Izolarea unor mutante de Hansenula polymorpha ncy 495 cu capacitate ridicată de biosinteză a alcooloxidazei

^* tratament cu detergent cationic
Un nou bioproces de obţinere a formiatului a fost dezvoltat de către japonezi utilizându-se un sistem enzimatic imobilizat format din alcooloxidază, catalază şi formaldehid dismutază, cuplat cu un sistem mixt de celule intacte de Hansenula polymorpha şi Pseudomonas putida [33].

În acest proces metanolul a fost prima dată oxidat la formaldehidă, apoi aceasta a fost transformată în formiat şi metanol de către formaldehid dismutaza bacteriană. Prin repetarea acestor reacţii enzimatice secvenţiale, tot metanolul adăugat a fost stoichiometric transformat în formiat. Stabilitatea sistemului celular mixt a fost asigurată prin imobilizare. Imobilizarea sistemului celular a fost efectiv utilizată în conversia mai multor alcooli alifatici (C₁ – C₄) în acizii corespunzători.

Alt tip de mutante izolate, deficiente în catalază (CAT ^- ) şi care nu pot creşte pe metanol, dar produc peroxid de hidrogen, au fost incubate în mediu cu metanol. În aceste experimente acumularea de H₂O₂ de către mutanta Hansenula polymorpha 9 (Tabelul 25) nu a fost lineară cu timpul. În primele ore ale incubării cu metanol se observă o excreţie întârziată de H₂O₂, şi moartea celulelor. Această concentraţie mare de H₂O₂, duce şi la inactivarea alcooloxidazei.

Mutantele defective în dihidroxiacetonkinază (DAK ^- ), sunt de asemenea de interes practic. Aceste mutante au o capacitate diminuată de a creşte pe metanol sau dihidroxiacetonă, dar se pot dezvolta pe glicerol datorită prezenţei glicerolkinazei şi gliceraldehid-dihidrogenazei. Aceste mutante produc dehidroxiacetonă şi glicerol din metanol cu 20% mai mult decât sistemul celular folosit anterior (Tabelul 25).

Ingineria genetică a drojdiilor metilotrofe s-a dezvoltat foarte rapid şi în prezent tulpini mutante de Pichia pastoris şi Hansenula polymorpha sunt utilizate pentru producerea de diverşi metaboliţi. [34]

Sistemul celular Pichia pastoris este ideal pentru producerea câtorva proteine heterologe la scară comercială:  - galactozidază, factorul de necroză tumorală (TNF), proteină virală, antigenul de suprafaţă (HBsAg) şi câteva proteine de secreţie, ca invertază şi lizozimul bovin (Tabelul 27).

Tabelul 27. Proteine heteroloage de expresie şi secreţie din drojdia metilotrofă Pichia pastoris.

Mod de expresie	Proteină	Producţie
		% din proteina celulară	g/l în cultură
Citoplasmic	 - galactozidază Factor de necroză tumorală (TNF) HBsAg	25 30 4	- 10 0,4
Secreţie	Invertază Lizozim bovin	90 70	3 0,25

Tulpinile de drojdii au fost cultivate în sistem continuu la concentraţii foarte mari, cca 130 g/l (substanţă uscată). Pentru producţia de proteine heterologe în Pichia pastoris, aceasta s-a cultivat într-un proces în două stadii. În primul stadiu tulpina a fost cultivată în mediu minimal cu glicerol ca sursă de carbon pentru inhibiţia alcooloxidazei. După consumarea glicerolului, cultura a fost trecută în stadiul al doilea, de producţie, pe mediu cu metanol.

Biosinteza ATP s-a bazat pe utilizarea unui sistem celular de drojdie pentru oxidarea directă a metanolului la CO₂ cu formaldehid-dehidrogenaza şi formiat-dehidrogenaza, care reduc NAD şi pentru fosforilarea oxidativă a ADP la ATP, în lanţul respirator. S-au utilizat celule de drojdii tratate cu zimoliază sau sorbitol. Substratul iniţial pentru sinteza ATP a conţinut AMP sau adenină şi adenozină, ortofosfat care este mai bun ca metanolul sau formiatul ca sursă de carbon şi energie (Tabelul 28). Cantitatea de ATP obţinută a fost de 100 g/l sau 200 mM, iar rata de conversie din adenozină a fost de 77% [35].

Tabelul 28. Producerea eficientă de ATP de către drojdia metilotrofă Candida boidinii.

Substrat	Produs	Randament %
Metanol + Adenozină (245 nM)	ATP (198 mM)	77
Metanol + AMP (40 mM)	ATP (22 mM)	60 – 70
Formiat + AMP (18 mM)	ATP (12 mM)	60 – 70

În diferite studii referitoare la fiziologia drojdiilor metilotrofe se atrage atenţia asupra acumulării de flavine în cultura dezvoltată pe metanol. În mod special, creşterea nivelului de alcooloxidază care conţine 8 molecule de FAD pentru fiecare moleculă de enzimă este corelată cu conţinutul de flavine din celulele de drojdie. Enzimele cheie în biosinteza FAD sunt FMN adenilil transferaza şi FAD pirofosforilaza. Metanolul acţionează ca inductor pentru biosinteza FAD. Riboflavina şi FMN adăugate în mediul de cultură cu metanol sunt transformate în FAD, observându-se în final o producţie de 45 mg/l [36].

Studii detailate privind căile de reglare a biosintezei flavinelor arată că nivelurile intra- şi extracelulare de flavine sunt controlate de condiţiile de cultivare, cum ar fi de exemplu rata de diluţie (Tabelul 29).
Tabelul 29. Biosinteza flavinelor de către Hansenula polymorpha pe mediu cu metanol.

Rata de diluţie, h^-1	Nivelul flavinelor FAD		M/g proteină FMN		Riboflavină
	in	ex	in	ex	in	ex
0,025	5,1	0	0,3	0	0	0,04
0,1	3,5	0	0	0	0	0,37

in – intracelular

ex - extracelular

Analiza HPLC a FAD extras dintr-un preparat omogenizat de alcool oxidază şi din celulele de Hansenula polymorpha relevă diferenţe în timpul de retenţie în comparaţie cu forma clasică t – FAD, dintr-un produs comercial extras din D – L – aminoacidoxidază. (Figura 16). Forma specifică a FAD din alcooloxidază şi celulele de Hansenula polymorpha a fost desemnată ca modificată şi notată m – FAD (Tabelul 30) [37].



Figura 16. Separarea prin HPLC a diferitelor forme de FAD izolate din:

A – extract celular de Hansenula polymorpha cultivată în sistem batch

B – preparat comercial de D – aminoacid – oxidază

C – preparat omogenizat de alcooloxidază

Tabelul 30. Biosinteza diferitelor forme de FAD, din celule de Hansenula polymorpha, crescută pe metanol la diferite rate de diluţie.

Rata de diluţie, h^-1	m – FAD, mmol/mg	t – FAD, din proteină	Metanoloxidază, U/mg de proteină
0,05	0,85	0,32	0,67
0,1	0,42	0,44	0,32
0,18	0,07	0,28	0,1

m – FAD – formă modificată

t – FAD – formă clasică

Alcooloxidaza prezintă un mare interes biotehnologic, deoarece poate fi utilizată la generarea peroxidului de hidrogen, la producţia primară de aldehide şi compuşi flavinici şi în producţia de alcooli. De aceea identificarea factorilor limitativi în formarea alcooloxidazei este esenţială pentru optimizarea producţiei de alcooloxidază în aplicaţiile industriale.

În concluzie dezvoltarea viitoare a producţiei de proteine şi metaboliţi pe bază de metanol, depinde de stabilirea exactă a reglajului metabolic şi genetic în drojdiile metilotrofe a enzimelor cheie şi în special al alcooloxidazei. Sistemele biogenetice de control a metanolului în drojdiile metilotrofe apar ca foarte promiţătoare şi eficiente pentru aplicaţiile industriale.

Bibliografie
1. Faust, U., Sitting, W., Adv. Biochem. Eng., 17, 64-67 (1983).

2. Ogata, K., Nishikawa, H., Osugi, M., J. Ferment. Technol., 48, 389 - 393 (1973).

3. Tani, Y., Biotechnol. Gen. Eng., 3, 111-125 (1985).

4. Eggeling, I., Sahm, H., Appl. Environ Microbiol., 42, 268-275 (1980).

5. Van der Klei, I. J., Faber, K. N., Keizer-Gunnik, I., Gietl, C., Harder, W., Veenhuis, M., FEBS Lett, 334, 128-132 (1993).

6. Eggeling, L., Sahm, H., Arch. Microbiol., 127, 119-124 (1981).

7. Wickermann, L. J., The Yeasts, North-Holland Publishing, Amsterdam, 226-315, (1970).

8. Lodder, J., The Yeasts, North-Holland Publ. Co., Amsterdam, 455-713, (1970).

9. Barnett, J. A., Yeast Characteristics and Identification, Cambridge Univ. Press, 13-27 (1990).

10. Marmur, J., Dory P., J. Mol. Biol., 5, 109-118 (1972).

11. Li, Y.Z., Liu, X.D., Chong, W. B., Ci, Y. X., Chines Chem. Lett., 5, 515-518 (1994).

12. Lee, J. D., Komagata, K., J. Gen. Appl. Microbiol., 26, 133-158 (1980).

13. Cabalero-Cordoba, I., Glenys, N., Pocheco, M. T., Sgarbieri, V.,C., Cienc. Technol. Aliment., 17 (2), 102-106 (1972).

14. Cooney, C. L., Makiguchi, N., Biotechnol.Bioeng., 7, 65-67 (1977).

15. Hunter, K., Rose, A. H., J.Appl. Chem. Biotechnol., 22, 527-530 (1972).

16. Einsele, A., Ristroph, D. L., Humphrey, A. E., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 6, 335-340 (1979).

17. Egli, T., Bosshard, C., Hamer, S., Biotechnol. Bioeng., 28, 1735-1741 (1986).

18. Brinkmann, U., Mueller, R. H., Bobel, W., FEMS Microbiol. Lett., 87, 261-266 (1990).

19. Bryers, J., Yeh, T., Biochem. Eng., 589, 315-332 (1990).

20. Bobel, W., Brinkmann, U., Muller, R. H., Acta Biotechnol., 13, 211-242 (1993).

21. Brinkmann, U., Bobel, W., Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 98-103 (1992).

22. Anghel, I., Vamanu, A., Popa, O., Popa, C., Cercel, M., Biotehnologia şi Tehnologia Drojdiilor, vol. 3, Ed. Tehnică, Bucureşti, 260-300 (1993).

23. Bryers, J. D., Yeh, T., Bioprocess Eng., 6, 75-82 (1991).

24. Harder, W., Brooke, A. G., Methylotrophic Yeasts, Marcel Dekker, New-York, 395-428 (1990).

25. Gellisen, G., Hollenberg, C. P., Janowicz, Z. A., Gene Expression in Recombinant Microorganisms, Marcel Dekker, New-York, 195-239 (1994).

26. Elmeyargi, H., Coffaro, D., J. Ferment. Technol., 55, 581-590 (1997).

27. Wolf, K., Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New-York, 293-306 (1996).

28. Spencer, I., Spencer, D., Yeasts Technology, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New-York, 3-12 (1994).

29. Ausubel, F., Current protocols in Molecular Biology, A.3.0.1.-A.3.0.8., John Wiley & Sons, New-York (1994).

30. Trotsenko, V. A., Bystrysh, L. V., Biotech. Adv., 8, 105 – 119, (1990).

31. Tani, Y., Sawai, T., Sakay, Y., Biotechnol. Bioeng., 32, 1165 – 1169, (1988).

32. Tani, Y., Yondrada, T., Sakai, Y., Yoon, B. O., Microbial Growth on C₁ compounds, 282 – 288, (1987).

33. Kats, N., Mizuno, S., Imada, Y., Shimao, M., Sakazawa, C., APPL. Microbiol. Technol., 27, 567 – 571, (1988).

34. Sreekrishna, K., Potenz, R. H. B., Cruse, J. A., McCombie, W. R., Poeker, K. A., Nelles, L., Mazzaferro, P. K., Holden, K. A., Harrison, R. G., J. Basic. Microbiol, 28, 265 – 278, (1988).

35. Yonehera, T., Tani, Y., No. 2201, J. Ferment. Technol, 65, 255 – 260, (1987).

36. Shimizu, S., Ishido, M., Tani, Y., Ogata, K., J. Ferm. Technol., 55, 630 – 632, (1977).

37. Bystrykh, L. V., Romanov, U. P., Steczko, J., Tratsenko, Y. A., Biotechnol. Appl. Biochem., 11, 180-186, (1989).

38. Gleeson, M. A., Sudbery, P. E., The Methylotrophic Yeasts, 4, 293-303, (1988).

87