2. Specii de drojdii utilizate în procesele biotehnologice

2. Specii de drojdii utilizate în procesele biotehnologice

Introducere

Pentru obţinerea de biomasă proteică sau de diverşi metaboliţi primari şi secundari folosiţi în biotehnologii sunt preferate de multe ori drojdiile, deoarece pot fi mai uşor separate din mediul de cultură datorită dimensiunii mai mari a celulei (5 m) şi conţinutului scăzut în acizi nucleici (5 – 9%). În acelaşi timp pH scăzut la care se dezvoltă drojdiile reduce pericolul de contaminare.

Incriminarea componentelor peretelui celular bacterian ca având propietăţi antigenice constituie un argument în plus pentru utilizarea drojdiilor în diferite procese biotehnologice, dar şi în experimente genetice care vizează producţia unor hormoni, medicamente şi proteine heteroloage alte substanţe biologic active [1].
2.1. Saccharomyces cerevisiae Hansen

S. cerevisiae este tipul reprezentativ al genului Saccharomyces Meyernemend Reess. Numele generic de Saccharomyces a fost introdus de Meyen în 1838, iar genul a fost definit pentru prima dată în 1870 de Reess.

Drojdiile din genul Saccharomyces prezintă celule de formă variată- rotundă, ovale, alungite, cilindrice- care uneori formează pseudomicelii şi se înmulţesc pe cale vegetativă prin înmugurire multilaterală şi sexuat prin spori. În condiţii naturale, celula diploidă se transformă în urma diviziunii meiotice într-o ască cu patru ascospori - 2 şi 2s. Lindegren şi Lindengren au demonstrat existenţa unei perechi de alele a şi , care controlează împerecherea. Pe mediu nutritiv complet sau în condiţii optime de hrană în natură, între spori sau celule vegetative se realizează conjugarea, rezultând zigotul diploid. Locusul tipului de împerechere la Saccharomyces cerevisiae, de exemplu, denumit MAT, este localizat în cromozomul III şi există sub forma a două alele MATa şi MAT, care controlează diferenţierea sexuată, producerea de feromoni, aglutinarea, împerecherea şi sporularea.

Toate tulpinile de drojdii aparţin la două tipuri: heterotalic şi homotalic. În practică homotalismul şi heterotalismul la drojdii se determină prin testarea capacităţii de sporulare şi împerechere. Heterotalismul presupune obligatoriu încrucişarea între celule de tip opus de împerechere a şi  care derivă din culturi unisporale. Zigoţii diploizi rezultaţi segregă întotdeauna în raport de 2a:2. Homotalismul a fost observat la Saccharomyces cerevisiae vkr ellipsoideus şi ulterior la F. Chevalieri.

Studiul genetic al diverselor tulpini a evidenţiat că o singură pereche de alele denumită Ho/ho este responsabilă pentru diferenţierea homotalism/heterotalism. Studiul segregării la tetraploizi a arătat că homotalismul este dominant. Diferenţa de comportare a celor două tipuri de tulpini se datoreşte prezenţei genei Ho în tulpinile homotalice, în tulpinile heterotalice fiind prezentă alela ho. Saccharomyces cerevisiae este specia folosită din cele mai vechi timpuri în industria de bere şi panificaţie şi cea mai mare parte a drojdiei alimentare şi furajere este obţinută prin recuperarea acestei drojdii de la fabricile de bere. Dezavantajele folosirii tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae pentru producerea industrială de drojdie alimentară şi furajeră îl constituie tendinţa de a se dezvolta pe substraturi mai costisitoare.

Saccharomyces cerevisiae izolată din bere şi ulterior din vin, după cultivarea pe extract de malţ timp de 3 zile, se prezintă sub forma unor celule sferice, elipsoidale, cilindrice, alungite, dispuse izolat sau în perechi şi ocazional formează lanţuri şi aglomerări. Celulele de S. cerevisiae se încadrează în 3 grupe de dimensiuni: în prima grupă sunt încadrate celulele cu dimensiuni 4,5 – 10,5 × 7 – 21 m, cele din grupa a doua au dimensiuni de 2,5 – 7 × 4,5 – 11 – 18,5 m, iar ultima grupă, a III – a, cuprinde celulele cu cele mai mici dimensiuni, 3,5 – 8 × 5 (11,5) – 17,5 m [1].

Se întâlnesc şi celule filamentoase care ajung la 30 m lungime. În mediu lichid formează sediment şi ocazional un inel incomplet. Prin conjugarea a doi spori de tip de împerechere diferit se formează zigotul diploid /a, care în urma meiozei se poate transforma într-o ască cu unul până la patru ascospori. Drojdiile din acest tip fermentează glucoza, galactoza, zaharoza, maltoza, 1/3 din rafinoză şi dextrinele. De asemenea ele asimilează alcoolul etilic, glicerina şi acidul lactic. Saccharomyces cerevisiae suportă bine aciditatea şi alcoolul şi se dezvoltă optim între 25 şi 30⁰C. Datorită capacităţii lor de a produce alcool (până la 14%). Drojdiile din acest tip prezintă interes pentru industria fermentativă şi în laborator pot fi crescute la 30⁰C, pe mediu complet (extract de drojdie 1%, peptonă 2%, glucoză 2% sau K₂HPO₄ 0,2%, MgSO₄ 0,1%, (NH₂)SO₄ 0,1%, autolizat de drojdie 1%) şii sunt utilizate în producţia de proteine heteroloage.

2.2. Schwanniomyces occidentalis Kloecker

Schwanniomyces occidentalis face parte din drojdiile ascomicete şi a fost descrisă de Kloecker în anul 1909. Genul Schwanniomyces face parte din ordinul Endomycetalis, familia Saccharomycetaceae, subfamilia Saccharomycoideae, care mai cuprinde genurile Saccharomyces, Kluyveromyces şi Hansenula [3].

Celulele de Schwanniomyces au formă ovoidală şi dimensiuni cuprinse între 3,5 – 8 × 4,5 – 9 m. Prezintă o înmulţire vegetativă prin înmugurire multilaterală. Pseudomiceliul nu este caracteristic acestei specii de drojdie. Celulele sunt haploide şi monotipice, neobservându-se până acum încrucişări intraspecifice sau interspecifice.

Schwaniomyces occidentalis este capabil să utilizeze o varietate de compuşi organici ca surse de carbon: glucoză, fructoză, galactoză, D – xiloză, sucroză, rafinoză, celobioză, trehaloză, lactoză, succinat, etanol, n – alcani, maltoză, izomaltoză, pullulan, dextrină şi amidon. Această drojdie este incapabilă de a se dezvolta pe mediu fără vitamine, sau să asimileze nitraţi. Phytatul (mio – inozitol hexakifosfat) poate fi utilizat de către Schwaniomyces occidentalis ca singură sursă de fosfor, această tulpină de drojdie având o înaltă activitate phitazică. Au fost izolate tulpini mutante „petite”, care în aparenţă pot fi deficiente în citocromul b. Analiza acestor mutante citocrom deficiente este rezultatul descoperirii unei căi respiratorii alternative în Schwaniomyces occidentalis [2].

Cea mai remarcabilă proprietate a tulpinii Schwaniomyces occidentalis este abilitatea de a degrada eficient amidonul, ca rezultat a unei acţiuni combinate de secreţie a  - amilazei şi glucoamilazei. Expresia ambelor enzime este inductibilă şi represată de glucoză.

2.2.1. Medii de cultură

Schwaniomyces occidentalis se poate conserva pe medii de Saccharomyces cerevisiae complete (YP) şi sintetice minimale (SD, în care dextroza este sursă de carbon) [4]. Mediul YP conţine 10 g/l extract de drojdie Bacto şi 20 g/l peptonă Bacto, plus 2% o sursă de carbon uzuală listată mai sus. Mediul sintetic conţine 6,7 g/l azot provenit din extract de aminoacizi din drojdii, ca sursă de aminoacizi şi carbon. Mediul sintetic este tamponat cu Na₃PO₄ 0,2M (pH 6.3) pentru menţinerea activităţii amilazei. De asemenea, au fost descrise diferite variante de mediu pentru inducţia sporulării. O variantă de mediu conţine autolizat de drojdie şi agar – glucoză şi pentru sporulare a fost incubat 5 zile la temperatura camerei. Altă variantă de mediu conţine 1,3% extract de drojdie, 0,5% peptonă şi 1,5% glucoză, cu pH ajustat la 4,5. Acesta a fost incubat 20 de zile la 19⁰C. Au fost obţinute asce pe plăci cu agar, care conţin 0,5% extract de drojdie şi 5% glucoză.
2.2.2. Expresia genelor heteroloage

Sistemul de vectori existent în Schwanniomyces occidentalis constituie baza pentru utilizarea acestei tulpini de drojdie ca gazdă, pentru expresia genelor heteroloage. Diferite gene din Schwanniomyces occidentalis au fost bine clonate (Tabelul 1) pentru a fi surse de promotori terminali, care au fost secvenţializaţi şi codificaţi ca secvenţe semnal pentru secreţia de proteine în Schwanniomyces occidentalis.

Tabelul 1. Gene clonate în Schwanniomyces occidentalis.

Gene	Funcţia	Dimensiune (aminoacizi)	Expresie în Saccharomyces cerevisiae
ADE1	Sinteză de adenină	nedeterminată	Nedeterminată
ADE2	Sinteză de adenină	nedeterminată	Nedeterminată
ODC1	Sinteză de uracil	nedeterminată	Da
HIS4	Sinteză de histidină	nedeterminată	Da
EG1	Necunoscută	158	nedeterminată
INV1	Invertază	533	Da
AMY1	 - amilază	512	Da
GAM1	Glucoamilază	958	Nu
CYC1	Citocrom C	110	Da
GDH1	Glutamat – dehidrogenază	459	Da
SWA2	 - amilază	507	Da
SCR1	Rezistenţă la ciclohaxamidă	Nedeterminată	Da
SCR2	Proteină ribozomală	106	Da
LEU2	Sinteză de leucină	nedeterminată	nedeterminată
AMG1	Subunităţi NADH: Q6 Oxidoreductază	487	Da

2.2.3. Aplicaţii industriale

Schawanniomyces occidentalis a făcut obiectul multor investigaţii axate pe procese biotehnologice, deoarece are abilitatea de a degrada complet amidonul. Amidonul este una din cele mai mari surse de carbon regenerabile (1×10⁹ tone/an) şi conversia lui este unul din cele mai importante procese biotehnologice. Amidonul este utilizat ca materie primă în procese biotehnologice legate de obţinerea dextrozei , a siropului de fructoză, care apoi este folosit în industria alimentară industria de băuturi nealcoolice şi în fermentaţia etanolului. Acest ultim proces include producţia de etanol.

Utilizarea comercială a amidonului din grâu şi orz, cere după măcinarea materiei prime, gelificarea şi apoi lichefierea (hidroliza parţială cu L-amilază bacteriană stabilă), urmată de zaharificare ca rezultat al tratamentului cu  - amilază şi glucoamilază.[5] Pentru producţia de etanol zaharurile rezultate sunt în mod uzual fermentate de Saccharomyces cerevisiae. În procesul de obţinere a berii şi în producţia de whisky din malţ, zaharificarea de către enzimele amilolitice prezente în malţul din orz este incompletă, aşa încât 25% din materialul amidonos rămâne ca dextrine nefermentabile. Pentru reducerea acestor dextrine conţinute în produs s-au efectruat studii asupra drojdiei Schawanniomyces occidentalis de a introduce activitatea amilazică şi în particular glucoamilazică, cu anihilarea ei în stadiul de fermentaţie. Aceste studii au inclus adiţia de amilază obţinută din culturi de Schawanniomyces occidentalis şi introducerea genelor amilazei în Saccharomyces cerevisiae. Aceste ultime încercări au dus la obţinerea de tulpini de Saccharomyces cerevisiae echipate cu gene de Schwanniomyces occidentalis, care codifică -amilaza şi glucoamilaza şi care sunt capabile să degradeze complet amidonul [6].

O altă posibilă aplicare pentru tulpinile de Schwaniomyces occidentalis, este utilizarea lor directă în producţia de SCP din materii prime amidonoase ieftine, pentru a se înlocui melasa, sau în fermentaţia etanolului. Acest ultim proces este de viitor, deoarece nu este rezolvată încă problema toleranţei la concentraţii ridicate de etanol. Alte probleme care sunt în studiu, se referă la represia glucozei de către expresia amilazei şi absenţa efectului Crabtree, combinat cu prezenţa efectului Kluyver. S-a căutat să se depăşească aceste probleme prin procedee de fermentaţie anaerobă cu perioade de dezvoltare aerobă, pentru a se permite secreţia de amilază.

2.3. Kluyveromyces lactis (Dombrowski) van der Walt

Celulele de K. Lactis crescute pe extract de malţ, timp de 3 zile, sunt de obicei sferice, elipsoidale sau ocazional cilindrice, cu dimensiuni de 2 – 6,5×3,8 – 8 m şi pot fi întâlnite singure (izolate), în perechi sau, ocazional, în mici ciorchini sau mase aglutinate (Figura 1). Se pot observa şi celule amoeboide. Cultura este butiroasă, de culoare crem sau maronie, ocazional cu o tentă roz, lucioasă, netedă şi ocazional împărţită în sectoare. Marginea este întreagă spre ondulată, ocazional lobiformă. După menţinerea timp de o lună la temperatura camerei, cultura este de culoare maroniu – crem spre gri – bej, frecvent cu o tentă roz, plată, catifelată, ocazional împărţită în sectoare. Marginea este întreagă, ondulată sau lobiformă. Pe mediu ce conţine făină de porumb se formează un pseudomiceliu rudimentar care în condiţii aerobe poate lipsi şi este bine dezvoltat în condiţii anaerobe. Conjugarea celulelor independente precede de obicei formarea ascelor sau celulele vegetative diploide se pot transforma direct în asce. Numai rareori autogamia precede formarea ascei. Sporii sunt sferici spre elipsoidali. În fiecare ască se diferenţiază 1 – 4 ascospori care sunt rapid eliberaţi din ască şi tind să aglutineze. Acest tip de celule fermentează glucoza, galactoza, zaharoza (rareori), lactoza, rafinoza (rareori) şi rareori (uşor) maltoza şi trehaloza. Asimilează compuşii de carbon din glucoză, galactoză, L – sorboză, zaharoză, maltoză, celobioză, trehaloză, lactoză, etanol, glicerol, ribitol, D – manitol, D – glucitol, rafinoza (rareori), melezitoza, inulina, D – xiloză,  - metil – D – glucozidă, acidul DL – lactic, acidul succinic. Este rezistentă la cicloheximidă [1].

Figura 1. Aspectul morfologic al celulelor de Kluyveromyces lactis.
2.3.1. Medii de cultură

Kluyveromyces lactis asimilează o largă varietate de surse de carbon. În Tabelul 2 sunt prezentate datele de dezvoltare a drojdiei Kluyveromyces lactis în medii de cultură lichide care conşin cele mai uzuale surse de carbon utilizate în laboratoare [7].
Tabelul 2. Ratele de dezvoltare ale tulpinii Kluyveromyces lactis pe surse de carbon comune.

Surse de carbon	Lactoză	Glucoză	Glicerol	Galactoză	Etanol
Timp de dublare (minute)	78	84	96	108	110
Densitate celulară finală	8,4	10,6	7,6	10,2	6,4