11 Temmuz 1991 tarihli (aet) 2568/91 sayılı komisyon tüZÜĞÜ

▼M19

EK XB

ZEYTİN YAĞINDAN VE ZEYTIN EZMESİ YAĞINDAN YAĞ ASİTLERİNİN METİL ESTERLERİNİN HAZIRLANMASI

Aşağıdaki iki yöntem zeytin yağı ve zeytin ezmesi yağından yağ asitlerinin metil esterlerini elde etmek için önerilen yöntemlerdir.

Yöntem A: Potasyum hidroksitin soğuk metanolik çözeltisi ile trans-esterleşme

Yöntem B: Sodyum metilatın metanol içerisinde ısıtılarak metilasyonu ve asit ortamında esterleşme.

Her yöntem belirlenecek analitik parametreler dahilinde ve aşağıda belirtilen yağ kategorilerine uygulanacaktır:

(a) Asıl ve teorik trigliserit içerikleri arasındaki farkın ECN42(.ECN42) ile belirlenmesi:

— yöntem A, yağı silis jel sütunun içerisinden geçirerek saflaştırdıktan sonra tüm yağ kategorileri örneklerine uygulanacaktır;
(b) yağ asitleri birleşenlerinin belirlenmesi:
— yöntem A aşağıdaki yağ örneklerine direk olarak uygulanacaktır:

— asi oranı %3,3’den aşağı olan sızma zeytin yağları,

— rafine zeytin yağı,

— zeytin yağı (sızma zeytin yağı ile rafine zeytin yağı karışımı),

— rafine pirina yağı,

— pirina yağı (sızma zeytin yağı ve pirina yağı karışımı);

— yöntem B aşağıdaki yağ örneklerine direk olarak uygulanacaktır:
— asit oranı %3,3’den yüksek olan sızma zeytin yağları ,

— ham pirina yağı;

(c) yağ asitlerinin trans-izomerlerinin saptanması:

— yöntem A aşağıdaki yağ örneklerine direk olarak uygulanacaktır:

— asit oranı %3,3’den aşağı olan sızma zeytin yağları,

— rafine zeytin yağı,

— zeytin yağı (sızma zeytin yağı ile rafine zeytin yağı karışımı),

— rafine pirina yağı,

— pirina yağı (sızma zeytin yağı ve pirina yağı karışımı);

— yöntem A aşağıdaki yağ örneklerine silis jel sütunun içerisinden geçirerek saflaştırıldıktan sonra uygulanacaktır:

— asit oranı %3,3’den yüksek olan sızma zeytin yağlar ,

— ham pirina yağı;

YAĞ ÖRNEKLERİNİN SAFLAŞTIRILMASI

Gerektiği durumlarda, örnekler IUPAC 2.507 sayılı yöntemde açıklandığı gibi silis jel sütunun içinden geçirilerek ve hekzan/dietil eter (87:13, v/v) ile yıkayıp giderilerek saflaştırılır.

Ayrıca, silis jel faz kartuşları üzerinde katı-safha çıkarması da kullanılabilir. Silis jel kartuşu(1 g, 6 ml) vakumlu yıkayıp giderilme aleti içerisine konularak 6ml hekzan ile yıkanır. Vakum, sütunun kurumaması için serbest bırakılır ve 0,5 ml hekzan içerisinde yağ çözeltisi (0,12 g kadar) sütunun içerisine konulur ve vakumlanır. Çözelti aşağı çekilir ve vakum altında 10 ml hekzan/dietil eter(87:13 v/v) ile yıkayıp giderilir. Birleşmiş özütler homojenize olur ve iki eşit hacimde bölünür. Bir parça, dönel buharlaştırıcıda indirgenmiş basınçta oda sıcaklığında kurutulur. Pirina 1 ml heptan içerisinde eritilir ve çözelti GC ile yağ asidi analizine hazır olur. İkinci parça buharlaştırılır ve pirina 1 ml asetonu içerisinde eritilerek gerekirse HPLC ile trigliserid analizine hazır hale gelir.

▼M19

YAĞ ASİTLERİNİN METİL ESTERLERİNİN HAZIRLANMASI YÖNTEMLERİ

1. Yöntem A: Potasyum hidroksitin soğuk metanolik çözeltisi ile trans-esterleşmesi

1.1. Amaç

Bu hızlı yöntem zeytin yağlarına ve bağımsız yağ içeriği %3,3’ten az olan pirina yağlarına uygulanabilir. Bağımsız yağ asitlerinin potasyum hidroksit ile esterleşme yapılmaz. Yağ asitlerinin etil esterleri, gliseridik esterlerden daha az oranda trans-esterize olurlar ve sadece kısmi olarak metilleştirilebilirler.

1.2. Kural

Metil esterler metanolik potasyum hidroksit ile sabunlaşmadan önce ilk safhada -esterleşme ile oluşurlar. (ISO-5509:2000 başlık 5, IUPAC başlık 5 yöntem 2.301).

1.3. Ayraçlar

%0,5’ten (m/m) fazla su içermeyen metanol.

Kromatografik kalitede heptan.

Potasyum hidroksit, ortalama 2 N metanolik çözelti: 100 ml metanolde 11,2 g potasyum hidroksit eriterek yapılmış.

1.4. Alet

Vidalı kapaklı, kapağı PTFE ekli deney tüpü(5 ml hacminde) derecelendirilmiş veya otomatik pipet, 2 ml ve 0,2 ml

1.5. Usul

5 ml’lik vidalı kapaklı deney tüpü içerisine 0,1 g yağ örneği koyun. 2 ml heptan ekleyin ve çalkalayın. 0,2 ml 2 N metanolik hidroksit çözeltisi ekleyin, ve kenarları PTFE ekli kapağı sıkıca kapatın ve 30 saniye için güçlüce çalkalayın. En üst katman şeffaflaşana kadar bırakın. Metil ester içeren en üst katmanı süzün. Heptan çözeltisi gaz kromatografın içerisine enjekte edilmeye uygundur. Gaz kromatografik analizine kadar bu çözeltisin buzdolabında saklanması uygun görülür. çözeltisin 12 saatten fazla saklanması uygun değildir.

2. Yöntem B: Sodyum metilatın metanol içerisinde ısıtılarak metilasyonu ve asit ortamında esterleşme

2.1. Amaç

Bu hızlı yöntem zeytin yağlarına ve bağımsız yağ içeriği %3,3’ten fazla olan pirina yağlarına uygulanabilir.

2.2. Kural

Bağımsız yağ asitlerinin ve gliseritlerin alkalin metanolizini nötralizasyonu ve takibinde yağ asitlerinin asit ortamında esterleşmesi (IUPAC yöntem 2.301 başlık 4.2).

2.3. Ayraçlar

• 
  kromatografik kalitede heptan,
  
• 
  %0,05 (m/m) den daha fazla su içermeyen metanol,
  
• 
  sodyum metilat, 0,2 N metanolik çözelti: 5 g. sodyumu 1000 ml metanol içerisinde eritin (ticari çözeltilerden hazırlanabilir),
  
• 
  fenolfitalein, %0,2 matanolik çözelti,
  
• 
  sülfürik asit, 1 N metanolik çözelti içerisinde: 100 ml metanol içerisine 3 ml %96 lık sülfürük asit ekleyin,
  
• 
  su içerisinde doymuş sodyum klorit çözeltisi.
  

2.4. Alet

— 50 ml düz zeminli hacimli, ucun ince ve hacimli boyunlu,

▼M19

• 
  geri akmalı kondensatör: şişenin boynuna uygun zemin eklemli hava kondensatörü (1m uzunluğunda),
  
• 
  kaynatma talaşları,
  
• 
  cam huni.
  

2.5. Usul

0,25 g. yağ örneğini 50 ml.lik zemin boyunlu hacimli şişeye koyun. Huninin yardımı ile 10ml metanol içerisinde 0,2 N sodyum metilat ekleyin ve kaynatma talaşlarını da ekleyin. çözelti 10 dakika içerisinde şeffaf hale gelecektir. Bu tepkime 15 dakika içerisinde tamamlanacaktır. Şişeyi ateşten indirin, geri akma sonlanana kadar bekleyin, kondensatörü çıkarın ve 2 damla fenolfitalein çözeltisi ekleyin. çözelti renksizleşene kadar birkaç ml metanol içerisinde 1N sülfürik asit ekleyin ve sonra da üzerine 1 ml daha ekleyin. Kondensatörü iliştirin ve 20 dakika tekrar kaynatın. Ateşten indirin ve şişeyi akan su altında soğutun. Kondensatörü çıkarın ve 20 ml doymuş sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve çalkalayın. 5 ml. heptan ekleyin, şişenin ağzını kapatın ve 15 saniye için güçlüce çalkalayın.

İki faz ayrılana kadar oturmasını bekleyin. Suya benzer katman şişenin boynunun alt noktasına gelen kadar doymuş sodyum klorür çözeltisi ekleyin. Metil ester içeren üst katman şişenin boynuna dolar. Bu çözelti GC içerisinde şırıngalanmak için hazırdır.

Uyarı: B yöntemi ile metilasyon kapak altında yapılmalıdır..

2.6. B yöntemini ile metilasyona alternatif

2.6.1. Yöntem C

2.6.1.1. Kural analize tabi olan yağlı kütle metanol-hidro-klorik asit ile ağzı kapalı küçük şişe içerisinde 100 °C de muamele görür.

2.6.1.2. Alet

- 5 ml.lik sağlam cam küçük şişe (yüksekliği 40-45 mm,

çapı 14-16 mm).

- 1 ve 2 ml.lik derecelendirilmiş pipet.

2.6.1.3. Ayraçlar

%2’lik metanol içerisinde hidroklorik asit çözeltisi. Bu gazlı hidroklorik asit ve susuz metanolden hazırlanır. (Not 1).

Kromatografik kalitede hekzan.

Not 1: Metanol içerisinde ticari hidrojen klorür çözeltisi kullanılabilir. Az miktarda gazlı hidroklorik asit laboratuar ortamında ticari çözeltiden(p=1,18) konsantre sülfürik asit çıkarma yöntemi ile kolayca hazırlanabilir. Hidroklorik asit metanol tarafında hızlıca emildiği için, eritilmesi durumunda gerekli önlemleri almak gerekmektedir, yani gazı ağzı sıvının yüzeyine belli belirsizce değecek şekilde tersine çevrilmiş huni içerisinden geçirin. Önceden büyük miktarlarda metanolik hidroklorik asit hazırlanabilir çünkü bu karanlık yerde ağzı kapalı bir şekilde cam şişelerde muhafaza edilebilir. Ayrıca bu ayraç, asetil klorürün susuz metanol içerisinde eritilmesi ile de hazırlanabilir.

2.6.1.4. Usul

- Daha önceden sodyum sülfat üzerinde kurutulmuş ve filtre edilmiş 0,2 g yağlı kütleyi ve 2 ml hidroklorik asit-metanol çözeltisini küçük cam şişe içerisine koyun. Küçük şişeyi ısıtma yöntemi ile kapatın.

- Şişeyi 100 °C’de 40 dakika tutun.

- Şişeyi akan su altında soğutun, kapağını açın ve 2 ml saf su ve 1 ml hekzan ekleyin. - - - Santrifüjleyin ve hazır olan hekzan fazını çıkarın.