Izolarea unor mutante de Hansenula polymorpha ncy 495 cu capacitate ridicată de biosinteză a alcooloxidazei

Tulpina Hansenula polymorpha 6, obţinută prin mutageneză în prezenţa metanolului şi glucozaminei prezintă un metabolism diauxic prin consumarea simultană a două surse de carbon, atât în sistem batch, cât şi în sistem continuu, cu un randament de bioconversie a substratului mixt de 44,45%, la un raport C₁ – C₆ de 4:1 şi 6:1.

Biomasa de Hansenula polymorpha obţinută pe substrat mixt a fost liofilizată şi utilizată la realizarea unui produs probiotic original de uz veterinar, denumit „Bactoprolact”, care a fost brevetat în anul 1998.
3.9.1. Producerea unor metaboliţi de către drojdiile metilotrofe

În afară de biomasa proteică, drojdiile metilotrofe sunt capabile să producă, diferiţi produşi chimici comerciali de fineţe cum ar fi formaldehida, formiatul, peroxidul de hidrogen, dihidroxiacetona, ATP, FAD şi o proteină specifică alcooloxidaza. Aceste produse sunt obţinute cu tulpini de drojdii mutante sau recombinante.

Treptele primare ale metabolismului metanolului în drojdii sunt prezentate schematic în Figura 15. Metanolul este oxidat la CO₂, via formaldehidă şi formiat, reacţiile fiind catalizate de două enzime peroxizomale, alcooloxidaza şi catalaza şi de două enzime citosolice, formaldehid-dehidrogenaza şi formiat dehidrogenaza (FADH respectiv FAH). Aceste ultime enzime generează NADH şi energie pentru biosintezele celulare. Formaldehida este primul intermediar în biosinteza celulei şi intră în calea de asimilaţie prin reacţie cu xilulozo – 5P. Această reacţie este catalizată de o altă enzimă peroxizomală, în special o traschetolază (dihidrixiaceton – sintaza, DHAS) şi rezultă două triose – gliceraldehid – 3P şi dihidroxiacetonă (DHA). Ultima este fosforilată de către o kinază specifică (DHAK) la dihidroxiacetonfosfat (DHAP), care este în mod uzual folosit în biosinteza constituenţilor celulari, ori este convertit la gliceraldehid – 3P, implicat în regenerarea xilulozo – 5P, care este acceptorul primar al formaldehidei în calea de asimilaţie [30].


Figura 15. Treptele primare ale metabolismului metanolului la drojdii.
Tulpinile sălbatice de drojdii metilotrofe sunt incapabile de a produce metaboliţi în stadiile primare de asimilaţie, de aceea au fost dezvoltate procese biotehnologice bazate pe tulpini mutante. Studiile au fost axate pe căile de reglare a enzimelor cheie în metabolismul compuşilor C₁. Din acest punct de vedere tulpinile de drojdii mutante implicate în reglarea metabolismului metanolului au nevoie pentru producerea de diverşi metaboliţi, să se dezvolte pe substraturi mixte (C₁ + C_n). Pentru aceasta s-a studiat influenţa mecanismului metabolic de represie/inactivare a enzimelor C₁ implicate în stadii primare ale metabolismului metanolului, la compuşi policarbonaţi cum sunt glucoza şi etanolul. A rezultat că tulpinile sălbatice de drojdii metilotrofe sunt incapabile de a utiliza simultan compuşi C₁ şi în special C_n în sistemul de cultivare batch.

Câteva tulpini mutante implicate în represia catabolică ale enzimelor primare C₁, au fost selectate din clone rezistente la 2 – deoxy – D – glucoză. Aceste mutante sunt atractive pentru producerea de aditivi furajeri şi în tratamentul apelor industriale uzate, care conţin metanol şi pentoze [31].

De asemenea s-a izolat o tulpină mutantă de Candida boidinii cu un conţinut ridicat de alcooloxidază capabilă să producă formaldehidă cu un randament foarte mare (Tabelul 25) [32].

Tabelul 25. Producerea de aldehide din alcooli de către Candida boidinii S₂.

Substrat	Produs (mM)	Timp de reacţie (h)	Randament (%)	pH optim
Metanol	Formaldehidă (1090)	10	36	6
Etanol	Acetaldehidă (430)	1,5	100	7,5 – 8,5
4 – propanol	Propionaldehidă (8+)	1,5	100	7,5 – 8,5
Alcool etilic	Acroleină (540)	2	62	6 – 5

Pentru permeabilizarea celulelor de drojdie, acestea au fost tratate cu un detergent cationic, eliberându-se din celulă formaldehida, formiat-dehidrogenaza, catalaza, dar nu şi alcooloxidaza (AOX) (Tabelul 26).

Au fost izolate de asemenea câteva tulpini de mutante (leu^-) de Hansenula polymorpha care şi-au pierdut abilitatea de a se dezvolta pe metanol. La mutantele de primul tip (AOX^-), nu s-a evidenţiat activitate alcooloxidazică. Tulpina W₂₁₈ care este defectivă de formiat dehidrogenază (FDH^-), acumulează formiat în timpul incubării pe mediu cu metanol şi prezintă o foarte slabă activitate alcooloxidazică (Tabelul 26).
Tabelul 26. Producerea de intermediari primari ai metabolismului metanolului de către tulpini mutante de drojdii metilotrofe.

Produs (mM)	Candida boidinii S2	Hansenula polymorpha			Randament (%)
		R9	65	W218	practic	teoretic
Formaldehida	1090 1530^*				36 50^*	100
Formiat				0,7	5	100
Peroxid de hidrogen		7,5			4	100
Dixidroxiacetonă + glicerol			81		19	25