11 Temmuz 1991 tarihli (aet) 2568/91 sayılı komisyon tüZÜĞÜ

Şekil 1

Rafine edilmemiş zeytin yağının sterol fraksiyonunun gaz kromatogramı

▼B

Şekil 2

Rafine edilmiş zeytin yağının sterol fraksiyonunun gaz kromatogramı

▼B

EK VI

ERİTRODİOL VE UVAOLLERİN BELİRLENMESİ
GİRİŞ

Eritrodiol (genellikle glikol erirodiol ve uvaol birlikte anlaşılır) sabunlaşmayan fraksiyonun bileşenidir, yağlı madde türlerinden bazılarının özellikleridir. Başta presle sıkılmış zeytin yağı ve üzüm çekirdeği yağı olamk üzere diğer yağlardan nispeten daha yüksek konsantrasyonlarda çözelti ile çıkarılmış zeytin yağlarında bulunur. Dolayısıyla eritrodiolün mevcut olması çözelti ile çıkarılmış zeytin yağının olduğunu gösterir.

1. 
   KAPSAM
   

Yöntem yağlı maddede erirodiolün tespit edilmesi usulünü tanımlar.

2. 
   YÖNTEMİN PRENSİBİ
   

Yağlı madde etonolik çözelti içindeki potasyum ►C1 hidroksit ile sabunlaşır. Sabunlaşmayan fraksiyon sonra dietil eter ile çıkarılır ◄ ve alumina sütunu üzerinden geçirilerek saflaştırılır.
Sabunlaşmayanlar, sterol ve eritrodiol fraksiyonlarına karşılık gelen bandlar ayrılıncaya kadar silis jel plaka üzerinde ince katman kromatografisine maruz bırakılırlar. Steroller ve eritrodiol plakadan alınarak trimetilsilyl etere dönüştürülür ve karışım gaz kromatografisi tarafından analiz edilir.
Sonuç eritrodiol ve steroller karışımı içindeki eritrodiolün oranı olarak açıklanır.

3. 
   ARAÇLAR
   

Ek V’te tanımlanan araçlar (sterollerin içeriğinin belirlenmesi

4. 
   AYRAÇLAR
   
   1. 
      4.1. Ek V’te tanımlanan ayraçlar (sterollerin içeriğinin belirlenmesi).
      
   2. 
      Referans eritrodiol çözeltisi, kloroform içinde %0,5 çözelti.
      

5. 
   USUL
   
   1. 
      Sabunlaşmayanların hazırlanması.
      

Ek V’in 5.1.2.’nci fıkrasında belirtildiği gibi.

2. 
   Eritrodiol ve sterollerin ayrılması
   
   1. 
      Ek V’in 5.2.1.’nci fıkrasına bakınız.
      
   2. 
      Ek V’in 5.2.2.’nci fıkrasına bakınız.
      
   3. 
      Kloform içinde sabunlaşmayanların %5’lik çözeltisini hazırlayın.
      

0,1 ml’lik mikro şırınga kullanarak, mümkün olduğu kadar ince ve tek tip olarak boyanın alt kenarın alt kıyısından yaklaşık 1,5 cm mesafede 0,3 ml çözeltisi kromatografik tabakayı çizgiler halinde boyayın.

Plakanın bir ucuna bir kaç mikrolitre kolesterol ve eritrodiol çözeltisini referans olarak hizmet vermek üzere yerleştirin.

4. 
   Plakayı 5.2.1’de belirtilen şekilde hazırlanan gelişim odacığına yerleştirin. Ortam sıcaklığı 20⁰C civarında olmalıdır. Odacığı çabucak bir örtü ile kapat ve çözelti cephenin plakanın üst kıyısından 1 cm kadar yaklaşana kadar yıkanıp giderilmesine müsaade et. Plakayı gelişim odacığından çıkar ve çözeltisi sıcak hava akımıyla buharlaştır.
   
5. 
   2,7- dikloroflorosken çözeltisini hafifçe ve tek tip olarak plakaya püskürtün. Morötesi ışık altında plaka gözlemlendiğinde sterol ve eritrodiol bandlar referanslar ile aynı hizada olması ile ayırt edilebilir. Florasanın kenarları dışında nokta ile işaretleyiniz.
   

▼B

6. 
   Metal bir spatula kullanarak silis jeli işaretlenmiş alandan kazıyın. Materyali plakadan alarak 50 ml’lik deney şişesine boşaltın. 15 ml sıcak kloroform ilave edin, iyice karıştırın ve toplaşık cam diskli huniden geçirerek filtre edin, böylece silis jel filtreye transfer olur. Filtre edilmiş materyali 100 ml’lik deney şişesinde toplayarak üç defa sıcak kloroform (her defasında 10 ml) ile yıkayın. Filtre edilmiş materyali 4-5 ml hacme kadar buharlaştır, 10 ml’lik konik dipli santrifüj tüpüne transfer edin, nitrojen akımı ile yavaşça kurutun ve tartın.
   

3. 
   Trimetilsil esterlerin hazırlanması.
   

Ek V’in 5.3. fıkrasında tarif edildiği gibi.

4. 
   Gaz kromatografik analiz
   

Yöntem yukarıda fıkra 5.4’de tarif edildiği gibi. Analizdeki gaz kromatografın işletim koşulları sterol analizi gerçekleştirebilecek ve TMSE’yi eritrodiol ve uvaolden ayırtedebilecek özellikte olmalıdır.
Örnek bir kere enjekte edildikten sonra sterol bulunana, eritrodiol ve uvaol yıkanıp gidene kadar kayda devam edin. Sonra zirveleri ( eritrodiol ve ß-sitosterola göreli uvaol tutma süreleri yaklaşık sırasıyla 1,45 ve 1,55 dir) ayırt et ve steroller için olan alanları hesapla.

6. 
   SONUÇLARIN AÇIKLANMASI
   

Eritrodiol % =

A₁ = eritrodiolün zirve alanı►M6 -----------------◄;

A₂ = uvaolün zirve alanı ►M6 -----------------◄;

Σ A _sterols = sterollerin toplam zirve alanı ►M6 -----------------◄.
Sonuçları virgülden sonra bir ondalık ilerletin.

▼B

EK VII

KATI VE SIVI YAĞLARIN TRİGLİSERİDLERİN İKİNCİ POZİSYONUNDAKİ DOYMUŞ YAĞ ASİTLERİNİN İÇERİĞİNİN BELİRLENMESİ

1. 
   KAPSAM
   

Bu standart gliserinin 2-pozisyonunda (yada iç pozisyon) esterleşen katı ya da sıvı yağın yağ asitlerinin bu fraksiyonunun kompozisyonunun belirlenmesi için olan yöntemi anlatır.

2. 
   UYGULAMA ALANI
   

Bu standart, pankreas özsuyunda bulunan yağları eritici enzim (lipaz) hareketinin özelliklerinden dolayı 45⁰C’nin altında erime noktası olan katı ve sıvı yağlara uygulanır.
Belli miktarlarda aşağıda sayılanları içeren katı ve sıvı yağlara istisnasız uygulanmaz: 12 ya da daha az karbon atomlu yağ asitleri (Hindistan cevizi ve hurma-çekirdeği yağları, tereyağı) ya da yüksek doymamış yağ asitleri ( dört duble hadden daha fazlası) 20 ya da daha fazla karbon atomu içeren (balık yada deniz hayvanlarının yağları), ya da asit grubu dışında oksijenle doymuş gruplar içeren yağ asitleri.

3. 
   PRENSİP
   

Katı ve sıvı yağ asitlerinin bir çözelti içinde mümkün notralizasyonu. Bir alumina sütundan geçirerek saflaştırma. Belirlenme süresi esnasında trigliseridlerin pankreas özsuyunda bulunan yağları eritici enzim tarafından kısmi hidrolizi. İnce katman kromatografisi ile monogliseridlerin ayrılması ve bu monogliseridlerin metanalizi. Sıvı-gaz kromatografisi tarafından bu metil esterlerin analizi.

4. 
   ARAÇLAR
   
   1. 
      Yuvarlak dipli 100 ml.lik deney şişesi.
      
   2. 
      Yuvarlak dipli, yer eklemli 25 ml.lik deney şişesi.
      
   3. 
      4.2.’deki deney şişesine bağlanmak üzere 1 metrelik hava kondansatörü.
      
   4. 
      250 ml.lik konik deney şişesi.
      
   5. 
      50 ml.lik deney şişesi.
      
   6. 
      500 ml.lik ayrım hunisi.
      
   7. 
      13 mm iç çapı, 400 mm uzunluğu olan sırlanmış cam disk ve musluk ile teçhiz edilmiş Kromatografik cam sütun.
      
   8. 
      Zemin cam tapası olan 10 ml.lik santrifüj tüpü.
      
   9. 
      0,05 ml olarak derecelendirilmiş 5 ml.lik cam ölçek.
      
   10. 
       İnce bir iğne ile teçhiz edilmiş 1 ml.lik hipodermik şırınga.
       
   11. 
       3-4 μl’lik damlalar verebilecek mikro şırınga.
       
   12. 
       İnce katman kromatografisi için dağıtıcı.
       
   13. 
       İnce katman kromatografisi için 20x20 cm.lik cam plakalar.
       
   14. 
       İnce katman kromatografisi için 20x20 cam plakalara uygun, zemin cam kapağı olan, cam gelişim tankı.
       
   15. 
       İnce katman kromatografisi için sprey.
       
   16. 
       103 ± 2 °C’ye ayarlanmış fırın.
       
   17. 
       0,5 °C’ler halinde 30 ve 45 °C arasında ayarlanabilir termostat.
       
   18. 
       Dönel buharlaştırıcı.
       
   19. 
       Santrifüj tüpünün güçlü sallamalarına müsaade edecek titreşimli elektrikli çalkalayıcı.
       
   20. 
       İnce katman plakaları incelemek için morötesi lamba.
       

Lipaz aktivitesinin kontrolü için

21. 
    pH metre.
    
22. 
    Spiral karıştırıcı.
    

▼B

23. 
    5 ml.lik cam ölçek
    
24. 
    Kronometre
    

Lipazın hazırlanması için:

25. 
    hetorojenik maddelerin karışımı ve dağıtılmasına uygun laboratuar karıştırıcısı.
    

5. 
   AYRAÇLAR
   

1. 
   n-hekzan, eğer bulunamıyorsa, hafif petrol (bp 30-50 °C), kromatografik kalitede.
   
2. 
   2-propanol, ya da etanol, %95 (v/v) analitik ayraç kalitesinde.
   
3. 
   2-propanol, ya da etonol, 1/1 suya benzer çözelti.
   
4. 
   Peroksitten bağımsız dietil eter.
   
5. 
   Aseton
   
6. 
   Formik asit, en az %98 (m/m).
   
7. 
   Gelişim çözelti: n-hekzan (5.1), dietil eter (5.4) ve formik asit’in (5.6) 70/30/1 (v/v/v) oranlarında karışımı.
   
8. 
   Kromatografi için aktive edilmiş alumina,nötr, derece Brockmann I.
   
9. 
   Silis tozu, sargı ile birlikte ince katman kromatografisi için uygun kalitede.
   
10. 
    Pankreas lipaz, uygun kalitede(not 1 ve 2)
    
11. 
    Sodyum hidroksit, 120 gr/l suya benzer çözelti.
    
12. 
    Hidroklorik asit, suya benzer ►C1 çözelti 6 Mol/l ◄
    
13. 
    Kalsiyum klorid (CaCl₂), 220 gr/l suya benzer çözelti.
    
14. 
    Sodyum Kolat (enzimatik kalitede), 1 gr/l suya benzer çözelti.
    
15. 
    Tampon çözelti: 1 M tris- idroxymetilaminomethane çözeltisi pH 8’e hidroklorik asit (5.12) ilavesi ile getirilir (potensiyemetre ile kontrol et).
    
16. 
    Fenolfitalein, % 95 (v/v) etanol içindeki 10 gr/l çözelti.
    

17. 
    2,7- dikloroflorosken, %95 etanol (v/v) içindeki 2 gr/l çözeltisi her 100 ml için bir damla 1 N sodyum hidroksit çözeltisi ilave ederek yavaşça alkalinleştirilmiş.
    

Lipaz aktivitesinin kontrolü için:

18. 
    Nötralize yağ
    
19. 
    Sodyum►C1 hidroksit 0,1 M◄ suya benzer çözeltisi
    
20. 
    Sodyum kolat (enzimatik kalitede), 200 gr/l suya benzer çözelti.
    
21. 
    Arap zamkı, 100 gr/l suya benzer çözelti.
    

6. 
   ÖRNEĞİN HAZIRLANMASI
   

Örneğin asitliliği %3’ün altında ise EK II uyarınca belirlenir, 6.2. uyarınca alumina üzerinden doğrudan saflaştırılır.
Eğer örneğin asitliliği %3’ün üzerindeyse Ek II uyarınca belirlenir, 6.1. uyarınca çözeltinin mevcudiyetinde alkali tarafından nötralize edilir, daha sonra 6.2. uyarınca alüminanın üzerinden geçirilir.
6.1. çözeltinin mevcudiyetinde alkali tarafından nötralizasyon

Ayırıcı huninin(4.6.) içine 10 gr ham yağ ve 100 ml hekzan (5.1), 50 ml 2-propanol (5.2), fenolfitalein çözeltisinden (5.16) birkaç damla ve yağın serbest asitliliğinin %0,3 fazlasına karşılık gelen miktarda sodyum hidroksit çözeltisi (5.11). Bir dakika kuvvetlice çalkalayın, 50 ml damıtılmış su ilave edin, tekrar çalkalayın ve durulması için bırakın.

Ayırımdan sonra, dipteki sabun katmanını çıkartın. Aynı zamanda diğer ara katmanları da (zamk, çözülmeyen madde) çıkartın. Nötralize yağın hekzan çözeltisini 25-30 ml.lik 2-propanol çözeltisi(5.3) porsiyonları ile phenolphthalein’in pembe rengi kaybolana kadar yıkayın.
▼B
Dönel buharlaştırıcıda (4.18) hekzanın çoğunu vakum altında damıtma yoluyla çıkartın, yağı saf nitrojen akımının yardımıyla 30-40°C’de vakum altında hekzan tamamen çıkarılana kadar kurutun.
6.2. Alüminadan geçerek saflaştırma

50 ml hekzan(5.1) içinde 15 gr aktive edilmiş alümina (5.8) süspansiyonu hazırla ve karıştırarak kromatografik sütuna(4.7) dök. Alüminanın düzenli olarak durulmasına izin ver, ve çözelti seviyesinin soğurganın 1-2 mm üzerine kadar düşmesine müsaade et. 25 ml hekzan(5.1) içinde 5 gr yağ çözeltisini dikkatlice sütuna dök; Sütundan çıkan tüm artık sıvıyı yuvarlak dipli bir deney şişesinde(4.1) topla.

7. 
   Kromatografik plakaların hazırlanması
   

Cam plakaları (4.13) etanol, ince petrol ve aseton ile yağlı maddenin kalıntılarını ortadan kaldırmak için yıkayın.

Konik bir deney şişesi içine(4.4) 30 gr silis tozu (5.9) koyun. 60 ml damıtılmış su ilave edin. Ağzını kapatın ve güçlüce 1 dakika kadar çalkalayın. Bulamacı derhal dağıtıcıya(4.12) transfer edin ve plakaları 0,25 mm kalınlığında bir tabaka ile kaplayın.

Plakaları havada 15 dakika kurutun ve sonra 103 ± 2 °C’ye ayarlanmış fırında (4.16) bir saat tutun. Plakaları kullanmadan önce kurutucuda oda sıcaklığına kadar soğutun.

Hazırlanmış plakalar ticari olarak bulunmaktadır.

8. 
   USUL
   

1. 
   Pankreatik lipaz ile hidroliz.
   

Santrifüj tüpüne(4.8) 0,1 gr hazırlanmış örneği tartın ve eğer örnek sıvı yağ ise aşağıdaki gibi ilerleyin.

20 mg lipaz (5.10) ve 2 ml tampon çözelti(5.15) ekleyin. Dikkatli ve iyice karıştırın, sonra 0,5 ml sodyum kolat çözeltisi (5.14) ve 0,2 ml Kalsiyum klorid çözeltisi(5.13) ilave edin. Zemin kapağı ile tüpü kapatın ve (kapağı ıslatmaktan kaçınarak) tedbirli bir şekilde çalkalayın ve tüpü derhal 40 ± 0,5 °C sağlayan termostata koyun ve el ile bir dakika çalkalayın.

Tüpü termostattan çıkarın, elektrikli çalkalayıcı(4.19) ile 2 dakika güçlü titreşimlerle sarsın.

Akan su ile aniden soğutun; 1 ml hidroklorik asit (5.12) ve 1 ml dietil eter (5.4) ilave edin. Kapatın ve elektrikli çalkalayıcı ile güçlü bir şekilde karıştırın. Durmasına müsaade edin ve şırınga(4.10) ile organik katmanı, eğer gerekliyse santrifüjden sonra, alın.

8.2. Monogliseridlerin ince katman kromatografisi tarafından ayrılması

Kromatografik plakaya mikro şırınga (4.11) ile kalıntıyı dip kenarından 1,5 cm mesafede ve ince tektip çizgi halinde, mümkün olduğunca dar olarak uygula. Plakayı tam dolu gelişim tankının içine koy ve 20°C’de plakanın üst kıyısına 1 cm mesafeye kadar gelişim çözeltisi (5.7) ile geliştir.

Plakayı tankın ısısında hava ile kurut, 2,7- dikloroflorosken çözeltisi (5.17) ile püskürt. Monogliserid bandını (yaklaşık 0,035 R_f) morötesi ışık(4.20) altında ayırt et.
8.3. Monogliseridlerin gaz-sıvı kromatografisi tarafından analizi

8.2.’de elde edilen bandı bir spatulanın yardımı ile ( asas hat üzerinde kalan komponentleri almaktan kaçınarak) alın ve metilasyon deney şişesine (4.2) transfer edin.

Toplanmış silise Ek X B’de tanımlanan, monogliseridleri metil esterlere çevirecek alternatif ile muamele edin, ve sonra esterleri Ek X A’da tanımlandığı gibi gaz kromatografisi ile inceleyin.

9. 
   SONUÇLARIN AÇIKLANMASI
   

2-pozisyondaki yağ asidi kompozisyonunu ondalık kesir şeklinde hesapla (not 3).

10. 
    NOTLAR
    

Not 1: Lipaz aktivitesinin kontrolü

▼B

165 ml arap zamkı çözeltisi(5.21), 15 gr ezilmiş buz ve 20 ml nötralize yağı karışımını uygun bir çalkalayıcı içinde çalkalayarak yağ emülsiyonu hazırlayın.
Deney şişesi(4.5) içine bu emülsiyondan 10 ml koyun, ardından0,3 ml sodyum kolat çözeltisi(5.20) ve 20 ml damıtılmış su ilave edin.
Deney şişesini 37 ± 0,5 °C sağlayan termostata koyun (not 4); pH metrenin(4.21) elektrodotlarını ve spiral karıştırıcıyı(4.22) içine koyun.
Bir cam ölçekle (4.23) pH 8,5’e ulaşıncaya kadar sodyum hidroksit çözeltisini (5.19) damlatın.

Lipazın suza benzer çözeltisinden yeteri kadar ilave edin(aşağıya bak). pH metre 8,3 ü ►C1 gösterir göstermez◄ anölçeri (4.24) çalıştırın ve sodyum hidroksit (5.19) çözeltisine pH 8,3’ü sağlayacak oranda damlatın. Her dakikada tüketilen alkali çözeltinin hacmini okuyun.

Gözlemleri bir grafik formunda, Apsis ve pH’ın kararlılığını sağlamak için gerekli olan alkali çözeltinin ml.sini kullanarak, kayıt edin. Lineer bir grafik elde edilmelidir.
Yukarıda belirtilen lipaz süspansiyonu su içinde 1 bölü 1000 (m/m) şeklinde olacaktır. Her test için bundan yeterince kullanılacak ve böylece yaklaşık 1 ml alkali çözeltisi dört- beş dakika içinde tüketilecektir. Genellikle 1-5 ml toz gereklidir.
Lüpaz ünitesi dakikada 10μ-eşitliği asiti serbest bırakan enzim miktarı olarak tanımlanabilir. Sonra tozun kullanıldığı A aktivitesi, mg başına lüpaz ünitesi şeklinde aşağıdaki formül uyarınca ölçülür:
A= V x 10

M
V, grafikten hesap edilen, bir dakikada tüketilen sodyum hidroksit çözeltinin(5.19) sayısı, m deneyde kullanılan tozun mg cinsinden kütlesi.

Not 2: Lipazın hazırlanması
Tatmin edici lipaz aktivitesine sahip olan lipazlar ticari olarak bulunmaktadır. Fakat laboratuarda aşağıda belirtildiği gibi hazırlamak da mümkündür:
5 kg taze domuz pankreasını 0°C ye soğutun; çevreleyen katı yağı ve bağ dokusunu ayırın ve blender içinde ezerek macun kıvamında sıvı elde edin. Bu macunu karıştırıcı (4.25) ile 4-6 saat 2,5 l susuz aseton ile karıştırın ve santrifüj edin. Aynı hacimde aseton ile üç defa, sonra iki defa l/l (v/v) aseton ve dietil eter karışımı ile ve iki defa da dietil eterle arta kalanı çıkarın.
Ezmeyi 48 saat kararlı toz elde etmek için vakumda kurutun ve buzdolabında saklayın.
Not 3: Aynı örneğin toplam yağ asitlerinin kompozisyonunu belirlemek, asitlerin 2-pozisyonda olanlarla kıyas edilmesinin elde edilen rakamların yorumlanmasına yardımcı olacağından her durumda tavsiye edilir.
Not 4: Hidrolizin derecesi sıvı yağ kullanılacağından 37 °C’ye ayarlıdır. Bununla birlikte erime derecesi 45 °C’ya kadar olan katı yağların incelenmesi için derece deney örneği için 40 °C’ye ayarlanır.

▼B

EK VIII
▼C1
TRİLİNOLEİN İÇERİĞİNİN BELİRLENMESİ

▼B

1. 
   KAPSAM
   

Zeytin yağı içindeki trigliseridin kompozisyonu ►C1 karşılığı anlamında◄ yüksek performanslı sıvı kromatografi tarafından karbon numarasının belirlenmesi.
►C1 Mevcut yöntem ◄ bitkisel yağların molekül ağırlıkları ve doymamışlık derecelerini kullanarak trigliseridlerin kompozisyonlarını nicel belirleme ve ayrılma yöntemini, onların eşdeğer karbon numaralarının fonksiyonu olarak tanımlamıştır.(not 1 e bakın).

2. 
   UYGULAMA ALANI
   

►C1 Bu yöntem◄ uzun-zincir yağ asitlerinin trigliseridlerini içeren tüm bitkisel yağlara uygulanır. Metot özellikle başlıca doymamış yağ asidi olarak oleik asit içeren özellikle zeytin yağı gibi bitkisel yağlardaki küçük miktarlardaki yarı-kuruyan yağların (linoleik asit açısından zengin) tespiti için kullanılır.

3. 
   PRENSİP
   

Trigliseridlerin eşdeğer karbon numaralarına göre yüksek performanslı sıvı kromatografi (ters çevrilmiş faz kutuplu) tarafından ayrılması ve kromatogramların yorumlanması.

4. 
   ARAÇLAR
   
   1. 
      Sütununun ısısının termostatik kontrolüne izin veren yüksek performans sıvı kromatografı.
      
   2. 
      10 μl’lik servis yapabilecek enjeksiyon ünitesi.
      
   3. 
      Detektör: diferansiyel refraktometre. Tam-ölçü hassasiyeti en az sapma indeksinin 10^-4 birimi.
      
   4. 
      Sütun: 250 mm uzunluğunda 4,5 mm iç çaplı, 5 μm çapında %22-23 octadecylsilane formundaki karbonla birlikte silis parçacıkları ile kaplanmış paslanmaz çelik tüp (not 2).
      
   5. 
      Kayıt edici ve/veya bütünleştirici.
      

5. 
   AYRAÇLAR
   

Ayraçlar analitik saflıkta olmalıdırlar. Elüsyon çözeltilerinin gazları çıkarılmış olmalı ve ayrılmalara etkisi olmadan bir kaç kez işlenip yeniden kullanılmalıdır.

1. 
   Kloroform.
   
2. 
   Aseton.
   
3. 
   Asetonitril.
   
4. 
   Elüsyon çözeltisi: asetonitril + aseton ( planlanan ayrılmayı sağlamak üzere 50:50 karışımdan başlayarak oranları ayarlanacak).
   
5. 
   Çözünme çözeltisi: aseton ya da 1:1 aseton- kloroform karışımı.
   
6. 
   Referans trigliseridleri: hem ticari trigliseridler (tripalmitin, triolein, vs.) kullanılabilir ve tutma süreleri karşılık karbon numaralarına göre çizilebilir ya da alternatif olarak soya yağından referans kromatogram elde edilebilir (Not 3 ve 4 ile Şekil 1 ve 2 ye bakın).
   

6. 
   ÖRNEKLERİN HAZIRLANMASI
   

Analiz edilecek örneklerin %5 çözeltisi, 0,5 ± 0,001 gr örneğin 10 ml.lik derecelendirilmiş deney şişesinin içine koyarak ve çözünme çözeltisi (5.5) ile 10 ml yapılarak hazırlanır.
▼B

7. 
   USUL
   
   1. 
      Kromatografik sistemi kurun. Elüsyon çözeltisini tüm sistemi arındırmak için (5.4) 1,5 ml/mm oranında pompalayın. Stabil bir esas hat elde edene kadar bekleyin.
      

6 da hazırlanan örneğin 10μl sini enjekte edin.

8. 
   HESAPLAMA VE SONUÇLARIN AÇIKLANMASI
   

İç standardizasyon yöntemini kullan, yani pek çok trigliseride karşılık gelen zirve alanlarının toplamının %100 e eşit olduğunu farz et. Aşağıdaki formülü kullanarak her trigliseridin göreceli oranını hesapla:
% trigliserid = zirve alanı x 100

toplam zirve alanları

Sonuçları virgülden sonra bir ondalık ilerletin.
Not 1: Elüsyon düzeni sıklıkla ECN= CN- 2n ilişkisinde CN’nin karbon sayısı olduğu, n ise çift bağların olduğu ve çift bağın menşesi dikkate alınarak daha kesin hesaplanabilen karşılık karbon numaralarının hesaplanması ile belirlenebilir. Eğer n_o, n_l ve n_ln sayıları sırasıyla oleik, linoleik ve linolienik asitlerine atfedilebilen çift bağlar ise, karşılık karbon numarası aşağıdaki formüldeki ilişkiyle hesaplanabilir:
ECN= CN-d_on_o-d_ln_l-d_lnn_ln

d_o,d_l ve d_ln katsayıları referans trigliseridlerin vasıtası olarak hesaplanabilir.Bu yöntemde belirtilen koşullar altında elde edilen ilişki aşağıdakine yakın olacaktır:

ECN= CN-[2,60 n_o]- [2,35 n_l] – [2,17 n_ln]
Not 2: Örnekler: Likrosorb (Merck) RP18 Art 50333

Likrosfer ya da eşdeğer (merck) 100 CH18 Art 50377

Not 3: Bazı referans trigliseridlerle çözelimini triolein yoluyla da hesap etmek mümkündür.
α = RT/RT_olein

düşürülmüş tutma süresini kullanarak RT = RT – RT _çözelti

f (çift bağların sayısı)’ya karşı log α grafiği referans trigliseridler içinde bulunan tüm yağ asitleri trigliseridlerinin tutulma sürelerinin tespit edilmesini mümkün kılmaktadır – Şekil 2’ya bakın.
Not 4: Sütunun verimliliği trilinolien zirvelerinin trigliserid zirvelerinden bitişik RT ile ayrılmasına izin vermelidir.
▼M11
Not 5: Trilinolein zirvelerini bitişik zirvelerden ya da diğer engelleyici maddelerden temiz bir şekilde ayrılmayı sağlamak için, lampant sızma yağ ile ham zeytin ezmesi yağı aşağıdaki yöntem utarınca saflaştırılmalıdır:
200 μl seyreltilmemiş yağı silis sütunun içine sıvı-katı çıkarma için çekin ( tip SEP PAC silis kartuş-su part. No 519000).
Trigliseridleri HPLC için 20 ml susuz hekzan ile 20 saniyeden uzun olmayan bir süre ile yıkayıp giderin.
Yıkanmış ürünü nitrojen akımı ile kurutun ve isopropanol ya da actone(5 ml) içinde çözdürün. HPLC’nin içine 10-20 μl enjekte edin. Yağın yağ asiti kompozisyonunun saflaştırmadan önce ve sonra aynı olduğundan, kabul edilen analiz yönteminin doğruluk menzili içinde, emin olunması için kontrol edilmelidir:

▼B

Şekil 1

Soya yağı örneğinin kromatogramı


P = palmitik asit

L = lineoleik asit

St = stearik asit

Ln = linolenik asit

O = oleik asit

▼B

Şekil 2

F ye karşı log α grafiği ( duble bondların sayısı)

çift bağların sayısı (n)

La = laurik asit

St = stearik asit

Ln = linoleik asit

My = miristil asit

O = oleik asit

P = palmitik asit

L = linoleik asit

▼B

EK IX
MORÖTESİNDE SPEKTROFOTOMETRİK ARAŞTIRMA
ÖNSÖZ

Morötesi ile spektrofotometrik araştırma yağın kalitesi, korunması hali ve teknolojik işlemlerle meydana gelebilecek değişimler hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu yöntemde belirtilen dalgaboylarının emilmesi birleşen dien ve trien sistemlerinin mevcudiyetine bağlıdır. Bu emilmeler özel tükenmeler E ^%1_{1 cm} (yağın %1 çözeltinin belirtilmiş çözelti içinde, 1cm kalınlığında tükenmesi) tükenmesi olarak ifade edilir ve geleneksel olarak K ile gösterilir ( ‘tükenme katsayısı’ olarak da belirtilir).

1. 
   KAPSAM
   

Morötesinde ►C1 zeytin yağında ◄ spektrofotometrik inceleme gerçekleştirme için usulü tanımlar.

2. 
   YÖNTEMİN PRENSİBİ
   

Söz konusu yağ belirtilen çözelti içinde çözdürülür ve çözeltiden geri kalan saf çözeltiye göre belirlenmiş dalga boylarıyla belirlenir. Belirli kayboluşlar spektrofotometre sonuçlarından hesap edilebilir.

3. 
   MALZEME
   

220-360 nm aralığında bireysel nanometrik birimler okuma imkanı olan morötesinde kayboluşları ölçebilen spektrometre.

1. 
   Dikdörtgen quartz küvetler, optik uzunluğu 1 cm olan örtüleri ile birlikte. Su ya da başka uygun bir çözelti ile doldurulduklarında kuvetler arasındaki farklılık 0,01 kayboluş biriminden fazla olmayacaktır.
   
2. 
   25 ml.lik derecelendirilmiş deney şişeleri.
   

▼M6

3. 
   270 mm uzunluğunda ve 35 mm çapında üst tarafı, 270 mm uzunluğunda ve 10 mm çapında alt tarafı olan kromatografi sütunu.
   

▼B

4. 
   AYRAÇLAR
   
   1. 
      Spektrofotometrik olarak saf iso-octane (2,2,4- trimetilpentan). Damıtılmış suya göre 220 nm’de %60, 250 nm’de %95’den az olmamak üzere geçirgenliğe sahip olan ya da
      

• 
  Spektrofotometrik olarak saf siklohekzan: Damıtılmış suya göre 220 nm’de %40, 250 nm’de %95’den az olmamak üzere geçirgenliğe sahip olan
  

▼M6

_____________

▼B

2. 
   Ek bölüm I’de anlatıldığı gibi hazırlanan ve kontrol edilen sütun kromatografisi için temel alümina
   
3. 
   Kromatografi için n-hekzan.
   

5. 
   USUL
   
   1. 
      Söz konusu örnek kusursuz bir homojenitede olmalı ve hiçbir bozukluk içermemelidir. Çevre sıcaklığında sıvı olan yağlar 30 °C civarında bir sıcaklıkta kağıttan geçirilerek filtre edilirler, katı yağlar ise homojenize edilip erime noktalarının 10 °C üzerinden fazla olmayan bir sıcaklıkta filtrelenirler.
      
   2. 
      Tam olarak 0,25 gr örneği tartın ve 25 ml.lik deney şişesine hazırlayın, işarete kadar belirlenmiş çözelti ile tamamlayın ve homojenize edin. Sonuç çözeltisi kusursuz biçimde berrak olmalıdır. Eğer opal gibi oynak renkler saçma ya da bulanıklık mevcutsa derhal kağıttan geçirerek filtre edin.
      

▼B

3. 
   Elde edilen çözelti ile küveti doldur ve yaklaşık 232-276 nm arası dalga boyu ile kullanılan çözeltisi referans olarak kullanıp kayboluşları ölç.
   

Kayıt edilen kayboluş değerleri 0,1 ila 0,8 aralığında olmalıdır. Eğer değilse ölçümler uygun olduğunca daha konsantre yada daha seyreltik çözeltiler kullanılarak tekrarlanmalıdır.

4. 
   Alümina üzerinden geçişten sonra belirli bir kayboluşun belirlenmesi isteniyorsa aşağıdaki usul uygulanır. Hekzan süspansiyonu içindeki 30 gr basit alüminayı kromatografi sütunu içine koy. Emici sabit hale geldikten sonra fazla hekzanı alüminanın üstünün 1 cm üzerine kalıncaya kadar boşaltın.
   

10 gr katı yağı çözdürün, 5.1.’de izah edildiği gibi 100 ml hekzan içinde homojenize ve filtre edin ve çözeltisi sütunun içine dökün. Eluate yi toplayın ve tüm çözeltisi 25 °C’nin altında bir sıcaklık ile vakum altında buharlaştırın.

Elde edilen yağı 5.2. de belirtildiği gibi çabucak yapın.

6. 
   SONUÇLARIN AÇIKLANMASI
   

1. 
   Belirli kayboluşların (kayboluş katsayısı) değişik dalga boylarında kayıtları aşağıdaki gibi hesaplanır :
   

K_λ = E_λ___

c . s
K_{λ =} Dalga boyu _λ deki belirli kayboluş;

E_λ= Dalga boyu _λ de ölçülen kayboluş;

c = gr/100ml cinsinden çözelti konsantrasyonu;

s = cm cinsinden küvetin kalınlığı.

Sonuçları virgülden sonra iki ondalık ilerletin.

2. 
   AET tüzüklerindeki resmi yönteme uygun olarak zeytin yağının spektrofotometrik analizi 232 ve 270 nm dalga boylarındaki iso-octane çözeltinin belirli kayboluşlarının belirlenmesi ve K nın belirlenmesi için aşağıdaki formülü belirtmiştir:
   

ΔK = K_m – K _m-4 + K _m+4

2
K _m dalgaboyu m de belirli kayboluş, 270 nm civarındaki maksimum emişin dalgaboyu.

▼B

EK BÖLÜM I
Alüminanın hazırlanması ve aktivitesinin testi
A.1.1. Alüminanın hazırlanması

380- 400 °C arasında üç saat boyunca fırında kurutulmuş alüminayı hermetik olarak kapatılmış konteynere koy, her 100 gr alüminaya 5 gr su oranıyla damıtılmış su ilave et, konteyneri çabucak kapat, tekrar ederek çalkala, ve sonra kullanmadan en az 12 saat önce dinlenmeye bırak.

A.1.2. Alümina aktivitesinin kontrolü

30 gr alümina ile kromatografik sütun hazırla. 5.4’ncü fıkrada belirtildiği gibi çalıştırarak aşağıdakileri içeren karışımı geçir:

- %95 Sızma zeytin yağı: 268 nm’de belirli kayboluşu 0,18’den az olan,

- %5 Yer fıstığı yağı: rafine işlemlerinde toprakla işlem görmüş, 268 nm’de belirli kayboluşu 4’den az olmayan.

Geçişten sonra karışımın özel kayboluşu 268 nm’de 0,11’den fazla olursa alümina kabul edilebilir, eğer olmazsa dehidrasyon seviyesi yükseltilmelidir.

▼B

EK BÖLÜM II
Spektrofotometrenin kalibrasyonu
A.2. Ekipman belli aralıklarla (en az altı ayda bir) dalga boyu yanıtı ve yanıtlardaki kesinlik için kontrol edilmelidir.
A.2.1. Dalga boyu cıva buharı lambası ya da uygun filtreler kullanılarak kontrol edilebilir.
A.2.2. Fotosel ve fotoçoklayıcının yanıtını kontrol etmek için aşağıdaki işlemi uygulayın: Spektrofotometri için 0,2000 gr saf potasyum kromatı tartın ve 1000 ml.lik dereceli deney şişesi içinde 0,05 N potasyum hidroksitle çözdürün işarete kadar tamamlayın. Elde edilen çözeltiden 25 ml alın ve 500 ml.lik dereceli deney şişesine transfer edin ve aynı potasyum hidroksit çözeltisini kullanarak işarete kadar seyreltin.
275 nm’de elde edilen çözeltisin kayboluşunu potasyum hidroksit çözeltisini referans olarak kullanıp ölçün. 1cm küvet kullanarak yapılan kayboluş ölçümü 0,200 ± 0,005 olmalıdır.

▼B

EK X A
YAĞ ASİTLERİNİN METİL ESTERLERİNİN GAZ KROMATOGRAFİSİ İLE ANALİZİ

1. 
   KAPSAM
   

Bu yöntem, Ek X B’de belirtilen yönteme uygun olarak elde edilecek yağ asidi metil esterler karışımının oluşumunun nicel ve nitel olarak belirlenmesi için paketli ya da kılcal sütun kullanarak uygulanacak gaz kromatografisi için genel kılavuzu verir.
Bu yöntem polimeri halinde birleşik yağ asitlerine uygulanmaz.

2. 
   AYRAÇLAR
   

1. 
   Taşıyıcı gaz
   

Eylemsiz gaz (nitrojen, helyum, argon, hidrojen, v.s.), tam olarak kurutulmuş ve oksijen içeriği 10 mg/kg’den az.
Not 1: Hidrojen sadece kılcal sütunlarda taşıyıcı gaz olarak kullanılır, analizin hızını ikiye katlayabilir fakat zararlıdır. Güvenlik aletleri mevcuttur.

2. 
   Yardımcı gazlar
   

1. 
   Hidrojen (saflığı ≥%99,9) organik katışıklardan bağımsız.
   
2. 
   Hava ya da oksijen, organik katışıklardan bağımsız.
   

3. 
   Referans Standardı
   

Tercihan analiz edilecek yağlı madde ile benzer özeliklere sahip saf yağ asitlerinin metil esterlerinin karışımı, ya da bilinen kompozisyondaki bir yağın metil esterleri.

Çoklu doymamış yağ asitlerinin oksidasyonunu önlemek için önlem alınmalıdır.

3. 
   ALETLER
   

Verilen talimatlar gaz kromatografisinde kullanılan, paketli ve/veya kılcal sütunlar ve alev-iyonizayon detektörü gibi olağan ekipman ile ilgilidir. 4.1.2. de belirtilen verimlilik ve azim veren her alet uygundur.

1. 
   Gaz kromatografı
   

Gaz kromatografı aşağıdaki unsurlardan oluşur:

1. 
   Enjeksiyon sistemi
   

Aşağıdaki enjeksiyon sistemlerinden birini kullanın:

1. 
   paketli sütunlu, mümkün olduğunca en az ölü alana sahip ( bu durumda enjeksiyon sistemi sütunun sıcaklığından 20-50 °C daha yüksek bir sıcaklığa ısıtılabilir); ya da
   
2. 
   Kılcal sütunlu, bu durumda enjeksiyon sistemi bu tarz bir sütunla kullanılmak üzere özel olarak tasarlanması gerekir. Bölücü tipinde olabilir ya da sütun enjektör tipinde bölücüsüz olabilir.
   

Not 2: 16 karbon atomdan daha az karbon atomuna sahip yağ asitlerinin olmadığı durumlarda hareketli iğne enjektörü kullanılabilir.

2. 
   Fırın
   

Fırın sütunu en az 260 °C’ye ısıtma ve istenen sıcaklığı paketli sütun için 1 °C içinde, kılcal sütun için 0,1 °C içinde hassasiyetle sağlama kapasitesine sahip olmalıdır. Son gereklilik özellikle kaynaşık silis tüp kullanıldığında daha da önemlidir.
Programlanmış dereceli ısıtma kullanımı her durumda, ve özellikle 16 karbon atomundan daha azına sahip yağ asitlerinde tavsiye edilir.

▼B

3. 
   Paketli sütun
   

1. 
   Sütun, analiz edilecek maddelere karşı eylemsiz materyalden ( cam ya da paslanmaz çelik) yapılan ve aşağıdaki boyutlara sahip:
   

1. 
   Uzunluk: 1-3 metre. Uzun zincirli yağ asitleri (C ₂₀’nin üzerinde) mevcut olduğunda göreceli olarak daha kısa bir sütun kullanılabilir. 4 yada 6 karbon atomlu asitleri analiz ederken 2 metre uzunluğunda sütun kullanılması tavsiye olunur.
   
2. 
   İç çap: 2-4 mm.
   

Not 3: Üçten fazla çift bağlı çoklu doymamış bileşenler mevcut ise, paslanmaz çelik sütun içinde ayrıştırılabilirler.

Not 4: Paketli iki sütunlu bir sistem de kullanılabilir.

1. 
   Paketleme aşağıdaki unsurlardan oluşmalıdır:
   

1. 
   destek : asitle yıkanmış ve silanize edilmiş diyatomeli toprak, ya da ortalama zerre büyüklüğü sütunun uzunluğu ve iç çapı ile ilgili olan zerre büyüklüğünün dar menzilli ( 125- 200 μm sınırları içinde 25μm menzili içinde) diğer uygun yardımcılar;
   
2. 
   durağan safha : Polar sıvının polyester türü (örneğin dietilen glikol polisuccinat, butanediol polisuccinate, etileneglikol poliadipate, vs.) sianosilikon ya da gereken kromatografik ayrılmaya izin veren diğer sıvılar( 4. kloza bakın). Durağan safha paketlemenin %5-20’si (m/m) miktarında olmalıdır. Kutuplu olmayan durağan safha belli ayrılmalar için kullanılabilir.
   

3. 
   Sütunun hazırlanması
   

Eğer mümkünse sütunu detektörden ayırın, fırını kademeli olarak 185 °C’ye kadar ısıt ve yeni hazırlanmış sütun içinden 20-60 ml/dakika oranıyla taşıyıcı gaz akıntısını bu sıcaklıkta en az 16 saat geçir ve 195 °C’de iki saat daha muhafaza et.

4. 
   Kılcal Sütun
   

1. 
   Tüp, analiz edilecek maddelere karşı eylemsiz materyalden ( genellikle cam ya da kaynaşık silis) yapılmış. İç çapı 0,2-0,8 mm arasında olmalıdır. İç yüzeyi durağan safha kaplaması almadan önce uygun bir işlemden geçirilir. Pek çok durumda 25 mm’lik uzunluk yeterlidir.
   
2. 
   Durağan safha, genellikle poliglükol türü ( poli(etilen glükol) 20000), polyester (butanediol polisuccinat) ya da polar polisiloksan(sianosilikon). Bağlı (çapraz bağlantılı) sütunlar uygundur.
   

Not 5: Polar polisiloksanların linolenik asit ve C ₂₀ asitlerinin tanınması ve ayrılmasında bir takım güçlükler çıkarma riski vardır.

Kaplama ince olmalıdır, yani 0,1-0,2 μm aralığında.

3. 
   Sütunun montajı ve hazırlanması
   

Kılcal sütunun montajı için normal önlemlere yani fırında (destek) sütunun ayarlanması, ek yerlerin (sızdırmayı önlemek) seçimi ve montajı, sütunun uçlarının enjektörde ve detektörde pozisyon almaları (ölü alanları azaltmak) gibi önlemlere riayet ediniz. Sütunu taşıyıcı gaz (örneğin 25 mm uzunluğunda ve 0,3 mm iç çapı olan bir sütun için 0,3 bar (30 kPa)) akımının altına koyun.

Fırını çevre sıcaklığında olağan safhanın huzursuzluk limitinin 10 °C altına kadar 3 °C/dakika ile programlanmış derece ile sütunu hazırla. Esas hat stabilize olana kadar fırını bu sıcaklıkta bir saat tut. İzotermal koşullarda çalışması için 180 °C’ye dön.

Not 6: Daha önceden hazırlanmış uygun sütunlar ticari olarak mevcuttur.

5. 
   Detektör, tercihen sütunun sıcaklığının üstünde bir sıcaklığa ısıtılma kapasitesi sahip.
   

2. 
   Şırınga
   

Şırınga 0,1μl’lik bölümler halinde derecelendirilmiş maksimum kapasitesi 10μl.

▼B

3. 
   Kayıt edici
   

Eğer kayıt edici eğrisi analiz edilen karışımın kompozisyonunun hesaplanmasında kullanılacak ise kullanılacak aletlere uyumlu yüksek kesinlikte bir elektronik kayıt edici gereklidir. Kayıt cihazı aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır:

1. 
   Yanıt verme hızı, 1,5 s’nin altında, tercihen 1 s ( yanıt verme hızı kayıt kaleminden alınan %100 sinyalin ani girişini takiben % 0 dan %90 a geçiş zamanı);
   
2. 
   Kağıdın genişliği, en az 20 cm;
   
3. 
   Kağıt hızı, 0,4 ile 2,5 cm/dakika arasındaki değerlere ayarlanabilir.
   

4. 
   Bütünleştirici
   

Hızlı ve kesin hesaplama ancak elektronik bir bütünleştirici yardımı ile gerçekleştirilebilir. Bu uygun bir hassasiyet ile lineer karşılıklar verebilecek, ve esas hattın sapmasının düzeltilmesi tatmin edici olacaktır.

4. 
   USUL
   

4.1 -4.3. arasında tanımlanan operasyonlar alev-iyonizasyonu detektörünün kullanılması ile ilgilidir.
Alternatif olarak kartometre detektörü çalıştıran gaz kromatografı (termal iletkenlik değişiklikleri prensibine göre çalışan) kullanılabilir. Bu durumda işletim koşulları kloz 6’da tanımlandığı gibi değiştirilir.
4.1. Deney koşulları

1. 
   Optimum işletim koşullarının seçimi
   

4.1.1.1. Paketli sütun

Deney koşullarının seçiminde aşağıdaki değişkenler dikkate alınmalıdır:

1. 
   sütunun uzunluğu ve çapı;
   
2. 
   Durağan safhanın tabiatı ve miktarı;
   
3. 
   Sütunun sıcaklığı;
   
4. 
   Taşıyıcı gaz akışı;
   
5. 
   Gereken çözelti;
   
6. 
   Deney parçasının boyutu, detektör ve elektrometrenin montajının lineer bir karşılık vermesi için seçilmeli;
   
7. 
   Analizin süresi.
   

Genelde, tablo 1 ve 2’de verilen değerler arzu edilen sonuçlara götürür, yani en az 2000 teorik metil stearate için sütun uzunluğunun metre başına l plaka ve elüsyonu yaklaşık 15 dakika içinde.

Aletlerin izin verdiği yerlerde, enjektörün sıcaklığı 200 °C civarında olmalı ve detektörün sıcaklığı ise sütununkine eşit ya da daha yukarıda olmalıdır.
Kural olarak alev-iyonizasyonuna sağlanan hidrojenin akış oranı taşıyıcı gaza göre 1:2 ila 1:1 arasında sütunun çapına bağlı olarak değişir. Oksijen akımı hidrojen akımının 5 ila 10 katı kadardır.
Tablo l

Sütunun iç çapı mm	Taşıyıcı gaz akışı ml/dakika
2	15-25
3	20-40
4	40-60

▼B

Tablo 2

Durağan safhanın konsantrasyonu %(m/m)	Sütun sıcaklığı °C
5	175
10	180
15	185
20	185

4.1.1.2. Kılcal sütun

Kılcal sütunların verimlilik ve geçirgenlik özellikleri, bileşenlerin birbirinden ayrılmaları ve analizin süresi sütun içindeki taşıyıcı gazın akım oranına büyük oranda bağlı olduğu anlamına gelir. Bu parametre (ya da daha basitçe sütunun başı üzerinde) üzerinde hareket ederek işletim koşullarını optimize etmek kişinin ayrımı ilerletmeyi ya da hızlı analiz yapmak istemesine bağlı olarak önem arz eder.
4.1.2. Teorik plakaların(verimlilik) ve çözeltinin sayısının belirlenmesi (Şekil 1’e bakın)
Metil stearate ve metil oleate karışımının analizini yaklaşık eşit oranlarla gerçekleştirin (örneğin kakao yağındaki metil esterler).
Sütunun sıcaklığını metil stearatenin maksimum zirvesinin çözelti zirvesinden 15 dakika sonra kaydedilebilecek bir dereceyi ve taşıyıcı gaz akışını seç. Tam ölçeğin dörtte üçünü işgal edecek yeterli miktarda metil ester ve metil stearate karışımını kullan.
Aşağıdaki formülü kullanarak teorik plakaların, n (verimlilik) sayısını hesapla:

çözelti R’yi de aşağıdaki formülle:

dr₁, milimetre cinsinden kromatogramın başlamasından metil stearate için zirvenin maksimum olduğu yere kadar olan tutma mesafesi;

ω₁ ve ω₂ milimetre cinsinden sırasıyla metil stearate’nin ve metil oleat’ın, eğrinin çekim noktalarında tanjantlarının esas hat ile kesiştiği noktalar arasında ölçülen genişlik;

Δ milimetre cinsinden, metil stearate ile metil oleate’nin maksimum zirveleri arasındaki mesafe;

▼M2
ve çözelti indeksi,lr, aşağıdaki formülü kullanarak
_a_

b

a = Esas hattan ölçülen en küçük zirvenin yüksekliği;

b = Birbirini takip eden iki zirve arasındaki vadinin en düşük noktasının esas hattan ölçülen yüksekliği.

▼B

Şekil 1

Teorik plakaların(verimlilik) ve çözeltilerin sayısını belirleyecek kromatogram

Seçilecek işletim koşulları en az metil stearate için sütun uzunluğunun metre başına 2000 teorik plakayı ve en az 1,25 çözelti sağlamaya gücü yetmelidir.
4.2. Deney parçası

Şırınga (3.2) kullanarak Ek X B uyarınca hazırlanmış 0,1-0,2 μl metil ester çözeltisini alın ve sütuna enjekte edin.

Esterlerin çözelti halinde olmadığı durumlarda , kromatografik kalitedeki heptan içinde yaklaşık 100mg/ml çözelti hazırlayın ve bu çözeltisin 0,1-1 ml.sini enjekte edin.
Mevcut bileşenler için yapılan analiz sadece zerre miktarında ise, test parçasının boyutu ( 10 katına kadar) arttırılabilir.
4.3. Analiz

Genel olarak işletim koşulları 4.1.1’de tarif edilenlerdir.

Bununla birlikte 12 karbon atomundan daha az atoma sahip olan yağ asitlerinin belirlenmesinde düşük sütun sıcaklığı, ya da 20 karbon atomundan daha fazlasına sahip yağ asitlerinde ise yüksek sütun sıcaklığında çalışılabilir. Bu iki durumda da sıcaklık programlaması kullanmak mümkündür. Mesela, örnek 12 karbon atomundan daha az atomlu yağ asitlerinin metil esterlerini içeriyorsa, örneği 100˚C’de (ya da bütirik asidin mevcut olduğu durumlarda 50-60 ˚C arasında) enjekte edin ve derhal sıcaklığı optimuma kadar 4-8 ˚C/dakika oranıyla yükseltin. Bazı durumlarda iki usul birleştirilebilir.
Programlanmış ısıtmadan sonra, elüsyona tüm bileşenler yıkanıp giderilene kadar sabit sıcaklıkta devam edin.Eğer aletlerin programlanmış ısıtması yoksa 100 ila 195˚C arasındaki iki sabitlenmiş derecede kullanın.
▼B

Eğer gerekirse, analizin gizlenmiş zirvelerin yokluğunu gerçeklemek için farklı polariteli iki sabit safhada yapılması tavsiye olunur. Örneğin C _18:3 ve C _20:0, ya da C _18:3 ve C _18:2 nin eşzamanlı bulunması durumu.

4.4. Referans kromatogramının ve referans grafiklerin hazırlanması

Örnek için kullanılan işletim koşullarıyla aynı koşullarda referans standart karışımı (2.3) analiz et, ve bileşen yağ asitleri için tutma sürelerini ya da tutma mesafelerini ölç. Yarı logaritmik kağıt üzerinde, her doymamışlık derecesi için, grafikler tutma süresi ya da mesafesinin logaritmasını karbon atomlarının sayılarının fonksiyonu olarak gösterecek şekilde inşa et. İzotermal koşullarda, aynı derecedeki doymamışlıktaki düz-zincir asitleri için grafikler düz çizgi şeklindedir. Bu çizgiler neredeyse paralel olmalıdırlar.

Gizlenmiş zirvelerin bulunması gibi koşullardan, yani çözeltinin iki bileşeni ayırt etmekte yetersiz olması, kaçınmak gereklidir.

5. 
   SONUÇLARIN AÇIKLANMASI
   
   1. 
      Niteliksel analiz
      

4.4.’de hazırlanan grafiklerden örneğin metil ester zirvelerini, eğer gerekirse enterpolasyon ile, tanımlayın

2. 
   Niceliksel analiz
   
   1. 
      Kompozisyonunun belirlenmesi
      

İstisnai durumlar haricinde içsel normalizasyon yöntemini kullan, yani örneğin tüm bileşenlerinin kromatogram üzerinde temsil edildiğini varsayın, zirvelerin altındaki alanların toplamı bileşenlerin %100’ünü temsil eder (toplam elüsyon).
Eğer alet bir bütünleştirici içeriyorsa, oradan elde edilen rakamları kullanın. Eğer yoksa, her zirvenin altındaki alanı bulmak için zirvenin yüksekliği ile orta yükseklikteki genişliğini çarpın ve gereken durumlarda kayıt esmasında kullanılan değişik güç yitimlerini de dikkate alınız.

2. 
   Hesaplama yöntemi
   

5.2.2.1 Genel durum

Verilen bileşen _i nin metil esterlerin kütlesi tarafından bir yüzde olarak ifade edilen, aşağıdaki formülü kullanarak uygun zirvenin alanının toplam alanlara yüzdesinin temsil ettiği oranla belirlenen içeriğini hesapla:

__A_i__ x 100

A

A_i = bileşen i ye karşılık gelen zirve altındaki alan;

A= tüm zirveler altındaki alanların toplamı
Sonuçları virgülden sonra bir ondalık ilerletin.
Not 7: Bu genel durumda, ilgili alanlar temel alınarak yapılmış hesaplamanın sonuçları kütlenin bir yüzdesini temsil ettiği kabul edilir. Bu varsayıma izin verilmeyen durumlarda 5.2.2.2.’ye bakın.
5.2.2.2. Düzeltme faktörlerinin kullanılması

Bazı durumlarda, örneğin sekiz karbon atomundan daha az atoma sahip olan yağ asitlerinin bulunması ya da ikinci gruplu asitler, termal iletkenlik detektörleri kullanırken ya da özellikle yüksek derecede kesinlik gerektirdiğinde, düzeltme faktörleri zirve alanlarının yüzde oranlarını bileşenlerin kütle yüzde oranlarına çevirmek için kullanılır.

Düzeltme faktörlerini, örnek için kullanılan işletim koşullarıyla benzer koşullar altında bilinen kompozisyonlu referans metil esterler karışımı analizinden elde edilen kromatogram yardımı ile belirleyin.
Bu referans karışım için bileşen _i nin kütlesinin yüzde oranını aşağıdaki formülle bulunur:

▼B

m _i = referans karışım içinde bileşen _i nin kütlesi;

m = referans karışımın değişik bileşenlerinin kütleleri toplamı.
Referans karışımın (4.4) kromatogramından bileşen i nin yüzde oranı (alan/alan) aşağıdaki gibi hesaplanır:


A _i = Bileşen i ye karşılık gelen zirvenin altındaki alan;

A = Tüm zirveler altındaki alanların toplamı.

Daha sonra düzeltme faktörü aşağıdaki gibi hesaplanır:

Genellikle düzeltme faktörleri K _C16 ‘ya göre ifade edilir, böylece göreceli faktörler aşağıdaki hale gelir:

Örnek için, her bileşen _i nin içeriği, metil esterlerin kütlesine olan yüzdelik oranı ile ifade edilir:

Sonuçları virgülden sonra bir ondalık ilerletin.

5.2.2.3. İç standardın kullanılması

Bazı analizlerde (mesela tüm yağ asitleri ölçülmemiş ise özelikle 4 ve 6 karbonlu asitler 16 ve 18 karbonlu asitler ile birlikte bulunuyorsa, ya da örnek içindeki yağ asidinin tam miktarını belirlemek önemli ise) bir iç standart kullanmak önemlidir. 5,17 ya da 18 karbonlu yağ asitleri sıklıkla kullanılır. İç standart için düzeltme faktörü (eğer varsa) belirlenmelidir.

Bileşen _i nin kütlesinin yüzdelik oranı, metil esterler olarak ifade edilir, aşağıdaki formülle verilmiştir:

A_i = Bileşen i ye karşılık gelen zirve altındaki alan;

A_s = İç standarda karşılık gelen zirve altındaki alan;

K’_i = Bileşen i için düzeltme faktörü (K _Cl ye göre);

K’_s = İç standart için düzeltme faktörü (K _C16 ya göre);

m = miligram cinsinden deney parçasının kütlesi;

m_s = miligram cinsinden iç standardın kütlesi
Sonuçları virgülden sonra bir ondalık ilerletin.

▼M2

6. 
   ÖZEL OLAY – TRANS-İZOMERLERİN BELİRLENMESİ
   

Kendine özgü polaritesi olan gaz kromatografisi kılcal sütunları kullanarak metil esterlerin ayrılması yoluyla 10 ila 24 arasındaki karbon atomlu yağ asitlerindeki trans-izomerlerin içeriğinin belirlenmesi mümkündür.
▼M2

6.1. İç çapı 0,25 ila 0,32 mm arasında olan, 50 m uzunluğundaki, kalınlığı 0,1 ila 0,3 m cyanopropisilicon ile kaplanmış (tip SP 2380, C.P. sil 88, silor 10 ve benzer tiplerde) silisten yapılmış bir kılcal sütun.

6.2. Metil esterler Ek X B’de ortaya konan usul ile hazırlanırlar. Tedbir olarak %3’ün üzerinde serbest asitliği olan yağlı maddeler Ek VII’nin 6.1’i uyarınca nötralize edilmelidir.

3. 
   Sonuç olarak gaz kromatografisinin işletim koşulları aşağıdaki gibidir:
   

- Sütunun sıcaklığı 150 C ile 230 C arasında ayarlanmalıdır (mesela 15 dakika 165 C daha sonra dakikada 5 C arttırarak 200 C’ye);

- Enjektör sıcaklığı: 250 C eğer bölücü sistem kullanılıyorsa ya da sütunun önceki sıcaklığı eğer sütun üzerinde sistem kullanılıyorsa;

- Detektör sıcaklığı: 260 C ;

- Taşıyıcı gazın akış oranı (helyum, hidrojen): dakikada 1,2 ml.

Enjekte edilen miktar arakidik asidin metil esterine karşılık gelen zirvenin yüksekliği ölçeğin en altından %20’sine eşit ya da daha büyük olacak hassasiyet koşullarında olacaktır.

4. 
   Değişik metil esterlerin tanımlanması referans karışımlarının tutma süreleri ile tutma sürelerinin karşılaştırılması temelinde etkilenir ( 2.3. noktasında belirtildiği gibi).
   

Trans yağ asitlerinin esterleri karşılık cisisomer lerden daha önce yıkayıp giderilir. Örnek bir kromatogram şekil 2’de verilmiştir.

Şekil 2

Kılcal sütun kullanarak yağ asitlerinin trans-izomerlerinin gaz kromatogramı

5. 
   Nokta 4.1.2 uyarınca belirlenecek sütunun verimliliği belli bazı kritik çiftlerin ayrılmalarına izin vermelidir. Mesela: oleik asit zirvesi ve transisoleik asit zirvelerinden oluşan çift, trans C18:1/cis C18:1, 2 den büyük çözelti indeksine sahip gibi örnekler.
   

6. 
   Değişik trans yağ asitlerinin yüzde oranları ilgili zirvenin yüzeyi ile mevcut diğer tüm zirvelerinin yüzey toplamları arasındaki ilişki temel alınarak hesaplanır.
   

Yüzdelik oranlar:

- Bu Tüzüğün Ek I’ inde belirtilen transoleik izomerlerin toplamı olarak trans oktadekenoik asitler (T18:1); - Bu Tüzüğün Ek I’inde belirtilen transolinoleik izomerlerin toplamı olarak cis-trans ve trans-cis oktadekadienoik asitler [(CT/TC) 18:2];

▼M2

- Bu Tüzüğün Ek I’ inde belirtilen transolinolenic izomerlerin toplamı olarak trans-cis-trans,cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, octadecatrienoic asitler [(TCT+CCT+CTC+TCC) 18:3]
Dikkate alınacaklardır.
Not 8: bu yöntemin belirli özelliklerini dikkate alarak sonuçları virgülden sonra iki ondalık ilerletin.

▼B

►M2 7. ◄ ÖZEL OLAY- CATHAROMETER DEDEKTÖRÜ KULLANIMI (TERMAL İLETKENLİK DEĞİŞİKLİKLERİ PRENSİBİ İLE ÇALIŞAN)
Termal iletkenlik değişiklikleri prensibine göre çalışan detektör (kartometre) kullanan gaz kromatografisi yağ asidi metil esterleri karışımının niteliksel ve niceliksel kompozisyonunun belirlenmesi için de kullanılabilir. Eğer kullanılırsa, kloz 3 ve kloz 4’de belirtilmiş koşullar Tablo 3’de gösterildiği şekilde modifiye edilir.
Niceliksel analizler için 5.2.2.2 de tanımlanmış düzeltme faktörünü kullanın.
Tablo 3

Değişken	Değer/koşul
Sütun	Uzunluk: 2-4 m İç çapı: 4 mm
Destek	Zerre büyüklüğü 160 ila 200 m arasında
Durağan safhanın konsantrasyonu	%15 ila 25 arasında (m/m)
Taşıyıcı gaz	Helyum, ya da olmadığı hallerde, , mümkün olduğu kadar düşük oksijen içeren hidrojen
Yardımcı gazlar	Yok
Enjektör sıcaklığı	Sütunun sıcaklığının 40 ila 60 C üzeri
Sütun sıcaklığı	180 ila 200C arasında
Taşıyıcı gazın akımı	Genellikle 60 ila 80 ml/dakika arasında
Enjekte edilen deney parçasının büyüklüğü	Genellikle 0,5 ila 2l arasında

►M2 8. ◄ DENEY RAPORU

Deney raporu, metil esterlerin hazırlanmasında kullanılan yöntemler ve gaz kromatografisi analizi ve elde edilen sonuçları açıkça belirtmelidir.bu Uluslar arası Standartta belirtilmeyen işletim detaylarını sonuçları etkileyebilecek herhangi bir olay varsa detayları ile birlikte belirtmelidir.
Deney raporu örneğin tanımlanması için gerekli olan tüm bilgileri içermelidir.