Izolarea unor mutante de Hansenula polymorpha ncy 495 cu capacitate ridicată de biosinteză a alcooloxidazei

Din datele obţinute se observă că absorbanţa maximă pentru toate tulpinile de Hansenula s-a înregistrat la 100⁰C. Temperatura medie de denaturare ™ este de aproximativ 75⁰C pentru tulpinile de Hansenula (parentală şi mutante). Figurile 7, 8, 9, 10 ilustrează shiftul hipercromic pentru tulpinile luate în studiu. Pe baza acestora s-au determinat valorile (Tm) şi s-au calculat conţinuturile în % G + C (Tabelul 8) [11].

Tabelul 8. Valorile absorbanţei medii înregistrate la  = 260 nm, ale Tm şi ale conţinutului % G + C.

Tulpina	Amedie  = 260 nm	Tm, ^0C	% G + C
Hansenula polymorpha parentală	0,275	75	49,6
Hansenula polymorpha 15	0,286	73	45,5
Hansenula polymorpha 15 – 50	0,242	76	51,6
Hansenula polymorpha 6	0,274	72	43,4

Valorile conţinutului în (% G + C) sunt în concordanţă cu datele din literatura de specialitate, situându-se între 43,4 şi 51,6 pentru tulpinile de Hansenula polymorpha. Li şi alţii [11] arată că drojdiile ascomicete prezintă un procent de (% G + C) cuprins între 27% şi 51%, iar cele bazidiomicete de 50 – 70%. Micile variaţii ale acestui procent sunt normale, dată fiind utilizarea în studiu a unor tulpini noi, diferite de cele ale altor laboratoare în care s-au mai efectuat astfel de studii. Studiile efectuate demonstrează că metoda utilizată asigură o bună izolare şi purificare a ADN genomic de drojdii. Procentul de (% G + C) este un parametru stabil în timp şi asigură informaţii valoroase de taxonomie, fiind tulpină – specific.

Figura 7. Shiftul hipercromic la Hansenula polymorpha – tulpina parentală.




Figura 8. Shiftul hipercromic la Hansenula polymorpha – mutanta 15.




Figura 9. Shiftul hipercromic la Hansenula polymorpha – mutanta 50.


Figura 10. Shiftul hipercromic la Hansenula polymorpha – mutanta 6.


3.8. Proces biotehnologic de cultivare în sistem continuu a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50, în bioreactoare de tip JAR

Compoziţia mediului de cultură pentru obţinerea de biomasă proteică prin cultivarea tulpinii de drojdie metilotrofă Hansenula polymorpha, mutanta 15 – 50 în flux continuu cuprinde, %(g/v): KH₂PO₄ – ca sursā de fosfor şi potasiu; (NH₄)₂SO₄ – 0,2; extract de porumb – 0,2 (ca substanţă uscată); MgSO₄7H₂O – 0,05; FeSO₄×7H₂O – 0,005; microelemente (Mn, Cu, Zn). Soluţia de săruri se prepară separat într-un volum de 3 l apă de proces, iar extractul de porumb, într-un volum de 2 l apă de proces. Componentele mediului au fost sterilizate la 120⁰C, 20 minute.

Fluxul tehnologic a cuprins următoarele etape (Figura 11):

1. 
   Realizarea inoculului de laborator, la flacoane agitate;
   
2. 
   Cultivarea în sistem batch în bioreactoare de tip JAR;
   
3. 
   Cultivarea în sistem continuu în bioreactor de tip JAR;
   
4. 
   Separarea biomasei de drojdie din mediul de cultură şi caracterizarea fizico – chimică a biomasei obţinute.
   

3.8.1. Realizarea inoculului de laborator prin cultivarea tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50, la flacoane agitate

Dezvoltarea inoculului de laborator s-a realizat cu ajutorul unui agitator tip

Shaker la 37⁰C, timp de 44 de ore. Pe parcursul dezvoltării inoculului s-a corectat pH la valoarea 4 cu soluţie amoniacală 12,5% şi s-a adăugat eşalonat metanolul.

Caracteristicile inoculului de laborator, pentru inocularea reactoarelor de tip JAR sunt prezentate în Tabelul 9.

Tabelul 9. Caracteristicile inoculului de Hansenula polymorpha 15 – 50, la flacoane agitate.

Durată bioproces, ore	Metanol		Metanol rezidual, g%	PH	Corecţie pH	Fosfor anorganic, ppm	WCW, g×l^-1	DCW, g×l^-1
	ml	g%
0	0,5	0,4	-	4,0	-	605	-	-
12	0,5	0,4	-	3,5	+	-	-	-
24	0,5	0,4	-	3,4	+	-	-	-
36	1,0	0,8	-	3,1	+	-	-	-
44	-	-	0,09	2,6	+	400	45,6	9,2

Durata dezvoltării inoculului de Hansenula polymorpha 15 – 50 este de 44 de ore, iar cantitatea de biomasă obţinută este de aproximativ 9 g×l^-1, ceea ce denotă că tulpina mutantă Hansenula polymorpha 15 – 50 are o viteză mare de creştere şi produce o cantitate mare de biomasă.

Subcultivarea pe mediu solid

Inocul de laborator

Flacoane agitate

Cultivare în sistem batch
Bioreactor JAR

Amoniac Aer steril

Metanol

Aer steril

Cultivare în sistem continuu

Bioreactor JAR

Mediu de cultură

Metanol

Amoniac

Separarea biomasei, plasmoliza, uscare, caracterizare fizico - chimică

Figura 11. Fluxul tehnologic de cultivare în sistem continuu a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50.

3.8.2. Cultivarea în sistem batch a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50 în bioreactor de tip JAR
Cultivarea în sistem batch este prima fază din cadrul procesului de cultivare în sistem continuu pentru obţinerea de biomasă proteică cu tulpina mutantă Hansenula polymorpha 15 – 50. Parametrii de cultivare şi caracteristicile bioprocesului în sistem batch sunt prezentate în Tabelul 10.
Tabelul 10. Parametrii de cultivare şi caracteristicile bioprocesului de fermentaţie în sistem batch a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50 în bioreactorul de tip JAR.

Parametrii de cultivare şi caracteristicile bioprocesului	Valori experimentale
Durată bioproces, ore	44
Temperatură, ^0C	37
Rată de aerare, l/l/m/m	1
Agitare, rpm	800
Presiune în bioreactor, barr	0,4
Fosfor iniţial, ppm	615
Fosfor final, ppm	154
Potasiu iniţial, ppm	750
Potasiu final, ppm	320
Azot iniţial, ppm	508
Azot final, ppm	350
Fier iniţial, ppm	11
Fier final, ppm	1,5
Consum specific metanol, kg/kg	2,63
Consum specific amoniac, kg/kg	1,76
WCW final, g×l^-1	140,75
DCW final, g×l^-1	43,92
Conţinut în proteină totală, %	45
Randament de bioconversie, %	40

Cantitatea de biomasă obţinută în sistemul de cultivare batch a fost de 2,21 kg consumându-se 5,6 kg metanol, 1,2 kg amoniac, 430 ppm fosfor, 430 ppm potasiu, 158 ppm azot şi 9,5 ppm fier (Tabelul 11 şi Figura 12).

Figura 12. Consumul de fosfor, potasiu şi azot din cadrul bioprocesului de cultivare în sistem batch a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50, în bioreactor de tip JAR.

Tebelul 11. Concentraţia metanolului rezidual din mediul de cultură, consumul de fier şi concentraţia celulară umedă (WCW) şi uscată (DCW) în cadrul bioprocesului de cultivare în sistem batch a drojdiei metilotrofe Hansenula polymorpha 15 – 50.

Durată bioproces, ore	Metanol rezidual, g%	WCW, g/l	DCW, g/l	Consum fier, ppm
0	0,260	-	-	11,0
6	0,160	15,20	3,70	10,0
12	0,316	20,95	5,80	8,0
18	0,240	30,45	9,10	6,5
24	0,122	46,35	13,62	6,1
30	0,210	65,90	19,77	5,2
36	0,169	93,77	27,42	4,3
40	0,228	116,70	34,0	3,4
44	0,288	140,75	43,92	1,5

Evoluţia concentraţie celulare în cadrul cultivării tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50 în sistem batch în bioreactorul de tip JAR este prezentată în Tabelul 12.

Tabelul 12. Evoluţia funcţiilor X (t) şi  (t) din cadrul bioprocesului în sistem batch a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50, în bioreactor JAR.

Nr. probe	1	2	3	4	5	6	7	8
t, ore	6	12	18	24	30	36	42	44
X, g×l^-1	3,70	5,80	9,10	13,62	19,77	27,42	34,0	44,00
ln X	1,30	1,75	2,20	2,61	2,98	3,31	3,53	3,78
Ln X – ln (X – 1)	-	0,45	0,45	0,41	0,37	0,33	0,22	0,26
, h^-1	-	0,11	0,11	0,10	0,09	0,08	0,055	0,13

_mediu = 0,096h^-1; T_D = = = 7,18h; _max = = = 0,136h^-1

Analizând rezultatele obţinute prin cultivarea drojdiei metilotrofe Hansenula polymorpha 15 – 50 în sistem batch, se poate constata că durata bioprocesului este de 44 de ore consumul specific de metanol a fost de 2,63 kg/kg, iar concentraţia celulară (DCW) a fost de 44 g×l^-1 faţă de 40 g×l^-1, raportate recent în literatura de specialitate de către Boev şi alţii [12] şi obţinută prin cultivarea unei tulpini de Hansenula polymorpha pe substrat metanolic. Conţinutul în proteină totală a fost de 45%, comparabil cu valorile prezentate în studiile de specialitate pentru această tulpină, care este cuprins între 43 – 50% [13].
3.8.3. Bioproces de cultivare în sistem continuu a tulpinii de drojdie metilotrofă Hansenula polymorpha 15 – 50 în bioreactor de tip JAR
Parametrii de operare ai bioprocesului au fost: temperatura 37⁰C, rată de aerare 1 l/l/min, agitare 800 rpm, pH 4, concentraţia metanolului în mediul de cultură 0,1 – 0,3%.

Cultivarea în sistem continuu s-a început cu rata de diluţie D = 0,10 h^-1, corespunzătoare vitezei medii de creştere a tulpinii Hansenula polymorpha 15 – 50 în sistem batch, urmată de D = 0,11 h^-1, D = 0,12 h^-1 şi D = 0,13 h^-1, rată de diluţie corespunzătoare vitezei maxime de creştere (_max) a tulpinii de drojdie.

Rezultatele bioprocesului de cultivare în flux continuu a tulpinii de drojdie metilotrofe Hansenula polymorpha 15 – 50 sunt prezentate în Tabelele 13, 14, 15, 16 şi Figura 13.


Tabelul 13. Bioproces de cultivare în flux continuu a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50 la D = 0,10 h^-1.

Durată bioproces, ore	Metanol rezidual, %	WCW, g×l^-1	DCW, g×l^-1	P, ppm	K, ppm	N, ppm	Fe, ppm
0	0,288	140,75	43,92	154	320	330	1,5
4	0,170	141,80	44,50	160	340	340	2,3
8	0,240	138,60	42,70	180	345	338	2,6
12	0,310	141,80	43,60	175	330	345	3,5
16	0,105	140,90	43,50	190	360	335	3,0
20	0,220	136,40	41,70	185	350	360	3,4
24	0,270	139,50	43,80	168	330	370	3,1

Durata bioprocesului a fost de 24 de ore, iar concentraţia celulară a fost de 43,38 g×l^-1.Debitul de alimentare corespunzător acestei rate de diluţie a fost de 5 l×h^-1. S-au obţinut 5,206 kg biomasă, consumându-se 12,753 kg metanol şi 4,5 kg amoniac. Consumul specific de metanol a fost de 2,45, iar de amoniac de 0,86. Productivitatea celulară la această rată de diluţie a fost de 4,34 g×l^-1×h^-1, iar randamentul de bioconversie a metanolului în biomasă a fost de 41%, biomasa proteică având un conţinut în proteină totală de 47,50%. Timpul de dedublare a concentraţiei celulare la D = 0,10 h^-1 a fost:

T_D = = 6,90 ore

Tabelul 14. Bioproces de cultivare în flux continuu a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50 la D = 0,11 h^-1.

Durată bioproces, ore	Metanol rezidual, %	WCW, g×l^-1	DCW, g×l^-1	P, ppm	K, ppm	N, ppm	Fe, ppm
0	0,270	141,50	40,30	168	330	370	3,1
4	0,215	138,80	40,70	175	356	385	2,9
8	0,310	136,70	39,90	170	348	370	2,7
12	0,157	138,80	39,80	188	350	360	3,3
16	0,216	140,60	40,80	165	360	364	2,9
20	0,180	142,60	40,65	176	370	355	3,4
24	0,226	140,50	39,50	181	385	363	3,6

Durata bioprocesului a fost de 24 de ore, iar concentraţia celulară medie a fost de 40,09 g×l^-1. Debitul de alimentare corespunzător acestei rate de diluţie a fost de 5,5 l×h^-1. S-au obţinut 5,292 kg biomasă, consumându-se 12,950 kg metanol şi 4,6 kg amoniac. Consumul specific de metanol a fost de 2,38 kg/kg, iar de amoniac de 0,87 kg/kg. Productivitatea celulară la această rată de diluţie a fost de 4,4 g×l^-1×h^-1, iar randamentul de bioconversie a metanolului în biomasă a fost de 40,86%, biomasa proteică având un conţinut în proteină totală de 47,20%. Timpul de dublare a concentraţiei celulare la D = 0,11 h^-1 a fost:

T_D = = 6,27 ore
Tabelul 15. Bioproces de cultivare în flux continuu a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50 la D = 0,12 h^-1.

Durată bioproces, ore	Metanol rezidual, %	WCW, g×l^-1	DCW, g×l^-1	P, ppm	K, ppm	N, ppm	Fe, ppm
0	0,226	140,50	39,50	181	385	363	3,0
4	0,310	135,60	37,20	189	370	380	3,2
8	0,120	137,20	38,50	185	380	375	2,8
12	0,240	136,40	37,60	190	384	383	3,6
16	0,270	134,70	36,90	186	370	387	3,5
20	0,155	137,40	38,60	176	385	377	3,6
24	0,230	136,40	38,40	189	391	385	3,3

Durata bioprocesului a fost de 24 de ore, iar concentraţia celulară medie a fost de 38,04 g×l^-1. Debitul de alimentare corespunzător acestei rate de diluţie a fost de 6,0 l×h^-1. S-au obţinut 5,478 kg biomasă, consumându-se 13,038 kg metanol şi 4,930 kg amoniac. Consumul specific de metanol a fost de 2,85 kg/kg, iar de amoniac de 0,90 kg/kg. Productivitatea celulară la această rată de diluţie a fost de 4,56 g×l^-1×h^-1, iar randamentul de bioconversie a metanolului în biomasă a fost de 42%, biomasa proteică având un conţinut în proteină totală de 46,35%. Timpul de dublare a concentraţiei celulare la D = 0,12h^-1 a fost:

T_D = = 5,75 ore
Tabelul 16. Bioproces de cultivare în flux continuu a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50 la D = 0,13h^-1.

Durată bioproces, ore	Metanol rezidual, %	WCW, g×l^-1	DCW, g×l^-1	P, ppm	K, ppm	N, ppm	Fe, ppm
0	0,230	136,40	38,40	189	391	385	3,3
4	0,245	132,50	36,50	183	384	375	3,7
8	0,166	130,40	35,20	195	395	384	3,5
12	0,337	133,60	36,60	191	390	389	3,8
16	0,235	134,70	36,25	194	394	395	3,4
20	0,154	132,80	35,40	193	396	391	3,6
24	0,248	132,70	36,30	190	393	396	3,9
28	0,315	131,60	35,70	191	394	387	3,5
32	0,175	133,00	36,45	198	396	395	3,8
36	0,230	132,80	36,10	201	393	390	4,1
40	0,214	130,75	35,40	197	390	395	3,9
44	0,145	132,40	36,35	205	404	402	4,3
48	0,180	131,50	35,50	200	397	395	4,2

Durata bioprocesului a fost de 48 de ore, iar concentraţia celulară medie a fost de 36,16 g×l^-1. Debitul de alimentare corespunzător acestei rate de diluţie a fost de 6,5 l×h^-1. S-au obţinut 11,280 kg biomasă, consumându-se 25,944 kg metanol şi 10,828 kg amoniac. Consumul specific de metanol a fost de 2,3 kg/kg, iar de amoniac de 0,96 kg/kg. Productivitatea celulară la această rată de diluţie a fost de 4,7 g×l^-1×h^-1, iar randamentul de bioconversie a metanolului în biomasă a fost de 43,37%, biomasa proteică având un conţinut în proteină totală de 47,05%. Timpul de dublare a concentraţiei celulare la D = 0,13 h^-1 a fost:

T_D = = 5,30

ore

Figura 13. Bioprocesul de cultivare continuă a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 15 – 50, în bioreactor de tip JAR.
Analizând rezultatele obţinute se poate constata că la rata de diluţie, D = 0,13h^-1, s-a obţinut cea mai mare productivitate şi cel mai mare randament de bioconversie a metanolului şi cel mai mic timp de dublare a concentraţiei celulare (Tabelul 17).
Tabelul 17. Caracteristicile bioprocesului de cultivare în flux continuu a tulpinii de drojdie metilotrofă Hansenula polymorpha 15 – 50.

Rată de diluţie, h^-1	Debit de alimentare, l×h^-1	Durată bioproces, ore	DCW mediu, g×l^-1	Productivitate, g×l^-1×h^-1	Consum specific metanol, kg/kg	Consum specific amoniac, kg/kg	Randament de bioconversie, %	Conţinut în proteină, %
0,10	5,0	24	43,38	4,34	2,45	0,86	41,00	47,50
0,11	5,5	24	40,09	4,40	4,38	0,87	40,86	47,20
0,12	6,0	24	38,04	4,56	2,38	0,90	42,00	46,30
0,13	6,5	48	36,16	4,70	2,30	0,96	43,47	47,00

Comparând valoarea parametrilor de cultivare în flux continuu a tulpinii Hansenula polymorpha 15 – 50, cu valoarea medie a parametrilor din literatura de specialitate, se poate observa că în ceea ce priveşte temperatura, concentraţia celulară, productivitatea şi randamentul de bioconversie, valorile sunt mai mari decât media valorilor din studiile de literatură, însă mai mici în ceea ce priveşte conţinutul în proteină totală şi randamentul de bioconversie a metanolului.Aceşti parametri sunt caracteristici pentru tulpinile de Hansenula polymorpha şi se datorează influenţei temperaturii la care are loc creşterea şi bioprocesul de fermentaţie. Din studiile efectuate de Coney şi Makiguchi [14] şi Hunter şi Rose [15] reiese faptul că la tulpinile de Hansenula polymorpha, maximul randamentului de conversie a substratului se înregistrează la o temperatură mai scăzută decât cea la care se obţine viteza maximă de creştere (_mediu).

Varianta pentru care se optează poate fi influenţată de accesibilitatea şi de preţul de cost al substratului, importanţa şi valoarea economică a produsului obţinut şi de restricţiile impuse de protecţia mediului.

Biomasa rezultată din procesul de fermentaţie a fost separată prin centrifugare, plasmolizată la 90⁰C şi uscată la 105⁰C, timp de 8 ore. Caracteristicile biomasei proteice de Hansenula polymorpha 15 – 50 sunt prezentate în Tabelul 18.

Tabelul 18. Caracteristicile biomasei proteice obţinute prin cultivarea tulpinii de drojdie metilotrofă Hansenula polymorpha 15 – 50 pe substrat metanol în flux continuu.

Sistem de cultivare	C.P., %	Umiditate reziduală, %	Cenuşă, %	Lipide, %	P, %	K, %	Fe, ppm	Digestibilitate, %	Conţinut în acizi nucleici, %
Batch	45	5,8	9,3	6,20	1,47	1,20	250	90,9	4,65
Flux continuu	47,05	6,1	8,5	6,02	1,37	1,25	350	93,0	4,82

Conform studiilor din literatura de specialitate [16], un proces de fermentaţie pentru producerea de biomasă microbiană cu drojdii se desfăşoară între 26 şi 35⁰C. O creştere a temperaturii de lucru la 37 – 40⁰C ar avea câteva avantaje: costuri energetice reduse pentru răcire, costuri scăzute pentru dispozitivele de răcire, contaminare mai mică în cazul folosirii drojdiilor. Un microorganism cu o temperatură de creştere optimă mai mare de 35⁰C, cum este cazul tulpinii Hansenula polymorpha 15 – 50 poate fi considerat valoros.

3.9. Proces biotehnologic de obţinere a biomasei proteice prin cultivarea tulpinii mutante Hansenula polymorpha 6 pe substrat mixt, metanol – glucoză
Hansenula polymorpha este o drojdie facultativ metilotrofă capabilă să metabolizeze, fie metanolul ca singură sursă de carbon şi energie, fie o varietate de compuşi organici mult mai complecşi. Pentru mărirea vitezei specifice de creştere () a cantităţii de biomasă şi a randamentului de bioconversie a substratului s-a utilizat tulpina mutantă de drojdie Hansenula polymorpha 6, într-un proces de creştere diauxică prin utilizarea simultană a două surse de carbon, metanol şi glucoză. Procesul a fost realizat într-un bioreactor „Biotec LKB”, având capacitatea de 8 l. Compoziţia mediului de cultură pentru sistemul de cultivare batch şi cel continuu a fost similară cu cea utilizată în cultivările tulpinei Hansenula polymorpha 15 – 50. Substratul mixt utilizat a fost format din glucoză şi metanol în raport de 1:6. Pe durata bioprocesului concentraţia metanolului din mediul de cultură s-a menţinut la valoarea 0,3%, iar cea a glucozei la 0,05%. pH a fost corectat la valoarea 4,0 cu soluţie amoniacală 12,5%.

Parametrii de biosinteză şi caracteristicile procesului de cultivare în sistem batch a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 6 pe substrat mixt sunt prezentaţi în Tabelele 19, 20 şi Figura 14.

La sfârşitul celor 40 de ore de cultivare în sistem batch s-au obţinut 370 g biomasă, consumându-se 240 g metanol şi 60 g glucoză. Randamentul de bioconversie a substratului mixt în biomasă a fost de 40,10%, iar consumul specific de 2,5. Concentraţia biomasei celulare obţinute a fost de 46,85 g×l^-1, fiind mai mare decât concentraţia biomasei celulare obţinute cu Hansenula polymorpha 15 – 50 pe substrat metanol. Consumul specific de metanol la Hansenula polymorpha 6 a fost de 2, faţă de 2,63 la Hansenula polymorpha 15 – 50, acest fapt demonstrând că glucoza stimulează utilizarea mai eficientă a metanolului în cazul cultivărilor pe substrat mixt.
Tabelul 19. Parametrii de cultivare şi caracteristicile bioprocesului de fermentaţie în sistem batch a tulpinii mutante Hansenula polymorpha 6 pe substrat mixt.

Parametrii de cultivare şi caracteristicile bioprocesului	Valori experimentale
Durată bioproces, ore	40
Temperatură, ^0C	37
Rată de aerare, l/l/m/m	1
Agitare, rpm	900
Fosfor iniţial, ppm	590
Fosfor final, ppm	130
Potasiu iniţial, ppm	730
Potasiu final, ppm	225
Azot iniţial, ppm	440
Azot final, ppm	275
Fier iniţial, ppm	12
Fier final, ppm	1,7
Consum specific metanol, kg/kg	2,5
Consum specific amoniac, kg/kg	1,05
WCW/DCW , g×l^-1	46,85
Conţinut în proteină totală, %	48,7
Randament de bioconversie, %	40,10

Tabelul 20. Concentraţia metanolului şi a glucozei, consumul de fier şi concentraţia biomasei celulare umede (WCW) şi uscate (DCW) în cadrul bioprocesului de cultivare în sistem batch a drojdiei metilotrofe Hansenula polymorpha 6, pe substrat mixt.

Durată bioproces, ore	Metanol, %	Glucoză, %	WCW, g×l^-1	DCW, g×l^-1	Consum fier, ppm
0	0,197	0,050	-	-	12,0
8	0,210	0,055	18,20	4,50	9,0
16	0,205	0,052	31,20	7,50	7,4
24	0,187	0,046	75,40	14,20	5,1
32	0,213	0,056	130,20	30,60	3,4
40	0,205	0,048	147,30	46,85	1,7