-4 , CA19-9	V dospělosti je exprimují prakticky jen nádorové buňky, CEA a 5T4 jsou užívány k cílené molekulární diagnostice nebo léčbě., CA 19-9 je identický s antigenem Lewisova faktoru krvinek. Lewis negativní pacienti tento antigen nebudou nikdy exprimovat nádorem (až 10%).
enzymy zvýšeného metabolismu	tymidinkináza, MMP,	Reakcí na MMP je zvýšená syntéza TIMP, které lze také detekovat. Výše koreluje s agresivitou nádoru.
Odpadní produkty zvýšeného metabolismu	TPS, TPA, CYFRA 21-1	degradační produkty cytokeratinů – typické pro karcinomy (epitely). Zvýšená obnova epitelů vede k jejich zvýšené hladině
hormony, růstové působky	VEGF,	vysoká hladina je negativní prediktor průběhu

XI-3. Dodatek 3 – Regulace metaloproteináz a angiogeneze
Tabulka XI-5: cesty regulace MMP (tečkovaná čára znamená inhibici) (PAI – Plasmin activator inhibitor, uPA- urokinázový plasmin activator,)

Pozitivní efekt		Negativní efekt
IL-1, TNF, PDGF, Forbol	MMP geny	TGF , Retionoidy Heparin Kortikosteroidy
	TRANSKRIPCE
TNF aktivace	ZYMOGENY	TIMP geny
PAI-1, PAI-2	Pro-stromelazin Pro-gelatináza A Pro-gelatináza B Pro-kolagenáza
uPA, Plasmin MTMMP	AKTIVACE	TIMP 1, 2, 3, 4
	AKTIVNÍ ENZYMY
Pozitivní zpětná vazba	Stromelazin Gelatináza A Gelatináza B Kolagenáza	TIMP 1,2 Tetracykliny Antracykliny Syntetické inhibitory
	PROTEOLÝZA
Extracelulární matrix		LMW peptidy

Tabulka XI-6: regulace angiogeneze

Pozitivní regulátory	Negativní regulátory
Fibroblast growth faktory	Thrombospondin-1
Placentální growth faktor	Angiostatin
Vascular endothelial growth faktor	Interferon-
Transforming growth faktory	16 kDa fragment prolaktinu
Angiogenin	Destičkový faktor 4
G-CSF	Genistein
PDEGF	Placentární proliferin-related protein
Interleukin-8	TGF -  ???

XI-4. Dodatek 4 – Protokol testování cytostatik in vitro
Vlastní provedení testu začíná homogenizací tkáně. Tkáň je rozdrcena na sterilním kovovém sítku, nanesena na Lymphoprep a centrifugací jsou separovány homogenizované buňky od erytrocytů, nebuněčného materiálu a nezhomogenizovaných částí tkáně. Buňky jsou odebrány, opakovaně promyty a přeneseny do média. Jako vhodné kultivační médium bylo vybráno: RPMI 1640 (Gibco BRL) obohacené o 10 – 15 % bovinní fetální sérum, 1% roztok penicilinu a streptomycinu a 40 g/ml gentamycinu. Celá práce probíhá ve sterilním laminární boxu, všechny nástroje, plastik a roztoky jsou sterilní, případně určené pro jednorázové použití.

Kultivace buněčných explantátů a jejich inkubace s cytostatiky: Připravené homogenizované buňky v kultivačním médiu jsou naředěny na koncentraci 10⁶ buněk na 1ml a alikvotovány do jamek 96-jamkové ELISA-destičky. Ve dvou řadách je na destičce ponecháno médium bez buněk. Toto médium slouží jednak jako kontrola sterility , ale hlavně při závěrečném měření absorbance poskytuje referenční hodnotu (blank). V dalších dvou řadách je médium s buňkami, ke kterým se nepřidává žádné cytostatikum. Toto slouží jako kontrola viability buněk a je takto získána referenční hodnota, ke které se potom vztahují hodnoty rezistence. A konečně dále následují řady, do kterých se k buňkám přidávají cytostatika. Spektrum cytostatik a jejich přesné koncentrace jsou voleny v panelech podle typu nádoru, případně individuálně podle historie léčby nebo podle konkrétního požadavku klinika. Takto připravené buňky jsou kultivovány 72 hodin v inkubátoru ve 37 °C v 5 % CO₂.

MTT test: Pro měření buněčné proliferace a viability bylo vyvinuto několik typů tetrazoliových solí, např. MTT, XTT, MTS a WST-1. Všechny tyto soli jsou buněčnými dehydrogenázami štěpeny na formazany, a proto jsou pro stanovení stejně využitelné. Nicméně se liší některými svými vlastnostmi jako např. stabilitou a dále rozpustností svých produktů. Jako vhodný substrát jsme pro test viability/proliferace vybrali WST-1. Je stabilnější ve srovnání s XTT a MTS a jeho formazanové produkty jsou rozpustné ve vodě, na rozdíl od produktů MTT, které se musí rozpouštět v DMSO, což celý postup komplikuje a vyžaduje další přístrojové vybavení (např. centrifugu s rotorem na ELISA destičky). Vlastní test se provádí tak, že WST-1 se přidává k inkubovaným buňkám a ty jsou inkubovány další 2 hodiny ve 37 °C v 5 % atmosféře CO₂. Následuje měření absorbance na přístroji ELISA reader při vlnové délce 420 až 480 nm (s maximem kolem 440 nm), kdy jako referenční je použita hodnota absorbance naměřená v kultivačním médiu bez buněk. Výsledky měření absorbance jsou potom statisticky zpracovány, a to pomocí softwaru „Chemorezist“ (laskavě poskytnuto Doc. RNDr. L.Duškem, CSc. a Mgr. B. Regnerem z Centra informatiky a analýz UOC, LF MU Brno).

XI-5. Dodatek 5 – Možnosti Gene silencingu
Tabulka XI-7: Možné postupy silencingu genů využitelné klinicky. (Scherer 2003)

Postup	Výhody	Nevýhody
Protismyslové oligodeoxyribonukleové kyseliny (ODN), antisense DNA	Mohou být modifikovány, aby se zvýšila specificita a účinnost Mohou být cíleny do intronů Jednoduchá příprava	Mohou spustit interferonovou odpověď Vážou se na proteiny Dají se podávat pouze exogenně Mají i necílené účinky
Ribozymy - jsou RNA molekuly s katalytickou funkcí a mohou mít více aktivit. Jsou tvořeny v buňce během transkripce nebo do ní mohou být vpraveny experimentálně	Mohou rozeznat SNP. Mohou být použity pro korekci defektů Lze připojit sekvenci pro změnu cílové RNA. Jednoduchá katalytická doména Mohou být cíleny do intronů či buněčných organel	Potřebují GUC triplet, což limituje výběr potenciálních cílů Vážou se na proteiny
DNAzymy – analog Ribozymů	Levná výroba, dobré katalytické vlastnosti. Mohou být modifikovány pro systémové podávání	Pouze exogenní aktivita Mají i necílené účinky
RNAi (siRNA, shRNA), shRNA je tvořená „vlásenkou“ sense-loop-antisense, která je v buňce štěpena siRNA duplexy	Účinné i v nízkých koncentracích Obchází interferonovou odpověď Mohou být podány různými způsoby Možnost tkáňové specificity Pravděpodobně nejsou toxické Dlouhodobý efekt	Nemohou utlumit jaderné RNA Nemohou být cíleny do intronů Nemohou být jednoduše optimalizovány Někdy mají nespecifické účinky, které však lze omezit vhodným návrhem siRNA sekvencí
miRNA (microRNA) - malé (~22 nukleotidů) nekódující RNA molekuly, které buňky přirozeně používají k negativní regulaci genové exprese na posttranskripční úrovni.	Jestliže se setká se zcela komplementární sekvencí, může se miRNA molekula chovat jako siRNA a spustit degradaci komplementárních řetězců. Jinak přirozeně regulují genovou expresi na úrovni translace.