Izolarea unor mutante de Hansenula polymorpha ncy 495 cu capacitate ridicată de biosinteză a alcooloxidazei

În urma rezultatelor obţinute se poate remarca faptul că tulpinile mutante Hansenula polymorpha 15 – 50 şi 6 asimilează diferite surse de carbon, dar nu fermentează decât glucoza. De asemenea cele două tulpini mutante asimilează azotaţii (KNO₃) ca sursă de azot şi metanolul ca sursă de carbon. Temperatura optimă de creştere este de 37 – 38⁰ C. Intervalul de temperatură, în care are loc atât creşterea tulpinii parentale cât şi a celor două mutante, este de 33 – 45⁰C. Creşterea este mai accentuată în mediul cu vitamine, decât în cel fără vitamine.

Caracteristicile fiziologice ale tulpinilor mutante Hansenula polymorpha 15 – 50 şi 6 sunt identice cu cele ale tulpinii parentale descrise în literatura de specialitate, precum şi a altor tulpini din colecţii internaţionale [7].
3.7. Caracterizarea genetică a tulpinilor de drojdii Hansenula polymorpha parentalā şi a mutantelor Hansenula polymorpha 15 – 50 şi 6
Sistemul de clasificare folosit în prezent pentru drojdii este bazat, în principal, pe caractere fenotipice, cum sunt reacţiile fiziologice şi morfologia stadiilor vegetative şi sexuate, precum şi pe unele tehnici de genetică moleculară [8, 9]. Una dintre tehnicile de genetică moleculară care nu necesită tehnologie de înalt nivel este determinarea gradului de înrudire a diferitelor specii sau tulpini de drojdii, în mod indirect prin determinarea procentului molar de guanină + citozină (%G + C), adică al conţinutului în aceste baze a AND cromozomial [10].

Probele de ADN corespunzătoare celor 3 tulpini de drojdie utilizate au fost testate spectrofotometric şi prin electroforeză, în scopul determinării gradului de contaminare cu proteine, polizaharide şi ARN, precum şi pentru evidenţierea integrităţii lor (Tabelul 6 şi Figura 6).

Tabelul 6. determinarea spectrofotometrică a gradului de contaminare cu polizaharide şi proteine a probelor de ADN izolate şi purificate.

Tulpina	A230	A260	A280	A260/A280	A260/A230
H. polymorpha – parentală	0,118	0,245	0,124	1,98	2,08
H polymorpha 15	0,118	0,245	0,124	1,98	2,08
H. polymorpha 15 – 50	0,098	0,207	0,112	1,85	2,11
H. polymorpha 6	0,108	0,222	0,115	1,93	2,06

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura 6. Evidenţierea prin electroforeză în gel de agaroză a gradului de fragmentare şi de contaminare cu ARN a probelor de ADN genomic: liniile 1 – 4  Hansenula polymorpha parentală; liniile 5 – 6  Hansenula polymorpha 15 – 50; liniile 7 – 8  Hansenula polymorpha 6; liniile 9 – 10  Hansenula polymorpha15; liniile 11 – 12  Candida boidinii ICCF 26.
Raporturile A₂₆₀/A₂₈₀ calculate pentru cele trei tulpini s-au situat între 1,85 pentru Hansenula polymorpha 50 şi 1,98 pentru Hansenula polymorpha parentală şi mutanta 15, ceea ce înlătură posibilitatea unei contaminări proteice a probelor de ADN.

Raporturile A₂₆₀/A₂₃₀ s-au situat între 2,06 pentru Hansenula polymorpha 6 şi 2,18 pentru Candida boidinii, ceea ce exclude o eventuală contaminare cu polizaharide a probelor de ADN.

ADN cromozomal extras şi purificat a fost supus electroforezei în gel de agaroză, în scopul verificării integrităţii şi a unei posibile contaminări cu ARN. Această etapă este foarte importantă deoarece ADN fragmentat poate produce erori la citirea spectrofotometrică, absorbanţa sa fiind net diferită de cea a ADN întreg. Vizualizarea la UV a gelului de electroforeză a demonstrat integritatea ADN, prin prezenţa spoturilor unice şi lipsa ARN, spotul caracteristic acestuia nefiind prezent.

Probele astfel verificate au fost supuse denaturării termice, înregistrându-se variaţiile absorbanţei la  = 260 nm, pentru o scară de temperatură variind între 20⁰C şi 105⁰C. (Tabelul 7).

Tabelul 7. Înregistrarea spectrofotometrică a efectului hipercromic pentru cele 3 tulpini de drojdie.

Temperatura, ^0C	A260 Hansenula polymorpha parentală	A260 Hansenula polymorpha 15	A260 Hansenula polymorpha 15 - 50	A260 Hansenula polymorpha 6
20	0,245	0,245	0,207	0,222
30	0,250	0,252	0,212	0,230
40	0,260	0,268	0,215	0,236
50	0,265	0,274	0,218	0,243
60	0,270	0,276	0,228	0,250
70	0,274	0,282	0,230	0,269
80	0,276	0,304	0,246	0,307
90	0,300	0,316	0,270	0,320
100	0,305	0,326	0,278	0,325
105	0,250	0,252	0,213	0,225