Lékařská fakulta, Masarykova Univerzita

Mechanismus RNAi je relativně jednoduchý. Dlouhá dvouřetězcová RNA (dsRNA) (vznikající i spontánně při over-expresi genů) je v buňce přirozeně štěpena komplexem enzymů nazývaným DICER na krátké siRNA (short-interferring RNA) duplexy o délce 19-29 nukleotidů; alternativně mohou být siRNA duplexy dodány do buňky uměle – terapeuticky, často ve formě vektorů nesoucích odpovídající sekvence, které se v buňce přepisují do krátké vlásenkové RNA – short hairpin RNA (shRNA). siRNA duplexy jsou poté včleněny do multiproteinového komplexu RISC (RNA-induced silencing complex). Tento komplex obsahuje helikázu, která oddělí řetězce siRNA duplexu, a ribonukleázu, která po navázání sekvenčně specifické siRNA štěpí cílovou mRNA. Tím umlčuje expresi daného genu.

Použití siRNA pro terapeutické účely však vyžaduje postupné dodávání siRNA in vivo. Nedávno objevené malé molekuly, které zvyšují transdermální penetraci, by mohly být potenciálně použity pro systémové podání siRNA transdermální náplastí (Karande 2004). Alternativou jsou také například aerosolové metody podobné těm, které byly použity pro dodání genů do plic (Gautam 2000). Na nádorech v myších modelech a modelech tkáňových kultur již byla tato metoda relativně úspěšně použita (Damm-Welk 2003).

Velmi zajímavou a zdá se, že bifunkční skupinou jsou mikro-RNA (miRNA). Značné množství experimentů potvrzuje teorii, že se miRNA nějakým způsobem podílejí na vývoji řady malignit(Callin 2002) a mohly by představovat významné nádorové supresory (McManus 2003, Calin 2004) a to také u kolorektální neoplazie (Michael 2003) a plicních nádorů (Takamizawa 2004). U jiných typů nádorů je naopak exprese genů pro miRNA nepřiměřeně zvýšená a miRNA tak mohou získat funkci onkogenů. To je případ miR-155, vznikající z BIC RNA. Hladina této RNA je zvýšená u Hodgkinova lymfomu (Van den Berg 2003), u dětského Burkittova lymfomu (Metzler 2004) a u lymfomu vyvolaného ptačím virem (Tam 1997).

Vzhledem k nízké efektivitě genetické léčby a velice závažným nežádoucím účinkům vektorů bylo mnoho klinických studií genové terapie pozastaveno (Sadelain 2004, Marshall 2002).
Příloha V. Chemoterapie a Biologická léčba
Principy Známé mechanismy kancerogeneze a metastazování, případně řízení fyziologického procesu dělení buněk a reparace tkání s příslušnými mediátory dávají prostor pro „biologickou léčbu“ zasahující selektivně některý z kroků tumorigeneze (čili nejen onkogeneze – přeměně buňky, ale vzniku nádoru jako tkáně). Na mnoha se pracuje, nicméně prakticky použitelné jsou v dnešní době zatím jen níže uvedené prostředky. Bohužel je nepravděpodobné, že je nádor stimulován pouze jednou regulační cestou. Například aktivace pomocí transmembránového receptoru s aktivitou kinázy může být obejita over-expresí iontového kanálu a aktivace může proběhnout na základě Ca/kalmodulinového systému. Je proto vhodné kombinovat léčebné postupy, která ovlivňují více různých aktivačních cest – tzv. horizontální blokáda stimulace. Rezistence na určitou léčbu pak může znamenat funkčnost další, léčbou neovlivněné cesty stimulace buněčné proliferace. Dalším problémem může být to, že nevíme, na které úrovni aktivační kaskády jedné cesty je defektní přenos informace, vedoucí k maligní proliferaci. Léčba zasahující nad tímto místem pak může být neúčinná. Navíc může dojít při blokádě pouze jednoho stupně přenosu signálu k up-regulaci, která překoná blokádu. Je proto vhodné kombinovat také látky, které působí na několika úrovních jedné aktivační cesty – vertikální blokáda.

Vzhledem k rychlé proliferaci nádoru a tím i rychlé variaci v genetickém profilu nádorových buněk může docházet k rychlému rozvoji rezistence. Proto může být k blokádě růstu nádoru racionální zaměřit se na podpůrné tkáně, jako novětvořené cévy a vazivová matrix. Současně klinicky zkoušená, nebo i používaná léčba se zaměřuje na:

VEGF: Bevacizumab (Avastin) - chimérická monoklonální protilátka proti vaskulárnímu endoteliálnímu růstovému faktoru (VEGF-mAb) účinně blokuje jeden z promotorů nejen nádorové angiogeneze popsané výše.

Sunitinib, Sorafenib jsou malé blokátory tyrozinkinázového aktivního místa VEGFR.

EGFR: Cetuximab (Erbitux) - monoklonální protilátka proti ligandovému místu receptoru lidského epidermálního růstového faktoru (EGFR-mAb, nebo také HER-1-mAb). Brání růstovým faktorům ve stimulaci epiteliálních buněk, a tak účinně brzdí změny fází buněčného cyklu a dělení epiteliálních (nejen nádorových) buněk. Zajímavé je, že kuřáci a nekuřáci se často liší v genových polymorfismech genu pro EGFR, a tak nekuřáci mají daleko větší šanci onemocnět adenokarcinomem než kuřáci.

Pamitumamab (Vectabix) - plně humánní monoklonální protilátka blokující ligandové místo EGFR

Gefitinib, Erlotinib - oba brání reverzibilně vazbě ATP na podjednotku EGFR, tím brání spojení dvou podjednotek nutnou k další autoaktivaci EGFR jako tyrozinkinázy.

CD-117 – KIT: Imatinib-mesilát (Glivec) – KIT-specifický inhibitor tyrozinkinázy – transmembránového receptoru podobného IGF2-R. KIT (CD 117) je v nadbytku exprimován nádorovými buňkami GISTomu i zdravými Cajalovými buňkami střevní stěny. Gleevec blokuje aktivní místo receptoru pro růstový faktor a tím brání relativně velmi specificky (tímto receptorem se buňky GISTomu liší od všech ostatních buněk GITu) stimulaci buněk GIST k dělení.

Src cesta: Desatinib je specifický inhibitor produktu c-src genu. Gen kóduje intracelulární proteinkinázu tyrozinázového typu, která nemá membránový receptor. Může být aktivována mnoha stimuly a aktivovaná dokáže aktivovat zevnitř membránové receptory pro růstové faktory. Dále již běží aktivace ras cestou. Obchází tak transmembránovou aktivaci zevními stimuly. Je mimo jiné známo, že pokud v genetické sekvenci viru Rousova sarkomu gag-pol-env-src chybí právě src gen, není virus schopen nádorové transformace hostitelské buňky.

Proteazomy: Bortezomib (Velcade) –vlastně tripeptid Pyz-Phe-boroLeu (Pyz = kyselina pyrazinová) – je první proteazomový inhibotor. Proteazomy v normálních buňkách regulují expresi a funkci proteinů jejich degradací, očisťují buňky od abnormálních proteinů a proteinů s nevhodnou terciární strukturou. Zdá se , že blokáda proteazomů snižuje degradaci pro-apoptotických proteinů jak v myelomových buňkách tak v buňkách solidních nádorů (Bonvini 2007)(Voorhees 2003).

Vakcíny: TroVax- vakcína proti solidním nádorům nesoucím povrchový antigen 5T4 – 72 kDa antigen exprimovaný prakticky pouze fetálním trofoblastem a některými solidními nádory, včetně kolorektálního karcinomu. Tento antigen je prezentován imunitnímu systému pacienta díky spojení s pox virem – modifikovaným virem vakcinie Ankara (MVA).

Nová cytostatika zaveená v posledních 10 letech jako: Irinotecan – inhibitor topoizomerázy-I – je efektivní i bez kombinace s 5-FU, nicméně kombinace se zdá účinnější a snižuje se toxicita léčby.

Oxaliplatina – derivát cis-platiny. Je účinná pouze v kombinaci s 5-FU, vytváří můstky mezi DNA, její účinnost nezávisí na fázi buněčného cyklu.
Současný stav: Odhadované 5-leté přežití u pacientů ve stadiu IV kolorektálního karcinomu je asi 5%. Medián přežití se zavedením nových léčebných postupů včetně chemoterapie a biologické léčby zlepšil posledních 7 letech z 9-12 měsíců na dvojnásobek – 10-24 měsíců. K tomuto zlepšení docházelo v postupných krocích a lze očekávat další významné zlepšení po kompletním zavedení nových postupů do běžné léčby současně se změnou zatím zažitých schémat léčby, jako například nejprve operace, pak teprve chemoterapie. První zlepšení bylo dosaženo po průkazu vyšší účinnosti a nižší toxicity kontinuálního podávání 5-FU oproti bolusovému režimu (Meta-Analysis Group In Cancer 1998). Byla také prokázána výhoda modulace efektu 5-FU kyselinou folinovou (Leukovorinem) (Thirion 2004). S příchodem irinotekanu, inhibitoru topoizomerázy I bylo prokázáno, že ačkoliv je tato látka účinná i samostatně, její kombinace s infuzí 5-FU je účinnější s menšími nežádoucími efekty (převážně zvracením) (Douillard 2000). Po zavedení Oxaliplatiny do léčby pacientů se ukázal správný předpoklad o zvýšení odpovědi na léčbu v kombinaci s FUFA oproti samotné FUFA terapii, ačkoliv přežití není statisticky konzistentně signifikantní (Goldberg 2004). Porovnání oxaliplatiny vůči irinotekanu jako první linii je velice složité a všechny kontrolované studie ukazují stejné přežití. Znovu je zřejmé, že bolusové podávání 5-FU by nemělo být používáno a kombinace irinotekanu s oxaliplatinou nemá smysl, pokud není přidán ještě 5-FU (Tournigand 2004). Meta-analýzou 7 recentních studií se ukázalo, že pokud jsou pacienti během léčby léčeni všemi 3 léky, nehraje roli pořadí jednotlivých režimů (Grothey 2004) . Zatím nejsou jasná data ohledně efektivity orálního podávání oxaliplatiny a irinotekanu. Možným rozdílem může být jiná toxicita při perorálním podání (first-path effect jater) .

Prvním úspěšným biologickým lékem, který se dnes užívá v běžné klinické praxi je léčba imatinibem u pacientů trpících GIST. Indikace k jeho podání jsou již dány standardy nccn a esmo (http://www.nccn.org, http://www.esmo.org, http://www.snfge.org ). Jen pro ilustraci, u resekovatelných je doporučena primární resekce GISTomu s lemem 2cm, bez nutnosti vyšetření regionálních uzlin pro staging nebo zvýšení radikality. Následuje adjuvantní léčba Imatinibem 400-800mg/den pouze v rámci klinických studií u R0 resekcí. U primárně neresekovatelného GISTomu nebo po R1,2 resekcích je indikován jako neoadjuvantní léčba 400-800mg/den, resekce je načasována v době maximální odpovědi za 4-12 měsíců. Tato léčba pak pokračuje celoživotně bez ohledu na výsledek následné resekce. Léčba Glivecem se ukončuje jen při progresi onemocnění i přes léčbu, pokud je lék odmítnut pacientem, vznikne intolerance léku.

Bortezomib byl zatím úspěšně zkoušen pouze u myelomu a lymfomu z plášťových buněk. V těchto případech lze očekávat kompletní odpověď na léčbu až u 15% pacientů. (Adams 2004)

U kolorektálního karcinomu je biologická léčba volitelně součástí až posledních doporučení a je stále především předmětem klinických studií. Ukazuje se, že by mohla mít význam kontrola neoangiogeneze ( Jain 2005). Bevacizumab jako protilátka proti růstovému faktoru endotelií prokazuje v kombinaci s další chemoterapií významnou aktivitu při podání jak v první, tak i ve druhé linii (Hurwitz 2004). Slibnou se zde zdá také kombinace Bevacizumabu s FUFA u pacientů netolerujících irinotekan a oxaliplatinu.

Při klinických studiích s protilátkou proti EGFR/HER-1 – Cetuximabem bohužel zatím nebyl splněn předpoklad korelace s mírou exprese EGFR/HER-1, přestože kombinace Cetuximabu s irinotekanem u pacientů s irinotekan refrakterním metastatickým kolorektálním karcinomem prokázala dvojnásobný počet opovědí na léčbu, než irinotekan samotný (23% vs. 11%). I tak Cetuximab v první linii podle předběžných výsledků studií dokončených v roce 2007 prokazuje vysokou míru odpovědi na léčbu s downstagingem jaterních metastáz a signifikantně větším množstvím jaterních R0 resekcí.

Význam koncepce horizontální blokády (viz principy výše) je prokazován v klinické studii BOND II, která zkoumá efekt kombinace anti-EGFR Ab s anti-VEGF Ab (Bevacizumab + Cetuximab) (Saltz 2005) a ve studii PACCE (PACCE), kde je prokazována významná synergie. Význam vertikální blokády je pak zkoumán studiemi, zkoumajícími efekt sunitinibu nebo sorafenibu blokujícími přímo tyrozinkinázovou doménu VEGFR spolu s Bevacizumabem, který blokuje vazbu ligandu – růstového faktoru - VEGF). Je totiž již prokázáno, že při blokádě aktivního místa VEGFR Sunitinibem dochází k up-regulaci zvýšenou expresí VEGF. Kombinace s Bevacizumabem, který blokuje přímo působení VEGF na VEGFR je schopna tuto up-regulaci obejít (Azad 2006).

Velmi zajímavé je pozorování prezentované na sympóziu Gastrointestinal Cancer v lednu 2008. Byly publikovány výsledky III fáze klinické studie srovnávající účinek Pamitumamabu s nejlepší podpůrnou péčí u pacientů refrakterních na jakoukoliv jinou léčbu. Pacienti s mutací k-ras (20-50% pacientů s kolorektálním karcinomem) byli k léčbě Pamitumamabem rezistentní (léčebná odpověď 0%, stabilizace choroby ve 12%) oproti pacientům s wild-typem k-ras (léčebná odpověď 17% a stabilizace choroby v 34%). Pamitumamab je tak schválen k léčbě pacientů rezistentních na jinou léčbu pouze v případě přítomnosti nemutovaného – wild-type k-ras genu.

Imunomodulační léčba prokázala v některých studiích určitý efekt, nicméně standardní léčba GM-CSF + IL2 jako přídavek k některému ze standardních režimů chemoterapie (např. FOLFOX-4) je zatížena v účinném dávkování významnými nežádoucími efekty (Correale 2005).

Vakcína Trovax byla u kolorektálního karcinomu použita ve fázi II klinické studie (Oxford Biomedica 2005). Význam pro celkové přežití pacientů opět není znám. Použití vakcíny je limitováno na sekretory CEA. V současné době jsou již uzavřeny další 2 klinické studie u metastazujícího kolorektálního karcinomu prokazující protinádorovou imunitní odpověď u všech pacientů se známkami alespoň stabilizace choroby až u 95% pacientů a s kompletní remisí u 17% pacientů. Před uzavřením je také studie aplikace TroVax u pacientů s resekabilními jaterními metastázami. Protinádorový efekt zde byl prokázán u 95% pacientů a disease free interval 9 měsíců dosáhlo 56% pacientů. Je plánována fáze III klinické studie QUASAR využití TroVax u pacientů s CRC stádia II a III.
Diskuse: Přestože první výsledky jsou velice slibné a toxicita nových biologických léků je velmi nízká, přesto blokování i zdravých epiteliálních buněk v jejich dělení a fyziologické angiogeneze může vézt ke vzniku závažných vředů. Je také pozorován zvýšený počet chirurgických i kardiologických komplikací, pokud se operuje časně v návaznosti na tuto léčbu jako neoadjuvantní (a to přitom účinnější dnes nemáme) (D’Angelica 2007). Pokud se chce chirurg při resekci vyhnout závažným peroperačním krvácením daných vaskulární insuficiencí způsobenou Avastinem a následnými poruchami hojení rány, musí počkat do odeznění účinku. Obvykle se doporučuje 6-8 týdnů (Ellis 2005). Tím, že se jedná o blokádu i fyziologických procesů, dochází zpětnou vazbou k zesílení stimulačních faktorů, které mohou vést k postupné nutnosti navýšení dávek léku. Velmi silný rebound fenomén však nezřídka v tomto terapeutickém oknu vede k velmi rychlé progresi onemocnění. Pauza tak musí být co nejkratší a vždy pokud možno překryta další účinnou protinádorovou kombinací léčiv. I když zřídka, bylo popsáno do 2% GIT komplikací končících až perforací trávicího traktu při léčbě Bevacizumabem. U léčby Cetuximabem je velmi častý a nepříjemný exantém charakteru akné jako přímý důsledek blokády HER-1/EGFR epiteliálních buněk. Nicméně tíže tohoto projevu koreluje velmi dobře s úspěchem léčby.

Obecně je po chemoterapii nutno očekávat změny na jaterním parenchymu a funkcích, které mohou, ale nemusí být zobrazitelné předoperačně. Patří sem také steatóza, či fibróza typicky iniciovaná oxaliplatinou. To může ovlivnit rozsah případné jaterní resekce.

Stále není jasně zodpovězená otázka, zda provádět neo-adjuvantní chemoterapii i u primárně resekabilních jaterních metastáz. Následující tabulka (tabulka PV-1) shrnuje možná pro a proti neoadjuvantní chemoterapie u pacientů s primárně resekabilními metastázami jater.
Tabulka PV-1: pozitivní a negativní efekty neoadjuvantní chemoterapie u pacientů s primárně resekabilní metastázou CRC

Proč neoadjuvanci ANO	Proč neoadjuvanci NE
Zmenšení velikosti metastáz	Toxicita : steatóza, steatohepatitida, sinusoidální dilatace
Efekt na mikrometastatické postižení	Riziko progrese nebo vzniku nových metastáz
Zhodnocení efektivity chemoterapie	„Kompletní“ odpověď ztěžuje cílení resekce
lepší tolerance chemoterapie než po resekci	Sekundární splenomegalie při indukované portální hypertenzi
Predikce výsledku resekce.	Selekce rezistentních klonů buněk.

Důvody proč předřadit chemoterapii jaterní resekci jsou minimálně tyto: Velikost metastázy nad 5cm je nezávislým prognostickým faktorem horšího průběhu po resekci. Nicméně zmenšení velikosti chemoterapií zatím nebylo prokazatelně spojeno se skutečně delším přežitím. Efekt na mikrometastatické postižení především v lokoregionální modifikaci lze nepřímo předpokládat na základě výsledků z livermetsurvey (www.livermetsurvey.com) u pacientů s metastázou větší než 5cm a u pacientů s více než 2 rizikovými faktory podle tabulek v Dodatku 5 (Huitzil-Melendez 2007). Tyto bipolární výsledky znamenají, že existuje skupina pacientů, která by mohla profitovat z neoadjuvantní chemoterapie i v případě primárně resekabilních metastáz.

Bylo také skutečně prokázáno, že tolerance k předoperačně podané chemoterapii je lepší a tak pooperačně podaná adjuvantní terapie nemusí dosahovat dostatečných hladin a tak i účinnosti (Kemeny 2003, Kemeny 2005, Sauer 2004). Některé práce pak prokazují úspěšnost předoperační chemoterapie jako nezávislý prediktor dlouhodobého výsledku chirurgické resekce (Adam 2004).

Ovšem i na straně odpůrců předoperační chemoterapie jsou prokazatelné argumenty. Bylo popsáno skutečně významné toxické postižení jater po chemoterapii, které znemožnilo následující chirurgickou resekci (Belghiti 2000, Behrns 1998, Kooby 2003). Toxické postižení závisí na délce podávání, typu cytostatika a způsobu podání (chronomodulace, bolusové podání, lokoregionální vs systémové podání) (Karoui 2006). Velmi zajímavou výměnu názorů na toto téma lze nalézt mezi Garufim a Bilchikem (Garufi 2004, Bilchik 2004).

Efekt toxicity způsobující obstrukci sinusoid a portální hypertenzi se splenomegalií může být také významným faktorem znemožňujícím chirurgickou resekci jaterní metastázy po neoadjuvantní chemoterapii (Tisman 2004).

Nezanedbatelným rizikem může být také progrese onemocnění do neresekabilního stádia během neoadjuvantní terapie, jak vyplývá také z prvních výsledků EORTC 40983 studie (Gruenberger 2006).

A konečně bylo také prokázáno, že recidivy po resekcích naslepo u pacientů s úplnou regresí metastáz po neoadjuvantní chemoterapii byly vyšší (Benoist 2006, Elias 2004, Adam-Delvart 2004). Proto také někteří autoři doporučují odeslat onkologického pacienta k případně resekci ještě dříve, než dojde k úplné regresi ložisek. V každém případě by měl rozsah resekce po neoadjuvantní chemoterapii být co nejbližší původně plánovanému rozsahu.

Lze očekávat, že jestliže zvýšila samotná chemoterapie medián přežití z 10 měsíců na 24 (viz výše v úvodu), dojde i ke zvýšení efektu předoperační chemoterapie u pacientů s primárně resekabilními metastázami. Zvláště u těch s hraničním nálezem – metastáza i jen jedna větší než 5cm, nebo metastázy i malé do 3cm, ale v počtu větším než 3, případně u bilobárního postižení.

Je jasné, že vakcíny mohou být úspěšné pouze u nádorů exprimující použitý antigen. Problémem může být opět heterogenita nádoru. Ne všechny buňky mohou daný povrchový antigen exprimovat, nebo jej vystavovat na odiv imunitnímu systému. Je známo, že nádorové buňky dokáží relativně účinně „překrývat“ některé své povrchové antigeny a že efekt antigenu na stimulaci nebo naopak utlumení imunitní odpovědi záleží na interakcích mezi několika povrchovými molekulami jak antigen prezentující buňky, tak buňky výkonné. Efektivita vakcín může být zvýšena imunomodulací např. IL-2 a G-CSF, které jsou již dnes součástí některých režimů chemoterapie. Určitým vylepšením standardní vakcinace můžou být tzv. DNA vakcíny – viz kapitola imunologie nádorů výše, které lze použít jako vakcínu „vše v jednom“ tedy antigen i imunomodulační cytokiny a chemokiny v jednom. Zatím však u těchto vakcín není aktivita vyšší než u standardních kombinací a jsou přítomny všechny nežádoucí účinky a potencionální rizika genové terapie. Na zhodnocení skutečného přínosu vakcín a to v jakém stadiu choroby je použít si budeme muset ještě chvíli počkat, až budou dokončeny alespoň první klinické studie fáze III.

Příloha VI. Nanotechnologie

Nanotechnologie je hraniční obor na pomezí fyziky pevných látek, organické chemie, biochemie i anorganické chemie nahlížený z mechanistického pohledu a zabývající se konstrukcí (slovo syntéza lze příliš nevystihuje situaci) komplexních molekul daných fyzikálních vlastností. V dnešní době je potenciál nanočástic v medicíně v principu dvojí. V prvním případě dokáží nanočástice daných vlastností vytvářet samoorganizací in vivo 3D struktury v poškozené tkáni (Smith 2005, Smith 2007). Povrch těchto nanočástic může být upraven tak, aby po něm migrovaly specifické buňky – fibroblasty, buňky glie, mohou stimulovat růst neuronů atd. Druhou oblastí je cílená dodávky léčiv a využití biologických vlastností nanočástic (například indukce komplementové odpovědi). V této oblasti jde v principu o konstrukci micel, tzv. polyplexů, z polymerů přírodních (poly-L-lyzin - PLL, chitosan) nebo artificiálních (uhlíkové fullereny, poly-dietyl-Emino-etyl metakrylát - pDEAEMA, poly-etylen-imin – PEI, nebo poly-etylenglykol PEG). Ty nesou uvnitř navázánu pomocí van der Waalsových sil, příp. koordinačně kovalentní vazbou v případě kovů, klíčovou molekulu (léčivo, DNA, siRNA/RNAi, miRNA, antisense molekuly nukleových kyselin, marker, atd.). Na svém vnějším povrchu pak mají navázánu „adresu“ – molekulu, která zaručí cílené doručení obsahu, případně zaručí správnou interakci s recipientní buňkou tak, aby nedošlo k endogenní lyzozomální destrukci obsahu, ale k jeho uvolnění do cytoplasmy, anebo ještě dále k cílenému dopravení až do jádra buňky. Touto adresní molekulou může být protilátka, ale také specifický ligand určitého receptoru. Vzhledem k relativně negativnému náboji vnějšku buněčné membrány může pozitivní náboj polyplexů usnadňovat adhezi.

Mechanismů, které uvolní správně lék do cytoplasmy je několik. Nejčastěji popisovaným způsobem je endocytóza, která ale musí obejit lyzozomální cestu (Kam 2006). Dalším mechanismem může být postupná degradace obalu nanočástice s tvorbou komplexů s dodávaným léčivem a procházení těchto malých nenabitých komplexů buněčnou membránou na principu difuze – jako například u poly-alkyl-kyanoakrylátu (de Verdière 1997). A konečně mohou vytvořit nanočástice jakýsi kanál v membráně, kterým se přepravovaná látka dostane do buňky. Tento mechanismus se předpokládá u fullerenů (Pantarotto 2004).

Přes všechny klady není použití nanočástic bez rizik. Je známá toxicita lipozomálních nanočástic. Ionické lipozomy jsou potentním aktivátorem komplementu. Také holé fullereny jsou ve vodě nerozpustné a vysoce toxické. Modifikací povrchu fullerenů navázáním různých ligandů lze dosáhnout nanočástic bez akutních toxických účinků v laboratorních podmínkách na lymfocytech nebo na zvířecím modelu. Nebyly však provedeny dosud žádné dlouhodobější toxikologické studie, které by posuzovaly možný efekt při léčebném použití fullerenů u lidí. Jejich endotracheální aplikace může způsobit tvorbu plicních granulomů. Intravaskulární výskyt fullerenů může vézt k intravaskulární agregaci destiček a vzniku trombů, jak bylo ukázáno na laboratorních zvířatech. Dnes nejčastějším způsobem, jak zvýšit biokompatibilitu a snížit toxicitu nanočástic je jejich PEGylace – tedy potažení polyetylenglykolem.

Oblasti využití NT v medicíně:

1. 
   Genová terapie, cílené směřování léků - výroba bezpečných vektorů zajišťující selektivní dodávky léčiv včetně genoterapie nabo RNAi do nádorových buněk. Lze je také použít k selektivní fyzikální terapii v kombinaci s magnetitem (Fe3O4) a MRI.
   
2. 
   Diagnostika - výroba makromolekul definovaných vlastností se selektivním vychytáváním v nádoru nesoucí kontrastní agens
   
3. 
   Specifické vlastnosti – jako například imunomodulace.
   
4. 
   Tvorba autoagregátů 3D struktur („lešení“) pro tkáňovou regeneraci po poraněních.
   

Cílená dodávka léčiva, diagnostika: Lze tak využít doručení kontrastních látek pro MRI (Sitharaman 2005), nebo fluorescenci (Bottini 2006). Případně pro scintigrafii v kombinaci s ¹¹¹In. Zobrazená tkáň závisí na druhu zvoleného ligandu nebo protilátky. V případě kolorektálního karcinomu lze použít obvykle CEA nebo 5T4 antigen. Podle dávky ¹¹¹In lze využít nanočástici nejen k diagnostice, ale i k selektivní radioterapii (Reilly 2007). Vzhledem k tomu, že karbonové nano-trubice mají tendenci pronikat do buňky a shromažďovat se kolem jaderné membrány, je efekt radioterapie cílené pomocí těchto nanočástic na DNA maximalizován (Pastorin 2006). Efekt tohoto přístupu byl prokázán laboratorně u akutní myeloidní leukémie (¹¹¹In -nanočástice s anti-CD34 protilátkou rituximabem)( Chen 2006), a také u EGFR+ mammárního karcinomu (¹¹¹In -nanočástice s EGF)( Reilly 2000). Bylo také prokázáno, že nanočástice na bázi PACA se přednostně vychytávají v retikulo-endotelovém systému a lze tak tuto léčbu mířit cíleně na jaterní metastázy, kde jsou tyto částice vychytávány Kuppferovými buňkami (Chiannilkulchai 1990).

Obejití rezistence na cytostatika : multidrug rezistence (MDR) mediovaná transmembránovou pumpou P-gp, která aktivně odčerpává cytostatika ven z buněk lze překonat několika způsoby. 1.) Na buněčné úrovni lze tento efekt překonat kompetitivními inhibitory jako je například verapamil. Nicméně v dávkách nutných pro potlačení MDR je jeho podání zatíženo řadou nežádoucích účinků. 2.) Přesycení systému P-gp nanočásticemi na bázi poly-alkyl-kyanoakrylátu (PACA) (Treupel 1991, Cuvier 1992, Nemati 1996, de Verdière 1997) významně zvyšuje intracelulární koncentraci cytostatik díky endocytóze. Alkyl-kyanoakrylát s doxorubicinem vytváří iontové komplexy, které pak procházejí membránou bez toho, aby byly zachyceny P-gp proteinem. 3.) Blokádou P-gp přidaným cyklosporinem-A do nanočástice.

Dalším mechanismem, kterým nanočástice pomáhají zvýšit efektivitu chemoterapie je ochrana protinádorových léků před rychlou biotransformací a zpomalení jejich clearance z těla (Couvreur 1980, Verdun 1990).

Dalším možným polem působnosti v léčbě nemocí je jejich role jako vektorů genové terapie. Přestože bylo do roku 2005 provedeno minimálně 1000 klinických studií využívající virové vektory ke genové terapii (www.wiley.co.uk/genmed/clinical/ ) regulační autority zpomalily rozvoj dalších studií vzhledem k prokázanému onkogennímu potenciálu virových vektorů a vysoké imunogenicitě (Sadelain 2004, Marshall 2002). Specificita takto podávané léčby také není nijak vysoká. Proto byly zkoušeny jiné metody cílené inkorporace DNA do buněk jako gene guns, elektroporace, sonoporace, nebo ozáření laserem. Klinické využití vyžadovalo u solidních nádorů nutnost chirurgické expozice tkáně a i tak nebyly tyto metody příliš efektivní, ani specifické. Micely tvořené kationickými lipidy také nevykazovaly vysokou efektivitu a navíc přinášely kumulativní významnou toxicitu a stimulaci zánětlivé odpovědi organismu (Hirko 2003, Zhang 2005). Lze očekávat, že komplexní micely – polyplexy poskytnuté nanotechnologiemi mohou výrazně zvýšit efektivitu a především specificitu transfekce buněk bez nežádoucí systémové zánětlivé reakce organismu, přestože interakce polyplexů s imunitním systémem nejsou triviální. V pasivní neadresné adhezi polyplexů na buněčné membrány hraje významnou roli heparansulfát. Pro zvýšení selektivity pro určité tkáně nebo buňky bylo využito několika strategií. Receptorem mediovaná internalizace polyplexů byla využita při dodávce nukleových kyselin do hepatocytů (Kunath 2003), tracheálních epitelií (Grosse 2004) a dendritických buněk (Diebold 1999) pomocí sacharidů. Nádorové tkáně pak byly cíleně vyhledávány pomocí receptorů pro folát (Gottschalk 2001, van Steenis 2003), integriny (Kunath-Merdan 2003) nebo transferin (Kircheis 2001). Bylo také dosaženo cílené dodávky nanočástic pomocí navázaných protilátek nebo jejich fragmentů (Merdan 2003). V současnosti je velmi slibná internalizace polyplexů, která se vyhýbá endolyzozomální degradaci, pomocí tzv. protein transduction domains (PTDs) (Zorko 2005), neboli specifických proteinových přenašečů na membránách.

Velmi zajímavou aplikací nanočástic je léčba založená na paramagnetických vlastnostech magnetitu – tedy oxidu železito-železnatého Fe₃O₄. Při konstrukci micely tak, že obsahuje adresu – v tomto případě protilátku proti CEA nebo jinému tumorspecifickému antigenu a uvnitř dostatečné množství magnetitu, lze následně po aplikaci detekovat tyto částice v těle pacienta. V případě, že se nacházejí v místě, kde je cílová tkáň, může déledobější aplikace proměnlivého magnetického pole (AMF) způsobovat tak významné tepelné ztráty v magnetitu, že dojde lokálně k prohřátí tkáně na teplotu kolen 45 st. C. Při této teplotě nedochází většinou k přímému poškození buněk. Nicméně dochází k indukci tzv. heat shock proteinů, které často vedou k apoptóze i u nádorových buněk a tím k významné redukci nádorové tkáně (Dobson 2007). Takto vytvořené nanočástice – tzv. SPION jsou již používány k MRI diagnostice. Klinická aplikace AMF indukované hypertermie pomocí SPION nebyla zatím provedena. Výsledky na zvířecím modelu jsou slibné, nicméně do kliniky zatím nepřenositelné.

Reakce organismu na nanočástice, Imunomodulace: Bohužel působení degradačních produktů kostry nanočástic není mimo fullerenů nezanedbatelné. Zdá se, že účinnost dodávky cytostatika do buněk je úměrná toxicitě samotného pláště. Překlenutí všech potíží, které jsou spojené s doručením klíčové molekuly přesně na místo určení bez vedlejších efektů je stále velmi složitá a intenzivně studovaná oblast jen s dílčími výsledky. Například pokud se překryje PACA ještě PEG, dojde ke snížení aktivace komplementového systému, snížení vychytávání játry a delšímu poločasu v plasmě. V tomto případě pak je největší koncentrace v CNS, přednostně v ependymálních buňkách chorioidálních plexů a specificky v gliomech (Calvo 2001, Brigger 2002) beze změny permeability hematoencefalické bariéry.

Nanočástice jako agregát různých makromolekulárních látek i menších ligandů jsou potenciálním cílem imunitní odpovědi organismu. Samostatně nejméně imunogenní je PEG. Nicméně tyto nanočástice jsou schopny vyvolat imunitní reakci proti ligandům navázaným na jejich povrchu, ke kterým by jinak imunitní reakce nevznikla (Pantarotto 2003). Může tedy docházet k blokování účinku například adresných protilátek navázaných na nanočástici nově v organismu tvořenými protilátkami proti těmto epitopům zvláště při opakovaném podání a zvláště, pokud ligandy navázané na nanočástici nejsou humánního původu.

Po intravenózní aplikací léků a diagnostických látek o velikosti nanočástic byly v relativně velkém počtu popsány reakce časné přecitlivělosti s projevy dechové tísně, tachykardie, popřípadě pouze s výsevem exantému. Bylo prokázáno, že většinou nesouvisí s přecitlivělostí prvního typu, tedy IgE mediovanou, ale souvisí s aktivací komplementového systému. Tato pseudoalergická reakce s někdy nazývá C-aktivation related pseudoalergy (CARPA) vytvořila novou podskupinu přecitlivělostí prvního typu. Ne všechny nanočástice ale způsobují CARPA pouze aktivací komplementu (lipozomální a micelární léčiva jako Doxil, Taxol, Ambisome, poloxamer 188 a 407). Spolupodíl IgE mediované reakce vykazuje působení například i.v. protaminu (Szebeni 2007).

Fullereny aktivují komplement klasickou cestou interakcí s C1q. Tato vazba je dána samotným fullerenem a ne jeho konstrukcí nebo nečistotami a oxidačními produkty vzniklými při výrobě. Naopak vazba fullerenů na plicní proteiny surfaktantu SP-A a SP-D je Ca2+ dependentní a závisí na množství příměsí a oxidačních produktů ve fullerenech (Salvador-Morales 2007). Chemickou modifikací fullerenů lze dosáhnout různého stupně aktivace komplementu klasickou cestou a tak připravit fulleren požadovaných biologických vlastností (může být žádoucí aktivovat komplement fullerenem navázaným na povrchu nádorové buňky)(Salvador-Morales 200). Ostatní nanočástice mohou aktivovat komplement jak klasickou cestou (lipozomální nanočástice) tak alternativní cestou (micely). Přestože je Doxil (Caelyx) PEG-ylovaný lipozomální Doxorubicin používán po řadu let se zvýšeným léčebným efektem u mnoha nádorů (Gabizon 2001), je zatížen až v ¼ případů časnou alergickou reakcí (Uziely 1995), která není IgE mediovaná, nesouvisí s předchozím podáním léku, a po odeznění akutní reakce je obvykle možno infuzi léku pomalejší rychlostí bezpečně dokončit. Navíc byla přerušena studie posuzující bezpečnost a efektivitu ^99mTc-HYNIC PEG lipozomů v diagnostice Crohnovy choroby právě pro vysoký výskyt této přecitlivělosti. Jako součást nanočástic odpovědná za tuto reakci byl identifikován samotný lipozom (ALZA 2000). Stimulace nespecifické imunitní odpovědi samotnou kostrou nanočástice by se mohlo ukázat jako výhodné při přípravě protinádorových vakcín. Je možné připravit pomocí nanočástic jednak DNA vakcíny, kde mohou nahradit méně účinný a specifický plazmidový vektor. Nanočástice mohou sloužit při konstrukci konvenčních protinádorových vakcín s navázaným silným stimulátorem nespecifické imunity a tumor-specifickým antigenem. Kromě toho mohou nanočástice interagovat s celou řadou dalších proteinů plasmy. Byla prokázána vazba karbonových nanočástic na HDL a fibrinogen, nicméně klinický dopad zatím není jasný. Působení nanočástic v organismu je zřejmě velmi komplexní, od interakce s imunitním systémem, přes interakci s cílovou buňkou až po toxicitu vlastního nosiče. I přes tyto dílčí problémy se však potenciální využití nanočástic v medicíně zdá velmi slibné. Umožňuje relativně jednoduchou syntézu nanočástic „na míru“ pacienta a choroby.
Dopad pro klinickou praxi: Je potřeba opatrnosti před aplikací nanočástic. Část přecitlivělostí lze odhalit standardními kožními testy u pacientů s rizikem IgE mediované přecitlivělosti. Ostatní testy zatím nejsou v klinice používány, nicméně jsou vyvinuty ELISA metody, které umožňují vytipovat pacienty s vysokým rizikem pseudoalergické reakce. Nejefektivnější screening je dán sledováním konečného komplexu komplementu (SC5b-9) (Szebeni 2002). Především u pacientů s IgE mediovanou odpovědí lze využít desenzibilizační léčby. Imunosuprese nebo farmakologická inhibice komplementu se neukázala příliš efektivní. Inhibice účinku sekundárních mediátorů zánětu indometacinem, nebo blokátory adenozinového receptoru se ukázala jako účinná na prasečím modelu CARPA.

V cytotoxické léčby cílené protilátkami nebo jinými tumor specifickými ligandy je určitá aktivace komplementu výhodná, o čemž svědčí i některé klinické studie prokazující vyšší účinnost nanomolekulárních léčiv tam, kde byla vyšší toxicita samotné kostry nanočástice.

Příloha VII. Lokoregionální Radioterapie (⁹⁰Y, ¹³¹I, ¹¹¹In)

Princip: Podmínkou je možnost selektivně doručit  nebo lépe  zářič do nádorové tkáně. Částice  i  mají jen velmi krátkou střední volnou dráhu ve tkáni a tak působí jen na nejbližší buněčné okolí zářiče. Výhodnější může být  zářič, který ošetří o něco širší okolí.

1. Endovaskulárně cílená léčba : Selective Internal Radiation Therapy (SIRT). U dobře vaskularizovaných nádorů se mikrosféry – prefabrikované částice určitých rozměrů relativně selektivně vychytávají v cévách nádoru. Působí jejich trombózu a tím ischemizaci nádoru. Na ně lze navázat zářič, který pak bude působit lokálně v oblasti nádoru. V současnosti se již klinicky v rámci studií využívají mikrosféry s navázaným ⁹⁰Y. Yttrium ⁹⁰Y je čistý  zářič. Rozpadá se na stabilní Zirkon ⁹⁰Zr -rozpadem s poločasem 64,3 hodiny a maximální energií -částice 2,28 MeV

⁹⁰Y  ⁹⁰Zr + e^- (2,28 MeV)

2. Protilátkami cílená léčba:

⁹⁰Y- ibritumomab – Zevalin – dnes používaný v léčbě non-Hodgkinského B lymfomu. Jde o IgG1 monoklonální protilátku proti CD 20 antigenu B lymfocytů v chalátu s tiuxetanem, na který je navázáno yttrium.

¹³¹I-lebtozumab - CEA je jak bylo zmíněno výše povrchový antigen plodu, který se v dospělosti vyskytuje prakticky pouze u nádorů. Lebtozumab je monoklonální protilátka proti CEA. S navázaným ¹³¹I se cíleně vychytává na povrchu nádorových buněk exprimujících CEA. Radioaktivita jodu je tak namířena selektivně proti nádorovým buňkám.

¹³¹I- tositumomab- léčba non-Hodgkinského folikulárního B-lymfomu – Jde o IgG2a monoklonální protilátku proti CD 20 antigenu s kovalentně navázaným ¹³¹I.

¹³¹I je čistý  zářič. Rozpadá se na ¹³¹Xe s poločasem 8 dní a energií -částice 0,971 MeV

¹³¹I  ¹³¹Xe + e^- (0,971 MeV)

¹¹¹In + rituximab – Rituxan. – anti-CD34 protilátka využívaná v terapii myeloidní leukémie

¹¹¹In se rozpadá pomocí záchytu elektronu na kadmium ¹¹¹Cd za vyzáření neutrina a gama záření:

¹¹¹In + e^-  ¹¹¹Cd + _e + 

Současný stav:

V České Republice vyrábí trichlorid ytria ⁹⁰YCl₃ v Ústavu Jaderné Fyziky v Řeži u Prahy. V současné době jsou pro klinické zkoušení v Evropě schváleny dva druhy mikrosfér s navázaným ⁹⁰Y – Therasphere o průměru mikrosfér 35m kde je materiálem sklo a SIR-sphere o průměru 25m, kde je základním materiálem pryskyřice. V případě jaterních lézí se pohybuje celková aktivita podaného radionuklidu podle velikosti ložisek od 1,0 do 3,0 GBq.

Před lokální aplikací radiofarmaka do jater je potřeba zhodnotit: 1). cílový objem jaterní tkáně a množství nádoru v ní. 2). angiografii a embolizaci kolaterál 3). zkraty do plicního řečiště scintigrafií ^99mTc značeným albuminem po podání do jaterní tepny 4). Určit ideální léčebnou dávku 5). reziduální aktivitu radionuklidu a efektivitu doručená farmaka na místo. Pacienti musejí mít určitou rezervu jaterních funkcí. Během léčby dojde k radiačnímu poškození jater a fibróze až portální hypertenzi s různou klinickou významností (Ayav 2005). Není proto doporučeno používat léčbu u pacientů s jaterní cirrhózou (SIRTEX-Medical). Je doporučována následující profylaxe radiační hepatitidy a rizika vzniku vředu z iradiace GIT- léčba kortikoidy 1 týden a antiulcerózní terapie po 2 týdny (Miller 2007, Salem 2005). Problémem je také hodnocení reakce na léčbu, jak WHO tak RECIST kritéria se zdají nedostatečná. Z běžně dostupných metod se jeví jako nejcitlivější kombinace PET a CT (Miller 2007). Přestože Terraspheres mají oproti Sirspheres větší hustotu a nižší embolizující efekt (Sato 2006), klinicky nebyl mezi použitím obou shledán žádný rozdíl (Wong 2006).

Úspěšná aplikace této metody u solidních nádorů jater spadá do počátku 90. let (Andrews 1994, Gray 1992). U pacientů, kteří byli léčení SIRT byla délka přežití vždy omezena progresí extrahepatálního postižení (Stubbs 2001). Od léčby lze očekávat primární odpověď na léčbu až 50% a dalších 50% se stabilizací choroby (Miller 2007), případně snížení PET aktivity ložisek u 76% - 86% pacientů (Jiao 2006). Roční přežití u pacientů s jaterní metastázou CRC léčených SIRT se pohybuje kolem 67% s mediánem přežití kolem 17,5 měsíců (Stubbs 2001). Bylo dosaženo významného zlepšení doby do progrese onemocnění z 3,6 na 18,6 měsíců a středního přežití z 12,8 na 29,4 měsíců (Gray 2001, Van Hazel 2004). Tato léčba je podávána jako poslední možnost u pacientů, kteří by mohli profitovat z regrese jaterních ložisek a mající často i extrahepatální postižení, nejčastěji plíce. Mezi komplikace patří až ve 23% iradiační cholecystitida, případně edém jater s bolestí u 42% pacientů (Miller 2007). Možná je fatální hepatitida, ulcerace GIT, krvácení do GIT, a radiační pneumonitida (Andrews 1994, Stubbs 2001, Herba 2002, Gray 2001). Toxicita léčby narůstá s podanou aktivitou (nad 150 Gy v jedné dávce) (Goin 2005) a snižuje se s pečlivou selektivní aplikací (Lewandowski 2005).

S ¹³¹I-labetuzumabem byly již také provedeny klinické studie u pacientů s kolorektálním karcinomem metastazujícím do jater (Liersch 2005). V této studii byl podán preparát u 23 pacientů po kompletní resekci jaterních metastáz v jediné dávce. Průměrné přežití (ne medián) bylo 68 měsíců ( více než 5 a ½ roku). Medián přežití byl 5 let.

¹¹¹In bylo využito laboratorně u léčby akutní myeloidní leukémie (¹¹¹In -nanočástice s anti-CD34 protilátkou rituximabem)( Chen 2006), a také u EGFR+ mammárního karcinomu (¹¹¹In -nanočástice s EGF)( Reilly 2000).