Las Glucogenosis en España: Situación Actual y Guías Informativas

2. La terapia génica

El conocimiento del órgano afectado y del mecanismo molecular alterado en

cada tipo de enfermedad es de gran importancia para el diseño de estrategias te-
rapéuticas basadas en terapia génica, ya que es esencial conocer tanto el órgano
diana como el gen terapéutico.

El tratamiento definitivo para algunas glucogenosis es el transplante alogénico

de medula ósea, indicando de forma directa que la transferencia de una versión co-
rrecta del gen es capaz de revertir la enfermedad ( 1,2). También el transplante he-
pático para algunos de estos desordenes a supuesto la cura de la enfermedad (3).
Esta evidencia junto con las investigaciones realizadas sobre los mecanismos mo-
leculares que dan lugar a estas enfermedades y que han permitido conocer el gen
deficitario, abre las puertas para el desarrollo de estrategias terapéuticas basadas
en la transferencia del gen corrector.

Curar la glucogenosis a través de la terapia génica significa corregir el defecto

genético de una persona colocando genes no defectuosos y que funcionen nor-
malmente en sus células (4). La terapia génica no es un concepto nuevo; desde
hace treinta años, los científicos especulaban acerca de sus posibilidades, pero
muchos obstáculos técnicos impidieron estudios más formales sobre la misma en
esc momento. Si bien algunos de estos obstáculos han sido superados, otros per-
sisten junto con nuevos problemas.

La terapia génica para una determinada enfermedad requiere en primer lugar

la construcción de un sistema de expresión génica portador del gen terapéutico
que está compuesto por el gen terapéutico y las secuencias reguladoras de la ex-
presión. Por otro lado es necesario contar con un sistema de transporte o vehicu-
lización de este material génico, que sea capaz de hacer llegar con la mayor
especificidad y eficacia posible el gen terapéutico a la célula diana (5).

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Figura 1 : Representación gráfica de un protocolo de terapia génica.

Para la construcción del sistema de expresión o casete de expresión en primer

lugar es necesario conocer el gen deficitario y obtener su secuencia. Normalmente
esta secuencia se obtiene a partir del RNA mensajero (mRNA) el cual se trans-
formará en DNA complementario (cDNA) mediante una reacción de transcrip-
ción reversa. Este RNA mensajero contiene la secuencia de nucleótidos portadora
de la información necesaria para la producción de la proteína pero su síntesis no
es posible si no se añaden otras secuencias de DNA que regulan la expresión. Den-
tro de estas secuencias encontramos las secuencias promotoras, estas secuencias
regulan los niveles de expresión y además controlan en que tipo de tejido o célula
se expresa un determinado gen (6-8). Existen promotores que son activos en cual-
quier tipo celular, promotores ubicuos, o protores que solo son activos en un tipo
concreto de célula o tejido, promotores específicos. La actividad de los promoto-
res puede ser modulada por secuencias que aumentan su actividad, "enhanccer" o
secuencias que la inhiben en determinadas circunstancias. Por otro lado todas las
construcciones deben llevar una secuencia señal para su poliadenilación y que es
esencial para la estabilidad del RNA mensajero (5).

Figura 2: Representación esquemática de un sistema o cásete de expresión.

2.1 Tipos de terapia génica

Enviar una información a un grupo de células del organismo puede hacerse de dos

formas distintas: Inyectando directamente el vector en el paciente (estrategia in vivo-
dentro del cuerpo) o inyectando el gen en células sanas del paciente que se han extra-
ído antes mediante una biopsia (estrategia ex vivo-fuera del cuerpo) (9,10).

2.1.1 La terapia génica ex vivo está basado en la obtención previa de células

del paciente procedentes de un tejido u órgano de interés. A continuación se pro-
cede a la disgregación de las mismas y su mantenimiento en condiciones de cul-
tivo de tejidos in vitro, en donde las células son posteriormente modificadas

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mediante la administración del "gen terapéutico" utilizando para ello normalmente

virus recombinantes con capacidad para integrar su genoma en la célula huésped
como lentivirus y retrovirus. Las células así modificadas son seleccionadas en
función de su capacidad para expresar el gen exógeno de forma estable y persis-
tente. Una vez seleccionadas son amplificadas y recolectadas con el fin de ser
reimplantadas al paciente.

2.1.2 La terapia génica ex vivo está basada en la administración sistemática de

la construcción génica de interés. Aunque el ADN puede ser administrado de
forma directa lo habitual es recurrir a la ayuda de algún vector que facilite el pro-
ceso de transferencia del gen y permita la entrada y localización intracelular del
mismo, de tal forma que éste resulte en un gen funcionante. Así mismo, es im-
portante recurrir a vectores con destinos específicos dentro del organismo lo cual
permite la entrega celular selectiva del gen en un determinado órgano o tejido, sin
requerir para ello procedimientos traumáticos o quirúrgicos.

2.2 Vehículos de transferencia génica.

Los vehículos para la transferencia génica pueden ser divididos en dos cate-

gorías: los vectores no virales y virales.

2.2.1 Vectores no virales:

Estos sistemas no-virus, no tienen restricciones en cuanto al tamaño de la in-

formación transportada y tampoco originan respuestas inmunológicas en el pa-
ciente. Sin embargo, su tasa de eficiencia, de llegar a las células de interés, es baja.
Como norma general, la transducción derivada de estos tipos de vectores suele
ser corta en el tiempo, aunque tienen la ventaja de que pueden ser readministra-
dos ya que no inducen la generación de anticuerpos que bloqueen una adminis-
tración posterior. Hay muchos tipos de vectores no virales, pero los más habituales
son los plásmidos y los liposomas portadores de plásmidos (11).

Los plásmidos son cadenas circulares de ADN donde se introduce el gen con

propiedades curativas. Es un sistema de transporte de información habitual en la
naturaleza ya que, por ejemplo, las bacterias, lo utilizan para pasar genes de una
célula a otra. La administración de DNA es el sistema más sencillo ya que solo re-
quiere el crecimiento de las bacterias que lo portan y su purificación por métodos
standard. La administración al los individuos puede realizarse mediante inyección
directa en músculo o piel, o utilizando otras técnicas que aumentan la eficiencia
de transducción como la electroporación o la pistola génica (12).

Los liposomas son pequeñas vesículas huecas con una pared formada por lípi-

dos, las cuales se cargan de plásmido. Su principal ventaja es que su envoltura es

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muy similar a la membrana que rodea a las células, por lo que es fácil que el li-
posoma se fusione con la membrana y el gen entre en la célula diana. Además, pue-
den infectar cualquier tipo de célula y transportar moléculas grandes. Son más
eficaces de la transferencia de DNA desnudo pero se ha detectado en algunos casos
toxicidad tras su administración (13).

2.2.2 Vectores virales:

Para el tratamiento de muchas enfermedades es importante recurrir a vectores

con destinos específicos dentro del organismo lo cual permite la entrega celular se-
lectiva del gen en un determinado órgano o tejido, sin requerir para ello procedi-
mientos traumáticos o quirúrgicos.

Los vectores virales se han desarrollado modificando el genoma del virus sal-

vaje, eliminando para ello elementos virales necesarios para la replicación del
virus e introduciendo el sistema de expresión del gen terapéutico. En general los
vectores virales presentan una mayor eficiencia que los vectores no virales a la
hora de realizar el transporte de los genes a las células, y algunos de ellos son ca-
paces de expresar la proteína durante largos periodos de tiempo. A continuación
introduciremos brevemente algunos de los vectores virales mas utilizados en la te-
rapia génica de enfermedades metabólicas genéticas.

- Retrovirus

Los retrovirus son virus pertenecientes a la familia viral Retroviridae. Son virus
ARN de doble cadena que tienen capacidad para integrar genes terapéuticos rela-
tivamente grandes (un máximo de 8 Kb) (14). Se replican de manera inusual a
través de una forma intermedia de ADN bicatenario. Los virus inyectados en el
huésped integran su DNA en el genoma del huésped expresando así de forma per-
manente el gen que le hemos añadido. Como las proteínas del virus no son ex-
presadas por el huésped, no tenemos una respuesta inmunitaria. Tienen una alta
eficacia de transducción y también de expresión, siendo un sistema bien estudiado.
Sin embargo, únicamente sirven para infectar células del huésped que se encuen-
tran en división por lo que su eficacia de transducción en numerosos tejidos donde
las células no se dividen es muy baja. Además los títulos de virus obtenidos hasta
ahora son bajos y la integración en el genoma es al azar por lo que pueden afec-
tar a genes que conduzcan al desarrollo de células tumorogénicas (14). Existen
también vectores basados en el virus del SIDA (HIV), cuyo genoma es más com-
plejo pero con un funcionamiento similar al que hemos visto. Son los denomina-
dos lentivirus ( 15).

- Adenovirus

Son una familia de virus ADN que causan infecciones en el tracto respiratorio
humano. El serotipo mas utilizado en terapia génica es el serotipo 5, aunque exis-

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ten hasta 42 serotipos diferentes que infectan a humanos (16). Los adenovirus no
integran su DNA en el genoma de la célula e infectan tanto células quiescentes
como en división. Tras su administración sistèmica infectan el hígado con gran efi-
cacia. Los adenovirus de primera generación son deficientes en replicación ca-
rece del gen codificante de la proteína El necesaria para la replicación viral y
presentan una capacidad para material genético exógeno de alrededor de 5Kb. Las
ventajas de usar un adenovirus como vector son su facilidad para ser producidos
en altos títulos, la alta eficacia de transducción, pueden infectar tanto a células en
división como a las que no lo están Sin embargo presentan una limitación muy im-
portante y es que la expresión de trasgen es transitoria (pocas semanas). La ex-
presión transitoria derivada de este virus se debe a que su infección y expresión
de proteína virales induce respuestas inmunes tanto específicas como inespecífi-
cas que conducen a la eliminación de la célula infectada. Recientemente se han
desarrollo adenovirus de alta capacidad en los cuales se han eliminado todos los
genes del virus, manteniendo únicamente las secuencias necesarias para su em-
paquetamiento o formación. Estos virus mantienen las características de los virus
originales en cuanto a capacidad de infección pero carecen en gran medida de sus
propiedades inflamatorias y de inducir respuestas inmunes, por lo que permiten la
expresión del gen terapéutico durante largos periodos de tiempo. Los adenovirus
de alta capacidad o "gutless" permiten acomodar en su genoma gran cantidad de
material exógeno, su principal problema son problemas técnicos para su produc-
ción a gran escala (17).

- Virus adenoasociados (AAV)

Pertenecen a la familia de los parvovirus, son virus de muy pequeño tamaño
que contienen DNA de hebra sencilla como material genético. Los AAVs no pue-
den replicarse por sí mismos sino que requieren la coinfección por un virus "ayu-
dante" como adenovirus o herpesvirus (18,19). No existe ninguna patología
asociada a la infección por este virus, por lo tanto son naturalmente no replicati-
vos y no patogénicos. Entre las principales ventajas de estos virus encontramos
que la transducción (la cual es altamente eficaz) es estable en la célula diana, pue-
den infectar tanto a células en división como a las que no lo están (de gran im-
portancia para la terapia génica "in vivo"). La obtención de los virus
recombinantes AAV requiere la eliminación de los dos genes contenidos en el ge-
noma viral manteniendo únicamente las secuencias terminales necesarias para la
replicación y el empaquetamiento del virus. Por esta razón el riesgo de una res-
puesta inmune está minimizado ya que no producen proteínas vírales. Su princi-
pal inconveniente es que su capacidad de clonaje DNA exógeno es pequeña, sólo
de 5 Kb.

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Figura 3: Representación esquemática de la estructura genómica de un AAV re-
combinantes producido a partir de una genoma salvaje.

El tropismo, es decir el órgano u órganos a los que se dirige y preferencial-

mente infecta el virus tras su administración sistèmica, depende de las proteínas
que forman su cápside. El serotipo mas utilizado y mas estudiado es el serotipo 2.
Este serotipo ya ha sido utilizado en ensayos clínicos para el tratamiento de la he-
mofilia. En los últimos tiempos se han aislado un gran número de nuevos seroti-
pos de AAV de distinta procedencia, con tropismos muy diferentes y con una
mayor capacidad de infectar diferentes órganos. Por ejemplo el serotipo 8 se ha
comprobado que es capaz de transportar un gen terapéutico al 100% de los hepa-
tocitos de un ratón mientras el 2 solo conseguía llegar a un 2-5% (20,21). La uti-
lización de este serotipo ha permitido obtener excelentes resultados en la
corrección de enfermedades hereditarias de origen hepático como veremos mas
adelante.