Glavni urednik

Research programme and results:

The main goal of the project is to explore the composition and principal features of organizational pattern of DNA components in centromeric and telomeric heterochromatin, and determine ultimate telomeric sequences in selected invertebrate species: insects from families Tenebrionidae and Curculionidae (Coleoptera), root-knot nematodes from the genus Meloidogynae and marine bivalve molluscs. All selected species are economically important organisms, either as pests, or as food resorces. It is proposed that heterochromatic low-copy repeats form a "library" of satellite sequences, whose elements are distributed even among distantly related non-congeneric species. Several new satellite repeats were detected in examined organisms and their genomic organization is characterized. Preliminary results show a library of satellite sequences in parthenogenetic organisms, indicating similar sequence dynamics as in amphimictic species. Uneven distribution of mutations in diverging subfamilies of the mollusc Donax trunculus satellite DNA, as well as in insect satellites indicate functional constraints in the evolution of satellite monomers.

Oznaka: 0098076

STANIČNI ODGOVOR NA FIZIKALNE, KEMIJSKE I BIOLOŠKE NOKSE

CELL RESPONSE TO PHYSICAL, CHEMICAL AND BIOLOGICAL NOXA
Voditelj/ica projekta: dr. sc. Maja Osmak

Tel. ++385 1 4560 939   e-mail: [e-mail]

Suradnici na projektu:
Andreja Ambriović Ristov, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica
Anamaria Brozović, doktorica biol. znanosti, viša asistentica

Tamara Čimbora Zovko, dipl. inž. molekularne biologije, asistentica

Ana Ferle-Vidović, doktorica biol. znanosti, znanstvena savjetnica
Sanjica Jakopec, dipl. inž. molekularne biologije, mlađi asistent
Dragomira Majhen, dipl. inž. molekularne biologije, mlađi asistent
Maja Osmak, doktorica biol. znanosti, znanstvena savjetnica, voditeljica projekta
Lidija Vuković, magistrica biol. znanosti, asistentica

Tehnički suradnici:
Ljiljana Krajcar, tehničarka
Barica Močibob, peračica

Program rada i rezultati na projektu:

Dugoročni cilj rada naše grupe je upoznavanje molekularnih mehanizama koji se aktiviraju kao odgovor stanica na djelovanje fizikalnih ili kemijskih oštećujućih agensa. Naša istraživanja obuhvaćaju složenu mrežu signalnih puteva koji (ako se oštećenja ne poprave) mogu usmjeriti stanicu u programiranu staničnu smrt. Dio ispitivanja povezan je s određivanjem molekularnih mehanizama kojima stanice postaju otporne na citostatike. Na nizu otpornih sublinija našli smo da se konstitutivna ekspresija apoptotskih gena može promjeniti ovisno o vrsti stanica, vrsti citostatika, te načinu njegove primjene. Temeljem poznavanja mehanizama koji određuju osjetljivost stanica na genotoksične spojeve, u suradnji s biokemičarima iz Ljubljane sintetizirali smo i ispitali djelovanje niza spojeva, od kojih su neki bili učinkoviti i za stanice otporne na citostatike.

Drugi dio naših istraživanja usmjeren je na upoznavanje mehanizama infekcije virusima te na konstrukciju novih, potencijalno primjenjivih virusnih vektora. Konstruirali smo i karakterizirali adenovirusni mutant sa skraćenim proteinom vlakna (u odnosu na divlji tip). Iako je vezanje takvog virusa na coxsackie-adenovirusni receptor (CAR) bilo tri do pet puta manje, njegova infektivnost nije se značajno promijenila.

Research programme and results:

Long term objects of our investigation are the molecular mechanisms that are induced as cell response to physical and chemical damaging agents. They involve the complex network of sigaling pathways that can (if the damage is not repaired) induce programmed cell death. A part of our research is connected with examination of the molecular bases of drug-resistance. On several drug-resistant sublines we have found that constitutive expression of apoptotic genes could be altered, depending on the cell type, selected cytotoxic drug and schedule of drug-application. Based on the knowledge of mechanisms that determine the cell-sensitivity to genotoxic compounds, in collaboration with biochemists from Ljubljana, we synthesised and tested a range of new compounds that are effective ( in some cases) also against drug-resistant tumor cells.

The other part of our investiation involves the mechanisms of viral infection and contruction of new viral vectors. We constructed and characterized an adenovirus mutant with shorter fiber protein (than wild type). Though the attachment of such virus to coxsackie-adenovirus receptor (CAR) was three- to fivefold lower, the infection of these viruses was only slightly altered.

Oznaka: 0098077

MOLEKULARNI MEHANIZMI IMORTALIZACIJE I STANIČNOG STARENJA

MOLECULAR MECHANISMS OF IMMORTALIZATION AND CELLULAR AGING
Voditelj/ica projekta: dr. sc. Ivica Rubelj

Tel. ++385 1 4561093   e-mail: [e-mail]

Suradnici na projektu:
Branko Brdar, doktor kem. znanosti, znanstveni savjetnik, (konzultant)
Marina Ferenac, dipl. inž. molekularne biologije, znanstvena novakinja
Milena Ivanković, magistrica biol. znanosti, znanstvena novakinja
Maja Matulić, doktorica biol. znanosti, viša asistentica
Ivica Rubelj, doktor biol. znanosti, znanstveni suradnik, voditelj projekta
Nikolina Škrobot, dipl. inž. molekularne biologije, znanstvena novakinja

Suradnici iz druge ustanove:
Jasna Ban, doktorica biol. znanosti, redovita profesorica, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb (konzultantica)
Antonella Bandiera, doktorica biol. znanosti, izvanredna profesorica, University of Trieste, Trst, Italija (konzultantica)

Miljenko Huzak, doktor matem. znanosti, docent, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb (konzultant)

Olivia Pereira-Smith, doktorica biol. znanosti, UTHSCSA, San Antonio, SAD (konzultantica)

Program rada i rezultati na projektu:

Cilj projekta je istraživanje molekularnih mehanizama karcinogeneze i staničnog starenja i to kroz ispitivanje strukture i funkcije telomera i mehanizama njihovog održavanja u normalnim fibroblastima i imortalnim tumorskim stanicama, te istraživanje pojave sindroma naglog starenja u kulturama normalnih fibroblasta.

Analizirana je dinamika telomera kod humane tumorske stanične linije MIA PaCa koje su pokazale izrazitu nestabilnost telomera praćenu genomskom nestabilnošću. Ispitane su također mišje imortalne stanične linije A9 i A9+1 (A9+1 linija dobivena je uvođenjem humanog kromosoma 1 u A9). Usporedba duljine telomera ovih dviju linija pokazala je da su stanice s humanim kromosomom 1 imale znatno kraće telomere, usprkos prisustvu telomeraze. Raspon duljina telomera humanog kromosoma pratio je raspon telomera stanica domaćina. Zaključeno je da je dinamika telomera stanice ovisna o međusobnim odnosima ukupnih staničnih proteina («protein background»).


Research programme and results:

The project addresses the molecular mechanisms of carcinogenesis and cell aging through research of telomere structure and function and mechanisms of their maintenance in normal fibroblasts and immortal tumor cells, as well as elucidation of the phenomenon of sudden senescence syndrome.

We analyzed telomere dynamics in human tumor cell line Mia PaCa 2 which showed significant telomere and genomic instability. We also analyzed mouse immortal cell line A9 and A9+1 (later one has human chromosome 1 introduced in A9 cells). Comparison of telomere lengths in these cell lines showed significantly shorter telomeres in the cells with human chromosome 1, in spite of telomerase presence. Telomere lengths distribution of the human chromosome followed that of the host cell telomeres. We concluded that telomere lengths are primarily determined by cell protein background.

Oznaka: 0098078

STRUKTURA, FUNKCIJA I REGULACIJA PLAZMINOGENSKIH SERINSKIH PROTEAZA

STRUCTURE, FUNCTION AND REGULATION OF PLASMINOGEN SERINE PROTEASES
Voditelj/ica projekta: dr. sc. Branko Brdar

Tel. ++385 1 4561093   e-mail: [e-mail]

Suradnici na projektu:
Branko Brdar, doktor kem. znanosti, znanstveni savjetnik, voditelj projekta
Maja Matulić, doktorica biol. znanosti, viša asistentica

Suradnici iz druge ustanove:
Nathalie Busso, doktorica biol. znanosti, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Lausanne, Švicarska (konzultantica)

Program rada i rezultati na projektu:

Istraživanja se odnose na razvijanje eksperimentalnog modela za dugotrajni nadzor razine fibrin(ogen)a in vivo, koji se temelji na aktivaciji zimogena plazminogena (Plg) u fibrinolitički aktivan plazmin (Plm) pomoću proteinskim inženjerstvom konstruiranog fuzijskog proteina streptokinaze (SK) i ljudskog mikroplazminogena (mPlg) (SK-mPlg). Fuzijski je protein dizajniran na način da aktivira mišji Plg, pa bi bio podesan za testiranje patološke uloge fibrin(ogen)a u mišjim modelima humanih bolesti (npr. reumatski artritis, glomerulonefritis, ateroskleroza). U skladu s tim, konstruirali smo, eksprimirali (u ekspresijskom sistemu Pichia-e pastoris) i pročistili fuzijski protein SK-mPlg. Ustanovili smo da je plazminogen aktivatorska aktivnost fuzijskog proteina za mišji i/ili goveđi Plg neznatna, pa se može zaključiti da se proteazni aktivni centar u ljudskom mPlg fuzijskog proteina ne aktivira kovalentno vezanom SK; tek nakon dodavanja SK fuzijski je protein postao jako aktivan. Pokušali smo poboljšati proteolitičko svojstvo fuzijskog proteina tako da smo konstruirali novi SK-mPlg sa skraćenim povezivačem (linker) od 4 kodona i klonirali ga u inducibilni ekspresijski vektor E. coli (pQE) koji sadrži 6xHis sekvencu; denaturirani fuzijski protein je pročišćen na Ni-NTA koloni i, prema očekivanju, bio je neaktivan. Otopina denaturiranog fuzijskog proteina podvrgnuta je postupcima odmotavanja (refolding), ali bez naročitog uspjeha. Jedan od načina da se dobije aktivator mišjeg Plg i da se ispita patološka uloga fibrin(ogen)a u mišjim modelima humanih bolesti je primjena imobilizirane, na podesnoj membrani vezane urokinaze. U tu smo svrhu izabrali negativno nabijenu najlonsku membranu (Biodyne C membrane; PallGelman) koja je podesna za implatiranje u živi organizam. Najlonska je membrana aktivirana dicikloheksilkarbodiimidom i urokinaza je reproducibilno imobilizirana. Imobilizirana urokinaza je bila potpuno aktivna za mišji i/ili goveđi Plg i pohranjena je nekoliko tjedana bez gubitka aktivnosti; preostaje da se njezin učinak testira u mišjim modelima humanih bolesti.

Research programme and results:

This project concerns the development of an experimental model system for a long term control of fibrin(ogen) levels in vivo, which is based on the activation of zymogen plasminogen (Plg) to fibrinolytically active plasmin (Plm) using genetically engineered fusion protein consisting of covalently bound streptokinase (SK) and human microplasminogen (mPlg) (SK-mPlg). The fusion protein was designed in such a way to activate mouse Plg, and thus would be useful for the testing of the pathological role of fibrin(ogen) in several murine models of human diseases (e.g., rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, aterosclerosis). In the absence of a natural activator of mouse Plg, we have constructed, cloned, expressed (in the Pichia pastoris expression system) and purified the fusion SK-mPlg. We have found that plasminogen activator activity of SK-mPlg was negligible for mouse and/or bovine Plg, suggesting that the active center in the human mPlg portion of the fusion protein can not be efficiently activated by the covanletly bound SK; only externally added SK strongly activated the fusion protein. We therefore attempted to improve the fusion protein properties by engineering a new SK-mPlg containing a 4 amino acids linker and cloned it into an inducible E. coli expression vector (pQE) having the 6xHis tag at the N-terminus; denatured fusion protein was purified on the Ni-NTA column and, as expected, it was inactive. The solution of denatured fusion protein was subjected to several refolding procedures, but without success. So, another way to get an activator of mouse Plg and study the pathological role of fibrin(ogen) in murine disease systems is to use immobilized, membrane bound urokinase. For this purpose, we selected negatively-charged nylon membrane (Biodyne C membrane; Pall Gelman) which is suitable for implanting in the body. The nylon membrane was activated with dicyclohexylcarbodimide and urokinase was immobilized reproducibly. The immobilized urokinase was fully active for mouse and/or bovine Plg, and was stored without loss of activity for several weeks; its effect remains to be tested in murine models of human diseases.

Oznaka: 0098079

REGULACIJA TRANSKRIPCIJE U EUKARIOTA

TRANSCRIPTIONAL REGULATION IN EUCARYOTES
Voditelj/ica projekta: dr. sc. Mary Sopta

Tel. ++385 1 4560948   e-mail: [e-mail]

Suradnici na projektu:
Vedrana Filić, dipl. inž. molekularne biologije, znanstvena novakinja, na projektu od 1.7.2003.
Branka Jeličić, dipl. inž. molekularne biologije, znanstvena novakinja, na projektu od 1.7.2003.
Mary Sopta, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica, voditeljica projekta
Ana Traven, doktorica biol. znanosti, viša asistentica
Program rada i rezultati na projektu:

Dosadašnjim istraživanjima kvaščevog proteina Xtc1 pokazali smo da taj protein djeluje kao represor transkripcije putem RNA-polimeraze II. Osim toga, poznato je da Xtc1 sudjeluje u regulaciji fiziologije mitohondrija, konkretno - u homolognoj rekombinaciji mitohondrijske DNA (odakle mu drugo ime, Mhr1). Obzirom na takvu dualnu ulogu u dva separatna stanična organela, zanimala nas je njegova stanična lokalizacija; odnosno, koji dijelovi proteina su odgovorni za njegovo unutarstanično upućivanje. Amino-terminalna fuzija cijelog proteina s GFP-em (engl. green fluorescent protein) lokalizirala se u oba organela (jezgra i mitohondriji), dok je karboksi-terminalna fuzija locirana samo u mitohondrijima. Mikroskopiranja su obavljena na laserskom konfokalnom mikroskopu na Univerzitetu u Grazu. Daljnja istraživanja intracelularne lokalizacije varijanti Xtc1 proteina skraćenih za po 30, 60 i 100 aminokiselina s oba kraja proteina još su u tijeku.

U ovoj godini su također započeta istraživanja utjecaja nedostatka mitohondrijske DNA (tzv. petite mutanti) na transkripciju ovisnu o kvaščevom aktivatoru Gal4. Preliminarni rezultati pokazuju dvostruko veće razine transkripcije u rho0 mutantama.

Regulacija ekspresije gena jedan je od najvažnijih načina kontrole svih staničnih procesa tako da sva nova saznanja o mehanizmima istog predstavljaju značajni doprinos u razumijevanju poremećaja u eukariotskim stanicama koji su posljedica promjena u regulaciji genske ekspresije.

Research programme and results:

The yeast protein Xtc1 was identified as a protein that binds directly and specifically to the activation domains of acidic activators such as E2F-1, Gal4 and VP16. Additionally, it was shown to co-purify with the RNA polymerase II holoenzyme complex and it was suggested that Xtc1 functions as a regulator of transcription that modulates the response of RNA polymerase II to transcriptional activators. We have further analyzed the transcription function of Xtc1 and show that its fusion to a heterologous DNA binding domain can repress transcription of a reporter gene in vivo in an Srb10/11-dependent manner. We suggest that the presence of Xtc1 in the RNA polymerase II holoenzyme could help to recruit an Srb10-active form of the holoenzyme to target promoters. This same protein has also been implicated in mitochondrial DNA recombination, maintenance and repair. Determination of the subcellular localization using a GFP-Xtc1 fusion shows that it localizes to both the nucleus (amino-terminal fusion) and the mitochondria (amino- and carboxi-terminal fusions) in vivo, which is consistent with Xtc1 having a function in both cellular compartments.

Oznaka: 0098080

DINAMIKA I GENETIKA BIOAKTIVNIH MOLEKULA

DYNAMICS AND GENETICS OF BIOACTIVE MOLECULES
Voditelj/ica projekta: dr. sc. Volker Magnus

Tel. ++385 1 4561 143   e-mail: [e-mail]

Suradnici na projektu:
Eduard Dolušić, magistar kem. znanosti, znanstveni novak
Branimir Klaić, doktor biol. znanosti, znanstveni savjetnik
Volker Magnus, doktor biol. znanosti, znanstveni savjetnik, voditelj projekta
Željko Marinić, magistar kem. znanosti, stručni suradnik

Branka Salopek-Sondi, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica

Kristina Wolsperger, dipl. inž. kemije, stručna suradnica

Tehnički suradnici:
Vladimir Vraneša

Program rada i rezultati na projektu:

Cilj rada na projektu je upoznavanje molekularne osnove biološke aktivnosti. Glavni rezultati postignuti su na ovim područjima:

- fiziologija, biokemija i kemija biljnih hormona,

- biokemija proteina,

- NMR spektroskopija spojeva od biološkog interesa.

Na području biljnih hormona nastavili smo istraživanje njihove uloge u metamorfozi oplođenog cvijeta (razvoj fotosintetskog sustava u lapovima) bijelog kukurijeka (Helleborus niger L.), eksperimentalnog modela koji obećava zanimljive rezultate o koordinaciji vegetativnog i generativnog razvoja u biljaka. U suradnji s inozemnim kolegama koji raspolažu potrebnim instrumentalnim metodama, istražujemo promjene u razini citokinina i giberelina u životnom ciklusu cvijeta i pokušavamo ih povezati s istovremenim fiziološkim procesima. Drugi dugoročni projekt na području biokemije biljnih hormona obuhvaća pripravu auksina koji sadrže dodatne funkcionalne skupine koje 1.) specifično utječu na biološku aktivnost ili 2.) omogućavaju vezanje na molekularne probe i makromolekularne nosače, a da se pri tom ne blokiraju strukturni elementi koji definiraju auksine. U istraživanjima biokemije proteina nastavlja se suradnja s grupom prof. L. Luck (Clarkson University, Potsdam, SAD) u kojoj je dr. B. Salopek-Sondi boravila na specijalizaciji. Zasad se proučavaju bakterijski proteini, kao priprema za rad na proteinima povezanim s fiziologijom biljnih hormona. Istraživanja na području NMR-spektroskopije uključuju kolege s Instituta te domaćih i stranih sveučilišta, a odnose se na strukturnu i preparativnu kemiju i na interakcije molekula u otopini.

Research programme and results:

The project addresses the molecular base of biological activity. In the report period, we focused on the following subjects:

- physiology, biochemistry and chemistry of plant hormones,

- protein biochemistry,

- NMR spectroscopy applied to compounds of biological interest.

In the area of plant hormones, we continued previous research on their role in the metamorphosis of fertilized flowers (development of a photosynthetic system in the sepals) of the Christmas rose (Helleborus niger L.), a model system promising new insights into the coordination of vegetative and generative development in plants. In collaboration with foreign colleagues who have access to the necessary instrumental methods, we are investigating the changes in the levels of cytokinins and gibberellins in the life cycle of a flower and are looking for causal links to simultaneous physiological processes. A second long-term project in plant hormone biochemistry comprises the design of auxins which contain additional functional groups which: 1) specifically influence biological activity or, 2.) permit coupling to molecular probes and macromolecular carriers without blocking the structural elements by which auxins are defined. In the area of protein biochemistry, we continued our collaboration with the group of prof. L. Luck (Clarkson University, Potsdam, USA) in which dr. B. Salopek-Sondi spent her post doctoral training. The present work on bacterial proteins is intended as a preparation for the future research on proteins involved in plant hormone physiology. The NMR-spectroscopic studies, including colleagues from the Institute and domestic and foreign universities, covered the structural and preparative chemistry of heterocycles, as well as molecular interactions in solution.

Oznaka: 0098081

MOLEKULARNA PATOFIZIOLOGIJA SEROTONERGIČNE TRANSMISIJE

MOLECULAR PAHTOPHYSIOLOGY OF SEROTONERGIC TRANSMISSION
Voditelj/ica projekta: dr. sc. Branimir Jernej

Tel. ++385 1 4561 150   e-mail: [e-mail]

Suradnici na projektu:
Zvonimir Bokulić, dipl. inž. kemije, mlađi asistent
Tatjana Bordukalo-Nikšić, magistrica biol. znanosti, asistentica, znanstveni novak
Lipa Čičin-Šain, doktorica biol. znanosti, viša znanstvena suradnica
Vedrana Filić, dipl. inž. molekularne biologije, znanstveni novak, do 30.6.2003.
Dubravka Hranilović, doktorica biol. znanosti, znanstvena suradnica
Branimir Jernej, doktor med. znanosti, znanstveni savjetnik, voditelj projekta
Jasminka Štefulj, magistrica biol. znanosti, asistentica, znanstveni novak

Tehnički suradnici:
Katarina Karlo
Vladimir Vraneša
Suradnici iz druge ustanove:
Francesc Artigas, Department of Neurochemistry, CSIC, Barcelona, Španjolska, konzultatnt
Melita Balija, doktorica med. znanosti, Hrvatski zavod za transfuzijsku medicinu, Zagreb
Laviola Giovanni, Institute of Health, Rim, Italija, konzultant
Mirko Šarlija, doktor med. znanosti, Klinička bolnica Merkur, Zagreb
Dieter Wildenauer, University of Bonn, Bonn, Njemačka, konzultant

Program rada i rezultati na projektu:

Na eksperimentalnoj razini nastavljen je razvoj i karakterizacija našeg animalnog modela: Wistar-Zagreb 5HT štakora s konstitucijski promijenjenom serotoninskom homeostazom. Istraživanja su obuhvatila testiranja anksioznog ponašanja kao i mjerenje razine serotonina i brzine njegovog metabolizma u diskretnim moždanim regijama (rezultati su prezentirani na sastanku COST-a "Brain Damage and Repair", Sveučilište u Uppsali). Mjerenjem razine proteinske ekspresije moždanih 5HT elemenata započeta su istraživanja u okviru zajedničkog projekta s Institutom za zdravlje iz Rima, Italija: "Serotonin and impulsive behavior".

Na kliničkoj razini nastavljena su istraživanja na bilateralnim projektima: ulozi serotonergičnog sustava u suicidu sa Sveučilištem u Muenchenu, te odnosu između strukture i ekspresije gena za serotoninski prijenosnik sa Sveučilištem u Bonnu. Rezultati asocijacijske studije polimorfizama 5HT prijenosnika u žrtava suicida objavljeni su u časopisu Biological Psychiatry – vodećem u svom području.

Research programme and results:

At the basic level development and further characterization of our rodent model: Wistar-Zagreb 5HT rat, with constitutionally altered serotonin system has continued. Research encompassed studies of anxiety-related behavior, and determination of serotonin levels and its turnover rate in discrete brain areas (reported at the COST meeting "Brain Damage and Repair, University of Uppsala). By performing protein expression studies of brain 5HT elements, we started research in the scope of the joint project "Serotonin and impulsive behavior" with Institute of Health, Rome, Italy.

At the clinical level, joint research with University of Muenchen on serotonergic alterations in suicide, and with University of Bonn on the relationship between serotonin transporter structure and expression, was proceeded. Results of the study on 5HT transporter polymorphisms in suicide victims were reported in Biological Psychiatry – a leading journal of the field.

Oznaka: 0098082