Izolarea unor mutante de Hansenula polymorpha ncy 495 cu capacitate ridicată de biosinteză a alcooloxidazei

3.6.1. Testarea mutantelor izolate

Activităţile alcooloxidazice ale mutantelor Hansenula polymorpha 15 şi 15 – 50 faţă de tulpina parentală sunt prezentate în Tabelul 2.

Tabelul 2. Activităţile enzimatice şi specifice pentru alcooloxidazele din Hansenula polymorpha şi mutantele 15 şi 15 – 50.

Tulpina	A.E., U/ml	A.S., U/mgproteină	mgproteină/ml
H. polymorpha	0,77	1,40	0,55
H. polymorpha 15	1,21	1,76	0,62
H. polymorpha 15 - 50	2,55	3,64	0,70

Se poate remarca faptul că, pe mediul cu metanol, mutanta Hansenula polymorpha 15 depăşeşte ca activitate alcooloxidazică tulpina parentală cu aproximativ 70%, iar mutanta 15 – 50, cu aproximativ 100% pe cea a mutantei Hansenula polymorpha 15. O primă problemă la care s-a căutat să se răspundă, a fost aceea dacă mutantele obţinute sunt constitutive sau nu. Mutantele constitutive se caracterizează prin capacitatea de a produce alcooloxidază indiferent de sursa de carbon [3]. Aceste mutante produc alcooloxidază şi pe mediul cu glucoză, la o concentraţie ridicată, în absenţa metanolului. Este cunoscut faptul că Hansenula polymorpha manifestă un oarecare grad de depresare catabolică a sintezei alcooloxidazei în prezenţa glucozei, în condiţii de limitare a acestei surse de carbon, în faza staţionară de creştere [4]. În aceste condiţii de creştere, după o reducere semnificativă a concentraţiei de glucoză, se sintetizează cantităţi reduse de alcooloxidază. Aceasta constituie motivul pentru care se apreciază că, în cazul levurii Hansenula polymorpha, mecanismele de reglare a sintezei alcooloxidazei sunt guvernate de represie/depresie, determinate de glucoză şi de inducere determinate de metanol [5]. Din acest motiv, determinarea activităţii alcooloxidazei la tulpinile crescute pe mediu cu glucoză şi metanol s-a efectuat la 16 ore, pentru a nu se atinge faza staţionară, în care sinteza alcooloxidazei este parţial depresată. Concentraţiile de glucoză utilizate au fost de 1,5% şi respectiv 0,75%, în amestec cu metanol, mult mai mari decât cele utilizate de Eggeling [6], astfel încât glucoza să nu fie epuizată după 16 ore de cultivare. În aceste condiţii atât mutantele cât şi Hansenula polymorpha parentală nu au prezentat activitate alcooloxidazică pe mediu, având ca sursă de carbon glucoza (Tabelul 3). De aici, putem trage concluzia că nici una din mutante nu este constitutivă.

Tabelul 3. Activităţile specifice pentru alcooloxidazele din Hansenula polymorpha şi mutante (U/mg_{substanţă uscată}).

Tulpina	MeOH (16 ore)	MeOH + glucoză (16 ore)	Glucoză (16 ore)
H. polymorpha	40,00	0	0
H. polymorpha 15	69,27	1,2	0
H. polymorpha 15 – 50	79,40	2,3	0
H. polymorpha 3	52,50	3,6	0
H. polymorpha 6	67,10	4,2	0

Având în vedere principiul de selecţie utilizat în cazul mutantelor 15 şi 15 – 50, care după 16 ore de la trecerea de pe mediu solid cu metanol pe mediu solid cu glucoză mai prezentau activitate alcooloxidazică, s-a considerat de interes analiza activităţii acestei enzime la diferite intervale de timp, la trecerea de pe mediu cu metanol pe mediu cu glucoză. Această analiză ne indică dinamica de inactivare a enzimei alcooloxidază. (Figura 5).

Se poate observa că alcooloxidaza este inactivă într-o relaţie direct proporţională cu intervalul de timp de trecere pe mediu cu glucoză. Cu cât cantitatea de alcooloxidază prezentă iniţial în celulă este mai mare, cu atât intervalul de timp necesar inactivării acesteia, ca urmare a trecerii pe glucoză este mai mare. Reducerea activităţii alcooloxidazice până aproape de zero este realizată în cazul tulpinii parentale la 8 ore, iar în cazul mutantelor, după 16 ore. Aceste rezultate, cât şi activităţile alcooloxidazice ale celor două mutante pe mediu cu metanol, indică faptul că ele au o capacitate de biosinteză mai ridicată decât a tulpinii parentale. Nivelul minim de activitate este uşor mai ridicat în cazul mutantelor decât în cazul tulpinii parentale, însă această activitate minimă dispare după pasaje repetate pe medii cu glucoză, la toate tulpinile investigate.

O altă investigaţie, care s-a efectuat în cazul acestor mutante, a fost activitatea alcooloxidazică pe mediu cu metanol şi glucoză (Tabelul 3). Aceste rezultate dau

Figura 5. Dinamica de inactivare a activităţii alcooloxidazice a tulpinii parentale Hansenula polymorpha şi a mutantelor 15 şi 15 – 50 ca urmare a trecerii din mediu cu metanol, în mediu cu glucoză.

indicaţii despre gradul de represare a sintezei alcooloxidazei în prezenţa glucozei. În cazul tulpinii parentale valoarea activităţii alcooloxidazice este zero. Cea mai ridicată activitate alcooloxidazică o prezintă mutanta Hansenula polymorpha 6, care a fost apoi testată în condiţii pilot pentru obţinerea de biomasă proteică pe substrat mixt. Ţinând cont de activitatea alcooloxidazică realizată pe mediu cu metanol, a fost aleasă, pentru testări pilot, mutanta Hansenula polymorpha 15 – 50.

3.6.2. Caracterizarea mutantelor Hansenula polymorpha 15 – 50 şi Hansenula polymorpha 6
3.6.2.1. Caracteristici morfologice şi ale reproducerii vegetative şi sexuate

Ca şi tulpina parentală, mutantele se prezintă în stare haploidă şi diploidă. Dimensiunea celulelor este de 1 – 3,4 × 2,1 – 4,3 m. Celulele haploide sunt elipsoidale sau cilindrice şi se întâlnesc singure sau în perechi. Celulele haploide sunt sferice şi sferoidale şi au diametrul de 3,4 – 5,2 m. Crescute pe mediu Sabouraud sau pe mediu cu peptonă – glucoză – yeast extract, coloniile sunt netede, strălucitoare, întregi şi lipsite de hife. Nu se formează pseudomiceliu sau hife, indiferent de condiţiile de creştere şi de sursa de carbon utilizată. Coloniile haploide au culoare albă sau roz, iar cele diploide care sporulează, au culoarea roşie. În timpul izolării, celulele haploide produc numeroase celule diploide. Conjugarea celulelor haploide se realizează între celulă şi mugurele său. Celulele haploide produc ascospori, care sunt în număr de 1 – 4 la ambele mutante.