11 Temmuz 1991 tarihli (aet) 2568/91 sayılı komisyon tüZÜĞÜ

▼B

EK III

PEROKSİT DEĞERİNİN BELİRLENMESİ

1. 
   KAPSAM
   

Bu standart katı ve sıvı yağların peroksit değerlerinin belirlenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

2. 
   UYGULAMA ALANI
   

Bu standart hayvansal ve bitkisel sıvı ve katı yağlara uygulanabilir.

3. 
   TANIM
   

Peroksit değeri örnekte bulunan, potasyum iyodidi tanımlanan işletim koşulları altında oksitlendiren, kilogram başına aktif oksijenin mili değeri şeklinde ifade edilen miktardır.

4. 
   PRENSİP
   

Asetik asit ve kloroform içindeki çözeltide bulunan deney parçasına potasyum iyodid çözeltinin muamelesi. Standart hale getirilmiş sodyum tilosülfat çözeltisi ile birlikte serbest bırakılmış iodinin titrasyonu.

5. 
   ALET
   

Kullanılacak tüm araçlar cisimleri oksitlendirme ya da indirgemeden bağımsız olacaklardır.

Not: Zemin yüzeylerini yağlamayınız.

1. 
   3 ml cam kepçe
   
2. 
   yuvarlak boyunlu ve kapaklı, 250 ml civarında kapasiteli, önceden kurutulmuş ve saf, kuru kimyasal olarak reaksiyona girmeyen gaz ile (nitrojen ya da tercihen, karbon dioksit) doldurulmuş deney şişesi.
   
3. 
   0,1 ml olarak derecelendirilmiş 25 ya da 50 ml’lik cam ölçek.
   

6. 
   AYRAÇLAR
   

6.1 Analitik ayraç kalitede, saf kuru kimyasal olarak reaksiyona girmeyen gaz fokurdatarak oksijenden ayrıştırılmış kloroform.

6.2. Analitik ayraç kalitede, saf ►C1 kuru kimyasal olarak reaksiyona girmeyen gaz ◄ fokurdatarak oksijenden ayrıştırılmış buz halinde asetik asit.

6.3. Potasyum iyot, son zamanda hazırlanmış iyot ve iyodat’lardan bağımsız, doymuş suya benzer çözelti.

6.4. Sodyum tiosülfat, 0,01 ya da 0,002 ►C1 Mol/L ◄ kullanımdan hemen önce standardize edilmiş, standardize suya benzer çözelti.

6.5. 10 gr/l suya benzer dağılım, tabi çözünür nişastadan kısa bir süre önce hazırlanmış Nişasta çözeltisi.

7. 
   ÖRNEK
   

Örneğin ışıktan uzakta alınmasına ve saklanmasına özen gösterin ve tam olarak doldurulmuş soğuk ortamda hermetik olarak yuvarlak cam ya da mantar tıpaç ile kapatılmış cam kaplarda saklayın.

8. 
   USUL
   

Deney dağıtılmış gün ışığı yada yapay ışık altında gerçekleştirilmelidir. Cam bir kepçenin(5.1) içinde yahut bu mümkün değilse deney şişesi (5.2) içinde tahmin edilen peroksit değeri uyarınca aşağıdaki tabloya uygun olarak en yakın 0,001gr ile örneğin kütlesini tartın

▼B

Beklenen peroksit değeri (meq)	Test parçasının ağırlığı (gr)
0-12	5,0-2,0
12-20	2,0-1,2
20-30	1,2-0,8
30-50	0,8-0,5
50-90	0,5-0,3

Deney şişesinin(5.2) kapağını açın ve cam kepçedeki deney parçasını içine koyun. 10ml kloroform ilave (6.1) edin. Deney parçasını karıştırarak hızlı bir şekilde çözdürün. 15ml asetik asit ilave edin.(6.2) Sonra 1ml potasyum iyodit çözeltisi ilave edin.(6.3) kapağı hızlıca kapatın. Bir dakika çalkalayın, 15-25⁰C aralığında ışık almayan bir yerde tam olarak beş dakika dinlendirin.

75ml kadar damıtılmış su ilave edin. Serbest iyotu sodyum tiosülfat çözeltisi ile birlikte titrat edin. ►C1 (6.4) (tahmini değerler 12’nin altında ise 0,002 Mol/L, ve tahmini değer 12’nin üstünde ise 0,01 Mol/L çözelti) ◄ güçlüce çalkalayın, endikatör olarak nişasta çözeltisini (6.5) kullanın.
Aynı deney örneği hakkında iki saptama yürütün.
Eş zamanlı olarak açık bir deney yürütün. Eğer açık deneyin sonuçları ►C1 0,01 Mol/L sodyum◄ tiosülfat çözeltinin 0,05 ml.sini aşarsa kirli ayraçları değiştirin.
9. SONUÇLARIN AÇIKLANMASI
Peroksit değeri (PV) kilogram başına aktif oksijenin bindelik cinsinden açıklanır. Formül aşağıda verilmiştir:
PV= Vx T x 1000

M

V= mililitre cinsinden deney için kullanılan açık test dikkate alınarak doğrulanmış standardize edilmiş sodyum tiosülfat çözeltisi(6.4)

T = Kullanılan sodyum tiosülfat çözeltinin (6.4) ►C1 kati molaritesi◄

m = Deney parçasının gr cinsinden ağırlığı

İki saptamanın aritmetik ortalaması alınarak sonuç ortaya konur.

▼M6

EK IV

PARAFIN İÇERİĞİNİN KILCAL SÜTUN GAZ-SIVI KROMATOGRAFİ TARAFINDAN BELİRLENMESİ

1. 
   KAPSAM
   

Bu yöntem deney koşulları altında belli katı ve sıvı yağların Parafin içeriğinin belirlenmesi hakkındaki usulü tanımlar.
Özellikle baskı yoluyla elde edilen zeytin yağı ile çıkarılma yoluyla elde edilen zeytin ezmesi yağını birbirinden ayırmak için kullanılır.

2. 
   PRENSİP
   

Katı ve sıvı yağlara uygun bir iç standarda ilave olarak, sonra kromatografi tarafından su katılmış silis jel sütun üzerinde tasfiye edilmesi.

Deney koşulları altında ( karşıtlığı trigliseritlerinkinden daha az olan) ilk olarak yıkayıp giderilen parçanın eski durumuna getirilmesi, ve sonra kılcal sütun gaz-sıvı kromatografi tarafından doğrudan analiz.

3. 
   ARAÇLAR
   
   1. 
      25 ml Erlenmeyer şişesi
      
   2. 
      15 mm iç çapı ve 30-40 cm uzunluğu olan kromatografi için cam sütun
      
   3. 
      Doğrudan sütunun içine giren aşağıdakileri ihtiva eden sistemle teçhiz edilmiş kılcal sütunlu gaz-sıvı kromatografi
      
      1. 
         1⁰C içinde arzu edilen sıcaklığı sağlamaya elverişli termostat kontrollü sütunlar için fırın
         
      2. 
         Sütuna doğrudan giriş için soğuk enjektör
         
      3. 
         Alev-iyonlaşması detektörü ve konvektör-amplifikatör
         
      4. 
         Konvektör-amplifikatör ile çalışmaya uygun, değişken kağıt hızlarında çalışan ve yanıt süresi 1 saniyenin altında olan kayıt edici-integratör
         
      5. 
         10-15 metre uzunluğunda 0,25-0,32 iç çapa sahip SE-52 ya da SE-54 sıvısı ya da muadilleri ile içten kaplanmış, kalınlığı tek tip olarak 0.10-0.30 μm olan camdan ya da eritilmiş silisten mamul kılcal sütun
         

4. 
   Sütun üzerinde 10 μl enjeksiyon kapasitesine sahip sertleştirilmiş dokulu iğne ile teçhiz edilmiş mikro şırınga
   

4. 
   AYRAÇLAR
   

1. 
   Silis jel, 70/230 ağ gözü, madde 7754 Merck
   

Jeli 500⁰C deki fırına koyun ve dört saat bekletin. Soğumaya bırakın, sonra %2 su ilave edin. Homojenize bulamacı iyice çalkalayın. Kullanımdan önce karanlık bir yerde en az 12 saat saklayın.

4.2. Kromatografi için n-hekzan

4.3 Kromatografi için etil eter

4.4 Kromatografi için n-heptan

4.5 lauryl arachidate nin standart çözeltisi, hekzan içinde %0.1(m/v) (iç standart)

4.6 Taşıyıcı gaz: saf, gaz-sıvı kromatografi için hidrojen

4.7. Yardımcı gazlar:

- gaz-sıvı kromatografi için saf hidrojen,

- gaz-sıvı kromatografi için saf hava.

5. 
   USUL
   

1. 
   parafin friksiyonunun ayrılması
   

5.1.1 Kromatografik sütunun hazırlanması

%2 susuz n-hekzan ile sulandırılmış 15 gr silis jeli bekletin ve sütunun içine bırakın.

▼M6

Spontane olarak kararlı bir hal almasına izin verin. Sabitlenmeyi bir elektrikli karıştırıcı yardımıyla kromatografik bandı daha homojeniz kılarak tamamlayın. Kirlilikleri ortadan kaldırmak için 30 ml n-hekzanı süzdürün.

5.1.2. Sütun Kromatografisi

Tam olarak 500 mg örneği tartın ve 25 ml hacimli deney şişesinin içine koyun ve varsayılan parafin içeriğine bağlı olarak, zeytin yağı için 0,1 mg zeytin ezmesi yağı için 0,25-0,5 mg lauril arakidat olmak üzere uygun iç standardı ilave edin.

5.1. uyarınca 2 ml n-hekzan dilimlerinin yardımı ile hazırlanan örneği kromatografik sütuna transfer edin.
Çözeltisin emicinin üst seviyesinin 1 mm üzerinden akmasına müsaade edin. Sonra kromatografik elusyona başlayın; 99:1 de, her 10 saniyede yaklaşık 15 damla hızıyla akması esnasında (2,1 ml/dakika) 140 ml n-hekzan/etil eter karışımını toplayın.
Sonuçta ortaya çıkan parçayı çözelti neredeyse tamamen elimine edilene kadar dönel bir buharlaştırıcı içinde kurutun. Son kalan 2 ya da 3 ml çözeltisi nitrojenin zayıf bir tipi yardımı ile çıkarın, sonra 10 ml n-heptan ilave edin.

5.2. Gaz-sıvı kromatografik analiz

5.2.1. Başlangıç usulü, sütunun hazırlanması.

5.2.1.1. Sütunu gaz-sıvı kromatografa uydurun, giriş portunu sütun üzerindeki sisteme, çıkış portunu da detektöre bağlayın.

Gaz-sıvı kromatograf aygıtını kontrol edin ( gaz delikleri, detektör, katıt etkinliği, vs.)

5.2.1.2. Eğer sütunlar ilk kez kullanılacak ise hazırlanmaları tavsiye olunur. Sütunun içinden ince bir gaz akıntısı geçirin, sonra gaz-sıvı kromatografisini açın. Yavaş yavaş işletim derecesinin en az 20⁰C üzerine kadar ısıtın (not). Bu dereceyi en az iki saat için sağlayın. Sonra aygıtı işletim koşullarına göre ayarlayın ( gaz akışını, ışık parlaması, elektronik kaydediciye bağlanması, sütun için fırın sıcaklığının düzenlenmesi, detektörün düzenlenmesi, vs.) Analizin yapılması için gerekli olan hassasiyetin en ak iki katı ile sinyali kayıt edin. Esas hat herhangi bir uç göstermeksizin çizgisel olmalı ve sapma olmamalıdır.

Negatif düz çizgi halindeki sapma sütun bağlantılarının doğru olmadığını gösterir; pozitif bir sapma sütunun doğru bir şekilde hazırlanmadığını gösterir.

Not: Koşullandırma derecesini her zaman kullanılan eluent için belirtilen maksimum derecenin 20⁰C altında tut.
5.2.2 İşletim koşullarının seçimi.

5.2.2.1. Genellikle işletim koşulları aşağıdaki gibidir:

- Sütun Derecesi: Başlangıçta 80⁰C, 120⁰C’ye kadar 30⁰C/dakika arttırılır, daha sonra 340⁰C’ye kadar 50C/dakika ile artışı programlanır.

- Detektör derecesi: 350⁰C,

- Taşıyıcı gazın lineer hızı: hidrojen, 20-35 cm/saniye,

- Enstrüman hassasiyeti: değerdeki minimum azalmanın 4-16 katı,

- Kaydedici hassasiyeti: tartının en altından, 1-2 mV,

- Kağıt hızı: 30 cm/saat

- Enjekte edilen miktar: 0,5-1 μl çözelti.
Bu koşullar sütunun ve gaz-sıvı kromatografının özelliklerine uyması için(Kromatgramların aşağıdaki koşulları karşılamasını temin için: C32 iç standardının tutma süresi 25 ± 2 dakika olmalı ve balmumunun en çok belirgin zirvesi ölçeğin en alt seviyesinden %60-100 aralığında olmalıdır) modifiye edilebilir.
5.2.2.2. İlgili zirve alanlarının doğru değerlendirilmesini sağlayacak şekilde zirve entegrasyon parametrelerini belirle.

5.2.3. Analizin performansı

5.2.3.1. 1 μl çözeltisi 10 μl mikro-şırınga yardımı ile al; iğne boşalana kadar pistonu geri çek. İğneyi enjeksiyon sistemi için sok ve bir iki saniye sonra çabucak enjekte et. Yaklaşık beş saniye sonra iğneyi yavaşça çıkar.

5.2.3.2. parafin lar tamamen kaybolana kadar kaydı sürdürün.

▼M6
Esas hat her zaman gereken koşulları karşılamalıdır (5.2.1.2).
5.2.4. Zirve teşhisi

Tutma sürelerinden zirveleri teşhis etmek, bilinen tutma zamanlı parafin ların karışımları ile onları karşılaştırarak, aynı koşullara altında analiz edilmelidir.

Şekil 1 sızma zeytin yağının parafin kromatogramını vermektedir.
5.2.5. Nicel Analiz

5.2.5.1. C40- C60 arasındaki alifatik esterlerin ve iç standarda uygun zirve alanlarının entegratör yardımı belirlenmesi

5.2.5.2. Her bir esterin aşağıdaki formül uyarınca parafin içeriğinin, yağın mg/kg şeklinde belirlenmesi:
ester (mg/kg) = A_x · m_s· ►M9 1000◄

A_s · m

A_x = her esterin zirvesinin alanı;

A_s = lauril arakid zirvesi alanı;

m_s = miligram cinsinden eklenen lauryl arachidade nin kütlesi;

m = gram cinsinden belirleme için alınan örneğin kütlesi.

6. SONUÇLARIN İFADESİ

Farklı parafin içeriklerini, bu içeriklerin toplamı, yağın mg/kg cinsinden verilecek.

▼M6

EK BÖLÜM
Lineer gaz hızının belirlenmesi
Gaz-sıvı kromatografı normal işletim koşullarına ayarladıktan sonra içine 1-3 μl metan (propan) enjekte edin. Gazın sütuna enjekte edildiği andan zirvenin meydana geldiği ana (tM) kadar geçen süreyi ölçün.
Cm/saniye cinsinden lineer hız L/tM formülü ile elde edilir. Burada L sütunun cm cinsinden uzunluğu, tM ise saniye cinsinden ölçülmüş zamandır.

▼M6

SEKİL 1: Sızma zeytin yağının parafin kromatogramı

I.S.= Ester C32’nin iç standardı

1 = Ester C36

2 = Ester C38

3 = Ester C40

4 = Ester C42

5 = Ester C44

6 = Ester C46