Sayın Meslektaşlarım
Yüklə 2,98 Mb.
|
Kaynaklar
OKÜLER ENFEKSİYONLARDA KÜLTÜR Dr. Ali Bülent ÇANKAYA S.B. Ulucanlar Göz Eğitim ve Araştırma Hastanesi, ANKARA Oküler enfeksiyonların spesifik tedavisi için etiyolojik ajanın tesbiti gerekli olabilmektedir. Klinik özelliklere bakarak enfeksiyona neden olan mikrobiyolojik faktörün doğru bir şekilde tanınması her zaman mümkün değildir. Hatta bazen hastalık enfektif mi yoksa non enfektif mi ayırtedilmesi bile güç olabilir. Çünkü enfeksiyona ait klinik özellikler büyük değişkenlikler gösterebilir ve patojene özgü patognomonik bulgular her olguda bulunmayabilir. Bu durumda enfeksiyon etiyolojisinin ortaya konulabilmesi için bir takım laboratuvar incelemeleri yapılmalıdır. Klinik izlenimin laboratuvar incelemenin yönlendirilmesinde büyük önem taşıdığı unutulmamalıdır. Klinisyenin tecrübesi ile mikrobiyoloğun ajanı isole etmedeki becerisi birleştiğinde tanının doğru konulabilme şansı artmaktadır. Günümüzde topikal ve sistemik immünosupresif tedavilere daha çok başvurulması, HIV infeksiyonunun sıklığında ki artış, kontakt lens kullanımının yaygınlaşması sonucu fırsatçı patojenlere bağlı oküler enfeksiyonların görülme sıklığı artırmıştır. İmmün sistemi baskılanmış bir olguda enfeksiyona yol açan patojenin doğru bir biçimde tesbitinin mikroorganizmanın eradikasyonunda çok büyük bir rol oynayacağı kesindir. Bu gün için oküler enfeksiyonlarda etyolojik tanının konulmasında mikroskopik inceleme ve kültür altın standart olarak kabul edilmektedir. Enfeksiyona yol açan patojenin tesbitinde temel nokta mikroorganizmanın invitro olarak üretilmesidir. Üreme gerçekleştirildiğinde mikroorganizmayla ilgili bazı metabolik testler ve antibiyotik duyarlılık testleri yapılarak tanının daha spesifik konulmasında ve tedavinin etkin bir biçimde verilmesinde yardımcı olacak önemli bilgiler elde edilir. Kültür işlemi numunenin uygun bir vasata ekilmesi ile başlar. Etiyolojik ajanın isolasyonu için alınan örnekler çoğunlukla bakteri ve mantarlara yönelik kültürler ile incelenir. Enfekte olan oküler dokuya göre isole edilmeye çalışılan mikrobiyolojik ajana yönelik farklı kültür vasatları kullanılabilir. Örneğin korneal enfeksiyonlar için bakterilere, mantarlara ve amiplere yönelik protokoller uygulanırken, endoftalmi için amiplere yönelik kültür vasatlarına gerek yoktur. (Tablo 1.)1 Oftalmolojide görülen enfeksiyonlara neden olan bakteriler için kanlı agar, çikolota agar, mantarlar için Sabouraud agar genellikle yeterlidir. Tiyoglikolat ve beyin kalp infüzyon buyyon ise hem bakterilerin hem de mantarların isolasyonunda kullanılabilir. Oküler enfeksiyonlarda kültür işlemi diğer doku ve organlardaki kültür uygulamalarından bazı yönleriyle önemli farklılıklar gösterir :
Bu farklılıklar gözönüne alındığında yapılan kültürden en doğru sonuçların elde edilebilmesi için incelenecek materyalin uygun bir biçimde muamelesi ve uygun besiyerine ekilmesi kritik bir önem arz eder. Mümkünse elde edilen numunelerin (özellikle bakteriler için) vasatlara ekimi hasta başında yapılmalı, transport vasatlarındadan olabildiğince kaçınılmalıdır. Oküler yüzeyden veya intraoküler sıvılardan elde edilen örnekler birden fazla vasata ekilmelidir. Kültür Besiyerleri Rutin besiyerleri buzdolobında saklanabilir. Sadece taze besiyerleri kullanılmalıdır. Kuru görünümlü, petri kutusunun kenarlarına doğru çekilmiş besiyerleri kullanılmamalıdır. Genel anlamda besiyerleri 3'e ayrılır. 2 -Seçici olmayan besiyerleri: Besin değeri yüksek agarlardır. Kanlı agar ve çikolata agar bu gruba örnek olarak verilebilir. -Seçici besiyerleri: İstenen mikroorganizmaların üremesini desteklerken istenmeyen mikroorganizmaları inhibe ederler. -Ayırtettirici besiyerleri: Bazı fizyolojik özelliklerden yararlanarak (karbonhidrat fermentasyonu gibi) farklı görüntülerde üremeye neden olurlar. Sabouraud dekstroz agar hariç tüm vasatlar 37 derecede inkübe edilir. Sabouraud dekstroz agarın inkübasyonu ise 25-27 derecede olmalıdır. Çikolata agar %3-5 CO2 ile inkübe edilir. Kanlı agarın anerobik bölmelerde bekletilmesi ile anaerobic bakterilerin üretilmesi sağlanır. Diğer bütün vasatlar aerobic ortamda inkübe edilir. Sıvı vasat ortamındaki bakteriyel üreme bulanıklık olarak ortaya çıkar ve mikroorganizmanın tanımlanması için subkültürlere ve gram boyamalara ihtiyaç duyulur. Solid bakteriyel ve fungal kültür vasatında inokülasyon bölgesindeki üreme 10'dan fazla koloni içeriyorsa anlamlı kabul edilir. Ayrıca aynı mikroorganizma farklı özellikteki birden fazla vasatta üremişse kültür pozitif kabul edilmelidir. Bakteri ve mantar kolonileri çıplak gözle incelenirken acanthamoeba üremesinin tesbiti için mikroskop kullanımını gerekir. Ekim yapılan vasatın günlük kontrolleri yapılmalı ve imha edilmeden en az 1-2 hafta inkübe edilmelidir. Nocardia, atipik mycobacteria gibi bakteriler ve acanthamoeba yavaş büyür ve uzun süreli inkübasyon gerektirirler. Göz enfeksiyonuna yol açan mantarların çoğu saprofittir. Bu mantarlar genellikle 1 hafta içinde ürerler ancak uygun sporülasyon ve tanımlanmaları için besiyeri 2-4 hafta inkübe edilmelidir. Besiyeri Tipleri Kanlı Agar Deniz yosunu, hayvansal dokulardan elde edilmiş özüt, dextroz ve mayadan oluşan bir baz içeriğidir.2 Zenginleştirilmiş, seçici olmayan, genel amaçlı ve bir çok aerob (neisseria, haemophilus ve moraxella hariç) ve aneorob bakteri ile mantarın üremesine izin verir. Bakterilerdeki hemolizin enzimlerinin neden olduğu hemoliz derecesine göre Gr + koklar için ayırtettirici bir besiyer özellliği de taşır. (Örneğin ß hemolizine bağlı hemolizde koloniler etrafında tam şeffaf bir alan oluşurken a hemolizine bağlı hemoliz koloniler etrafında yeşilimsi bir renk oluşturur.) Tiyoglikolat Buyon Yarı katı, besin değeri yüksek; anaerob, aerob ve fakültatif anaerob bakterilerin üremesini aktive eden bir besiyeridir. Tiyoglikolat reaksiyonu oksijenin kademeli olarak azalmasını ve besiyerinin dip kısmında anaerop ortamın oluşmasını sağlar. Zorunlu aeroblar tüpün üst kısmında mikroaerofiller ortada, anaeroblar ise dipte ürer. Sabouraud Agar Düşük pH'lı seçici bir besiyeridir ve çoğu bakterinin üremesini inhibe ederek mantarların üremesini kolaylaştırır. Mayalar için uygun olan bu zengin besiyeri bitkisel mantarlar için uygun olmayabilir. Çikolata Agar Haemophilus sp., N gonorrhoeae, N meningiditis ve Moraxella sp. in üreyebilmesi için gerekli olan hemin ve nikotinamid adenin dinükleotid faktörlerini sağlayan koyun kanı içerir. Bunula birlikte N. gonorrhoeae'den şüphelenildiğinde diğer bakterileri inhibe eden antibiyotikler (vankomisin, kolistin, nistatin) ilave edilmiş olan Thayer-Martin besiyeri kullanılır. MacConkey Agar Asıl olarak Gr (-) basillerin üretilmesinde kullanılır. Gr(+) üremeyi inhibe ettiğinden seçici ve ayırt ettirici besiyeridir. Bakterilerin laktozu fermente etme özelliklerine göre kolonilerde farklılıklar görülür. Eosin - Metilen Mavisi Agar Gr (-) enterik basillerin tanımlanmasında kullanılan ve Gr (+) bakterileri inhibe eden ayırtettirici bir besiyeridir. (besiyerine eklenen eozin ve metilen mavisi Gr (+) bakterileri inhibe eder) Ayrıca bu besiyerinde de laktozu fermente eden ve etmeyen bakterilerin ayrımı mümkündür. Mannitol Tuz Agar S. aureus izolasyonunda kullanılan bir besiyeridir. S. aureus dışı birçok bakteri için inhibitör olan %7,5 tuz içerir. Safra Eskulin Agar D grubu streptokokların tanımlanmasında kullanılır. Beyin Kalp İnfüzyon Buyon Katı besiyeri ile birlikte kullanılan, besin içeriği yüksek, tamponlanmış bir buyondur. Sıvı olduğu için katı besiyerine ekilemeyen bakteriler kolayca ürer. Antibiyotikler ve bakteri üremesine engel olan faktörler sıvıda dilüe olacakları için üreme daha kolay gerçekleşir. Az miktardaki bakteri varlığında üremeyi artıcı özellikte bir besiyeridir. Ancak bu sıvı besiyerinde üremenin ekim yapılan bölgede mi olduğunu veya üremenin miktarını tam olarak değerlendirmek mümkün değildir. Lowenstein - Jensen Besiyeri Mycobacterium sp.'in ayırtedilmesinde kullanılan bu besiyeri az sayıdaki bakterinin üremesini sağladığı için ilk kültürde kullanılır. Bakteriler İçin Kültür Klinik bulguların doğru yorumlayarak enfeksiyon etkeninin isabetli bir biçimde tahmin edilmesi uygun kültür vasatının belirlenmesi için kritik bir öneme sahiptir. Ayrıca beklenen organizmaya göre inkübasyon şartlarının da ayarlanması gerekebilir. Ekim yapıldıktan sonra kültür vasatlarının günlük izlenmesi önemlidir. Bakteriyel üreme genellikle 24 48 içinde olur. Üreme olan kültürler mikroorganizmanın tipinin belirlenmesi için çeşitli biyokimyasal ve antibiyotik duyarlılık testlerine tabii tutulur. Bu işlemler ilaveten bir kaç gün alabilir. Staphylococcus sp. için koakülaz testi ve Enterobacteriaceae için oksidaz testi biyokimyasal testlere örnek olarak verilebilir. İsole edilen mikroorganizma klinik bulgularla ve direkt yayma ile uyumluysa ve mikroorganizma birden fazla vasatta üremişse isolasyon anlamlı kabul edilir. Mantarlar İçin Kültür Gözde enfeksiyon oluşturan mantarlar genellikle hızlı büyüyen saprofitik özelliktedirler. Bunlar kanlı agar, çikolata agar gibi bakteriler için hazırlanmış vasatlarda çoğalabilirler. Mantarların izolasyonu için spesifik besiyerleri Sabouraud veya Beyin kalp infüzyon agar besiyerleridir. Tiyoglukolat veya Beyin kalp sıvı besiyerleri de kullanılabilir. Sabouraud dekstroz agar gibi fungal kültür vasatları saprofitik fungusların üremelerini inhibe edici sikloheksimid içermezler. Örnekler 25-320C de ve %5 CO2 ortamda inkübe edilir. Fungal üreme 24 saat ile 2 hafta arasında bir sürede gerçekleştiğinden vasatlar negatif olarak kabul edilmeden önce 2-3 hafta inkübasyonda tutulmalıdır. O'Day'in çalışması fungal kültürlerin % 'nün 14-19 günden önce pozitif olmadığını göstermektedir.3 Viruslar İçin Kültür Oftalmolojide nadiren başvurulan viral kültürler en sık herpes grubu virusların (CMV, HSV 1-2 ve VZV) isolasyonunda kullanılır. Viral teşhis için numunelerin laboratuvara gönderilmesinde daima uygun taşıyıcı ortamlara ihtiyaç duyulur. Taşıma ortamı alınan numunenin tipine göre farklılıklar gösterir. Genellikle Hank's Dengeli tuz solüsyonu ve ya 2 sukroz fosfat buyon kullanılabilir. Numuneler viroloji laboratuvarında değişik tekniklerle muamele edilebilir. Hangi tekniğin uygulanacağı örneğin tipine, aranan spesifik virusa göre değişkenlik gösterir. Orta düzeyde donanıma sahip laboratuvarların büyük bir kısmı virus kültürü için gerekli işlemleri uygulayabilir. Viruslara ait içerik hücre kültürlerinde amplifiye edilerek virusların varlığı tesbit edilir. HSV ve adenovirus için primer ve üretilmiş hücre dizileri kullanılmaktadır. Örneğin korneal kazıntıdan HSV isole etmede HeLa, Vero, Hep 2, MRC-5 gibi oluşturulmuş hücre kültürleri kullanılabilmektedir. Ayrıca immortalize (ölümsüz) insan kornea hücre kültürlerinin HSV isolasyonunda çok duyarlı olduğu gösterilmiştir. Viruslar tüplerlerdeki hücre kültürlerinde veya shell vial yöntemleri ile çoğaltılabilirler. Shell vial yönteminde kültür sonrası vasat santifüj edilir ve viral üremenin varlığı enzime konjuge edilen antiviral serum ile tesbit edilir. Shell vial yöntemi hızlı sonuç vermesine rağmen sensitivitesi çok yüksek olmadığı için plakaya dayalı sistemlerle birlikte kullanılmalıdır. Hücre kültürlerindeki virus üremesi; karakteristik hücresel değişiklikler ve sitopatik etkinin gösterilmesine ve ya enfekte hücrelerde viral antijen tesbitine dayalı olan IF ve IP teknikleri ile yapılabilmektedir. Sitopatik etkinin oluşması için birkaç gün gerekirken antijen varlığı daha erken tespit edilebilir. Dolayısıyla kültürde virus varlığının gösterilmesi antijen tesbiti yolu ile çok daha hızlı sonuç vemektedir. Virüslerin kültür ile izolasyonu zaman alıcı ve teknik olarak zor olmasının yanı sıra nisbeten özel ve pahalı gereçlere ihtiyaç duymaktadır. Ayrıca viral kültürlerin sensitivitesi orta düzeydedir. Dolayısıyla son zamanlarda moleküler tanı yöntemleriyle viral DNA'nın gösterilmesi (PCR) klinik pratikte virüs izolasyonundan daha sık kullanılmaktadır. Amipler İçin Kültür Acanthamoeba için standart besiyeri Escherichia coli ile kaplanmış besinsiz (non nutrient) agardır. Örnek plakanın yüzeyine çizmeden veya yüzeyi delmeden sadece hafifçe dokundurularak ekilir. Eğer kültür hasta başında yapılmayacaksa korneal kazıntı örnekleri tuzlu su solüsyonu içerisinde laboratuvara gönderilmelidir. Ekim iki ayrı plakaya yapılır ve plakalar 25 ve 37°C'de ayrı ayrı inkübe edilir. Ardından plakada trofozoit ve kistlerin varlığı mikroskopun X4 büyütmesi ile incelenir. Acanthamoeba koloni oluşturmaz. Trofozoitler 24-48 saat içinde izlenebilir. E coli çimlerinin üzerindeki trofozoitin migrasyonu ile oluşan karakteristik yollar görülebilir. İnkübasyona devam edildiğinde trofozoitlerin kiste dönüşümü tesbit edilir. Plakalar en az 10 gün boyunca izlenmelidir. Antibiyotik Hassasiyet Testleri Duyarlılık testleri tedavide kullanılacak en etkili ilacın tesbit edilmesini sağlar. Mikroorganizmanın antiyotik resistansının tayininde kullanılan yöntem genellikle Kirby-Bauer disk diffüzyon tekniğidir. Tesbit edilen bakteri inokulumu büyük bir plakaya ekilir ve antibiyotik emdirilmiş diskler agar yüzeyine yerleştirilirler. Bakteriyel çoğalma disklerden diffüze olan antibiyotiklerce çeşitli seviyelerde inhibe olur. Disk çevresinde oluşan bu inhibisyon zonunun alanı mikroorganizmanın test edilen antibiyotiğe resistansını ve ya duyarlılığını gösterir. Disk diffüzyon metodu ile bakterilerin duyarlılıklarının tesbitinin standardizasyonu yapılmıştır ve piyasada bulunan antibiyotik diskleri klinik mikrobiyoloji laboratuvarınca kullanılmaktadır. Bakteri isolatlarının antibiyotiklere duyarlılıkları Klinik Laborotuvar Standartlar Enstitüsü tarafından standardize edilmiştir (CLSI M02-A10, 2009). Antibakteriyal ajanlara karşı resistansın hassas bir şekilde belirlenmesi gerektiğinde ve Minimum İnhibitör Konsantrasyonunun (MİK) belirlenmesinde sıvı vasat dilüsyon ve agar dilüsyon metodları da (CLSI M07-A8, 2009) kullanılabilmektedir. MİK tesbitinde antibiyotik konsantrasyonu farklı miktarlarda dilue edilmiş sıvı vasatlardaki bakteriyel üreme incelenir. Disk diffüzyon metodu ile mikroorganizma duyarlı, resistan ve orta düzeyde duyarlı olarak belirlenirken; sıvı vasat dilüsyon yöntemleri MİK'in yanı sıra minimum lethal konsantrasyonu da belirleyebilirler. Bu bilgi özellikle etkili konsantrasyonun MİK'dan 2-4 kat daha yüksek olduğu endoftalmi olgularında çok önemlidir. MİK tesbitinde basit bir yöntem olan E-Test kantitatif antimikrobiyal hassasiyet testi olarak piyasada bulunmaktadır. Bakteriyel isolatlarda antibiyotikler için MİK tesbiti maliyeti yüksek bir prosedür olmakla birlikte bir çok laboratuvar tarafından rutin olarak kullanılmaktadır. Antibiyotik hassasiyet testlerinin sonuçları değerlendirilirken unutulmaması gereken nokta antibiyotik disklerin sistemik antibiyotik kullanımı sonucu serumda oluşabilecek miktarda ilaç içerdikleridir. Yani topikal tedavi ile gözyaşı filmindeki veya korneada meydana gelen ya da intravitreal enjeksiyonlarla oluşan yüksek konsantrasyondaki intraoküler ilaç miktarının çok altında ilaç içerirler. Dolayısıyla belli bir antibiyotiğe resistan olarak rapor edilmiş bir mikroorganizma oftalmik uygulamalarda aynı ilaca duyarlı olabilir. Ayrıca in vitro testlere dayanan direnç ve ya duyarlılık antibiyotiğin klinikteki gerçek etkinlik düzeyini yansıtmayabilir. Antibiyotiklerin etkinliğinde konağa ait faktörlerin ve ilacın oküler dokulara penetrasyonun da rol oynadığı unutulmamalıdır. Mantarlar için antifungal ajanlara karşı duyarlılık testleri son zamamlarda geliştirilmiştir ve buyyon veya agar dilüsyon yöntemi ile MİK saptanır. Besiyeri seçimi test edilecek antimikotik maddeye bağlıdır. Test edilen ilaçlar genellikle flusitosin, ketakanozol, mikanozol, flukanozol, itraconazol ve amphoteresin B'dir. Mayalar için tıpkı bakteriler için olan hassasiyet testlerine benzer in vitro duyarlılık testlerinin laboratuvarlarda %85- 90 tekrarlanabilirlikle uygulanabilmesini sağlayan standardize bir rehber yayınlanmıştır (CSLI M51-A,2009). Pekçok anti fungal için E-test bulunmakla birlikte antifungaller için duyarlılık testleri henüz rutin olarak kullanılmamaktadır. Çeşitli Oküler Enfeksiyonlarda Kültür Blefarit Blefarit olgularından alınan kültürlerin büyük çoğunluğunda S. aureus üremektedir. Ancak S. aureus blefarite yol açmaksızın normal kapakta da kolonize olabilir. Dolayısıyla kültür pozitifliği her zaman blefarit etkeninin S. aureus olduğunu göstermeyebilir. Özellikle koagülaz negatif stafilokoklar normal kapak florasının bir parçasıdır ve kültürde %80 oranında üreyebilirler ancak patojen olarak kabul edilmemelidirler. Kapak kenarının kültürü kazıma işlemi gerektirir. Kapak kenarından kültür almak için Hank's BSS veya beyin kalp infüzyon besiyeri veya normal saline ile ıslatılmış steril pamuk uçlu aplikatör veya kalsiyum alginat swab kullanılır. Bu swab direkt olarak kanlı agar, çikolata agar, Mac Conkey agar ve Sabouraud dekstroz agara ekilir. Kanalikülit Kanalikülden masajla akıntıdan alınan örneğin kanlı agarda anaerob şartlardaki kültüründen aktınomiçes üreyebilir. Ayrıca tiyoglikplat besiyerinin derinlerine doğru aktınomiçet kolonileri ekmek kırıntısı şeklinde gözlenebilirler. Konjonktivit Bakteriyel konjonkttivitte tanı çoğunlukla klinik olarak konulabilmekte ancak bazı durumlarda etken mikroorganizmanın sürüntü alınarak ve kültürlerle üretilerek gösterilmesi gerekebilmektedir. Özellikle 2 haftayı aşan kronik bir enfeksiyon söz konusu ise, antımikrobiyal tedaviye cevap alınamamışsa veya hasta çok küçük bir çocuksa (örneğin neonatal konjonktıvit) laboratuvar incelemeleri yapılmalıdır. Ayrıca erken postoperatıf dönemde oluşan konjonktıvitlerde sonrasında oluşabilecek bir endoftalmiye yönelik tedbir amacıyla kültür alınmalıdır. Konjonktıval sürüntüler kanlı agar ve çikolata agara alınmalıdır. Gonokok şüphesi varsa Thayer Martın agara da ekim yapılmalıdır. Etkenin klamidya olduğunun düşünüldüğü durumlarda nadiren kültüre başvurulur. Klamidya katı agarlarda değil sadece doku kültürlerinde üretılebilirler. Doğumdan itıbaren başlayan ve yaşam boyu devam eden mikrobiyal floranın varlığı konjonktıvit olgularında yarı kantıtatıf ve kantıtatıf metotların kullanılmasını gerekli kılmaktadır. Dolayısıyla konjonktıvadan alınan numunenin kültür pozitıf sayılması için her bakteri için bir eşik üreme değeri tanımlanmıştır. (Tablo 2) Dakriyoadenit Lakrimal gland infeksiyonuna en sık yol açan bakteriler Nocardia, Actınomyces ve anaerobic bakteriler ve ya Gr (+) ve Gr (-) bakterilerden oluşan mikst bir flora ile enfekte olur. Dolayısıyla aerobic kültür yanında anaerobic kültür gereklidir. Keratit Korneayı bakteriler, virüsler, parazitler ve mantarlar enfekte edebilir. Klinik bulgulara dayanarak etıolojinin tesbitı her zaman için doğru ve tutarlı olmayabilir. Enfeksiyoz keratıt olgularına standart yaklaşım ile ilgili çeşitli ilkeler tanımlanmıştır. Yapılan çalışmalar tedaviye başlamadan alınacak kültürün önemini göstermektedir.4,5 Ancak genel oftalmologların büyük bir kısmı klinik pratıklerinde kültüre nadiren başvurmaktadırlar. ABD'de yapılan bir çalışma korneal ülser olgularının sadece yarısından kültür alındığını göstermektedir.6 Yapılan çalışmalar göstermektedir ki kornea ile uğraşan oftalmologlar genel oftalmologlara göre daha fazla oranda kültüre başvurmaktadırlar.7 Bazı yazarlar, seçilmiş bazı keratıt olgularında kültür alınmadan, ampirik tedaviye başlamanın da kabul edilebilir bir uygulama olduğunu belirtmektedir. Bu istisnai durumların: küçük (< 2 mm), travmaya (özellikle bitkisel travmalar) bağlı olmayan, yüzeyel ve periferal (görme aksında yer almayan) keratit odakları olabileceği; böyle hastalarda ampirik tedavi ile başlanıp hastanın günlük takibinin maliyet-etkinlik açısından kabul edilebilir olduğu bildirilmektedir.8 Viral keratitten şüphelenilen olgularda da genelde başlangıç tedavi klinik bulgulara dayanılarak belirlenir. Keratit olgularına ampirik tedavi başlama olguyla ilk karşılaşan oftalmoloğun tecrübesi, olguyu değerlendirebilme yeteneği ve tablonun klinik seyri ile ilgilidir. Keratit olgularında tanısal araştırmada kullanılacak örnekler; korneal kazıntı, gözyaşı örneği ve korneal biyopsidir. Korneal kazıntı için cerrahi bıçak en iyi seçenektir. Prezervan maddeler bakteriyel çoğalmayı inhibe ederlerken bazı anestetik madddeler de kimyasal yapıları gereği antimikrobiyal etkilidirler. Korneadan yapılacak kazıntı öncesi topikal anestezi için bakteriler üzerinde inhibitör etkisi en az olan ve prezervan içermeyen Proparakain kullanılabilir. Korneal kazıntıdan alınmış kültürün negatif çıktığı bir olguda, tedaviye cevap vermeyen progresif bir keratitte, derin stromal enfeksiyonlarda; trefanla ve ya bıçak ile serbest lameller diseksiyon ile alınan korneal biyopsi örneği kültür ile incelenmelidir. Derin stromal enfeksiyonlarda kültür almanın bir diğer yolu da enfekte bölgeden 6/0 ipek sütür geçirilmesidir. Eğer keratitli bir olgunun gözünde kontakt lens varsa aseptik bir biçimde çıkartılmalı ve steril salin içine yerleştirilerek laboratuvara gönderilmelidir. Enfeksiyöz keratitli bir olguda tek başına kanlı agar ve ya çikolata agarına ekim multible vasatlara ekime iyi bir alternatif olarak bildirilmektedir. Lens kaplarından alınan sıvıların kültürü kanlı agar, MacConkey agar, Sabouraud dekstroz agarda yapılmalıdır. Eğer keratit kronikse atipik Mycobacterium chelonae gibi bakteriler için Lowenstein-Jensen besiyerine ekim yapılmalıdır. Nocardia türlerinden şüphelenildiğinde kanlı agara ekim yapılmalı ve 1 hafta süre ile %4'lük CO2 bir ortamda bekletilmelidir. Acanthamoeba keratitinden şüphelenildiğinde alınan örnek ölü ve ya canlı E. coli ile kaplanmış non-nütrient agara ekilmelidir. Marangon ve ark. merkezlerine refere edilen keratit olgularının %56'sına amprik tedavinin başlanmış olarak başvurduğunu bildirmektedirler.9 Antibiyotik tedavisi almakta olan olgularda mikroorganizmanın kültür ile tesbit edilebilmesi güç olmaktadır. Bu durumda kültürden elde edilecek pozitif sonuç oranı değişmemekte ancak patojenin isolasyon süresi uzamaktadır. Özellikle suboptimal dozlarda verilen antibiyotiğin kültürdeki bakteriyel çoğalmayı tamamen inhibe etmeyeceği akılda tutulmalı ve olgu başvurduğunda antibiyotik kullanıyor olsa bile kültür alınmalıdır. Yapılan bir çalışma antibiyotik kullanan keratit olgularından alınan kültürlerde tedavi almayanlara nazaran Gr(-) bakterilerin, fungusların ve Acanthamoeba'nın daha sık ürediğini göstermiştir.10 Herpetik keratit düşünülen olgularda eğer etiolojik ajanın tesbiti gerekiyorsa HSV 1 için kültür yapılabilir. İnsan korneal epitel hücre dizileri HSV 1 üretilmesi için mükemmel bir ortamdır. Eğer viral kültür gerekliyse kazıntı direkt viral transport vasatıda ekilmeli ve hemen laboratuvara gönderilmeli veya buzdolabına yerleştirilmelidir. Endoftalmi Bir endoftalmi olgusunun steril mi yoksa enfeksiyöz mü olduğunun tesbit edilmesi çok önemlidir. Eğer olgu enfeksiyöz ise sebep olan mikroorganizmanın doğru belirlenmesi ve hassasiyet testlerinin yapılması ve sonucun en kısa zamanda elde edilmesiyle etkin bir antimikrobiyal tedavinin başlanması elde edilecek görsel sonuç açısından hayati öneme sahiptir. Mikrobiyoliojik incelemeler için oküler sıvılar bir an önce alınmalıdır. Bir endoftalmi olgusunda enfektif ajanın üretilebileceği en muhtemel örnek vitrektomi kesicisi ile elde edilmiş vitreus materyalidir. Vitreus örneği vitrektominin hemen başında kesiciye bağlı aspirasyon portuna bağlı şırınga ile aspire edilerek elde edilebilir. Daha sonra enjektöre iğnesi steril bir şekilde takılarak enjektör içindeki hava dışarı çıkartılmalıdır. Enjektörün içindeki havanın boşaltılması aneorobik bakterilerin inaktivasyonunu önlemede önemlidir. Sadece vitreustan örnek almak amacıyla dizayn edilmiş taşınabilir vitrektör de bu amaçla kullanılabilir. Alınan materyal mümkünse hemen hasta başında vasata inoküle edilmelidir. Eğer ekim laboratuvarda yapılacaksa iğnenin ucu kapatılıp enjektör steril bir tüp içine yerleştirilip anında laboratuvara gönderilmelidir. Patojenin ön kamara sıvısından belirlenebilme şansı daha azdır. Kültür için yaklaşık 150 200 ^l aköz humör aseptik olarak aspire edilip yukarıda vitreus için anlatılan işlemlere tabi tutulmalıdır. İdeal şartlarda alınan numunenin kültür vasatına ekimi 15-30 dakika içinde gerçekleştirilmelidir. Materyalin transportu patojeni saptama oranını düşürür. İntraoküler numunelerin taşınmasında konvansiyonel transport ortamları tercih edilmez. Alınan numunede muhtemel mikroorganizma sayısı çok düşük olduğundan intraoküler numune öncelikle bakteri ve funguslara yönelik kültür işlemlerine tabi tutulmalıdır. Aköz hümör ve vitreus hümör normalde steril sıvılar oldukları için selektif vasatlara ekilmelerine gerek yoktur. Kültür için aeorobik ve anaerobik bakterilere ve funguslara yönelik çeşitli besiyerleri kullanılabilir. Ekim yapılacak vasat sayısı numune miktarının yeterliliğine bağlıdır. Solid besiyerine ekim için 1-2 damla örnek iğne ucundan damlatılır. Sıvı besiyerlerine de 2-3 damla damlatılır. Kanlı agar ( 37°C de aerobik bakteriler için, oda sıcaklığında ise saprofitik mantarlar için), çikolata agar (37°C de %10 CO2 altında Haemophilus, Neisseria, and Moraxella için) ve beyin kalp infüzyon vasatı (oda sıcaklığında pek çok mantar türü için) Robertson pişmiş et besiyeri, tiyoglikolat besiyeri (anaerobik bakterilerin isolasyonu için) gibi vasatlar kullanılabilir. Antibiyotik hassasiyet testi standart Kirby-Bauer disk diffusion tekniği ile yapılır. Sabouraud dekstrose agarına ekim yapılırsa 25°C'te inkübe edilmelidir. Eğer kanlı agar, çikolata agar ve beyin kalp infüzyon vasatında 48 saat içinde üreme olmamışsa 25°C'te 7 gün inkübe edilerek mantar üremesine bakılmalıdır. Kronik endoftalmi olgularında P. acnes izolasyonu için en az 14 gün süren anaerobik inkübasyon ortamı olmalıdır. Göz Dışı Örneklerin Mikrobiyolojik İncelemeleri Özellikle endojen endoftalmilerde aköz hümör ve vitreus kültürlerinin yanı sıra non- oküler spesimenlerin kültürleri de anlamlıdır. Öncelikle her hastadan kan kültürü alınmalıdır. Jackson ve ark. endoftalmiye neden olan mikroorganizmaların en sık kan kültürü ile saptandığını bildirmektedirler.11 Endojen endoftilmilerin önemli bir kısmının mantarlara bağlı geliştiği unutulmamalı, alınan kültürlerde mantarların üremesine yönelik şartlar sağlanmalıdır. Olgunun özelliklerine göre başka spesimenlerden örneğin balgam, gaita, beyin omurilik sıvısı, kemik iliği, karacaiğer absesi aspiratlarından alınacak kültürler intraoküler enfeksiyona neden olan ajan hakkında değerli bilgiler verebilir. Tablo - 1: Oküler örnekler için kültür vasatları
Tablo - 2: Konjonktivadan alınan numunenin "Kültür Pozitif" olduğuna karar vermek için Eşik Kriteri
Kaynaklar
OKÜLER ENFEKSİYONLARDA MİKROSKOPİ Dr. M. Cem MOCAN Hacettepe Üniversitesi Göz Hastalıkları Anabilim Dalı, ANKARA Giriş Oküler enfeksiyonlarda tedaviyi belirleyen ve yönlendiren en değerli tanısal yöntemlerin başında alınan sıvı, doku ve örneklerde mikroorganizmaların mikroskopik olarak değerlendirilmesi gelmektedir. Klinik şartlarda sorumlu etkenlerin belirlenmesi için çoğunlukla ışık mikroskopisi kullanılmaktadır. Bununla birlkte son yıllarda kullanım alanı genişleyen in vivo konfokal mikroskopi tekniği ile canlı kornea dokusunda gerçek zamanlı mantar ve protozoal mikroorganizmaların varlığı gösterilebilmektedir. Mikroorganizmaların ışık mikroskopisi ile görüntülenmesini ve ayırt edilmesini sağlamak için farklı hücre boyaları kullanılmaktadır. Bu boyalar arasında en önemlisi ve sık kullanılanı 1884 yılında Hans Christian Gram tarafından geliştirilen Gram boyası olmakla beraber, Giemsa, Ziehl-Neelsen, Gomori methenamine gümüş boyaları da oküler enfeksiyonların değerlendirilmesinde kullanılmaktadır. Bakteriler Oküler enfeksiyonlara neden olan en sık mikroorganizmalar prokaryotik hücre özelliği taşıyan bakterilerdir. Bakteriler, ışık mikroskopi altında Gram boyasının hücre duvarının boyama özelliğine göre Gram pozitif ve Gram negatif olmak üzere iki temel grupta incelenir. Gram pozitif bakterilerin, hücre zarlarının dışında kalın bir peptidoglikan katmanı mevcuttur. Gram negatif bakterilerin ise iç hücre zarlarını çevreleyen çok ince bir peptidoglikan tabakası ve bu tabakayı çevreleyen lipopolisakkarid içeren dış hücre zarı bulunmaktadır. Hücre zarlarındaki bu yapısal farklılıklar, doğru teknikle uygulanan Gram boyasının içinde bulunan kristal viyole maddesinin Gram pozitif bakteri duvarında tutulmasına neden olur. Hücre zar özellikleri nedeniyle kristal viyole (mor) boyasını tutamayan Gram negatif bakterilerin görüntülenmesi için bu bakterilerin ek boyama maddesi (safranin) kullanılarak renklendirilmesi (açık pembe) gerekir. Gram boyaması hem bakterilerin sınıflandırılması hem de antibiyotik hassasiyetlerinin tahmin edilmesinde kullanılan bir tanı yöntemidir. Gram Pozitif Koklar Stafilokoklar Stafilokok suşları oküler enfeksiyonlara neden olan bakterilerin başında gelmektedir. Blefarit, konjonktivit, dakriyosistit ve dakriyoadenit gibi eksternal göz enfeksiyonlarının yanı sıra, bakteriyel keratit ve endoftalmi gibi ciddi enfeksiyonlarda rol oynamakta ve kalıcı görme kaybına neden olabilmektedirler. Stafilokoklar ışık mikroskopisi altında tek veya kısa zincirler olarak izlenebilse de, en sık üzüm bağı görüntüsünü andıran kümeler şeklinde izlenirler. Hücre bölünmesi sırasında ortaya çıkan iki bakterinin birbirlerinden tamamen ayrılmaması nedeniyle küme olarak görüntülenirler. Stafilokokların en önemli özelliklerinin başında fagositozu engelleyici özellikte biofilm salgılamaları ve hastalık oluşturucu toksin ve enzimlere sahip olmalarıdır. Oluşturdukları biofilm, metabolik hızlarının azalmasını sağlayarak ve antibiyotiklerin ulaşmasını zorlaştırarak bu suşlarınn dokulardan temizlenmesi güçleştirir. Fakültatif anaerobik bir bakteri olan S. epidermidis, göz kapak cildini, kapak kenarını ve konjonktivayı kolonize eder ve genellikle bağışıklık sistemi bozuk veya bölgesel doku hasarı olan konaklarda fırsatçı göz enfeksiyonlarına yol açar. Yapılan çalışmalar, S. epidermidis'in enfeksiyöz endoftalmilerin ve keratitlerin önde gelen nedenlerinden biri olduğunu göstermektedir. Diğer bir yandan koagülaz enzimi salgılayan S. aureus, daha virülan bir mikroorganizmadır ve ağır seyirli keratit ve endoftalmi tablolarına neden olabilmektedir. Streptokoklar Blefarit, konjonktivit, dakriyosistit, darkriyoadenit ve keratit enfeksiyonlara yol açabilen Streptokok suşları, Gram boyası ile zincir, çift veya tek olarak gözlemlenir. Özellikle diplokok özellikte izlenen S. pneumoniae suşları, fagosiztozu engelleyici polisakkarid kapsülü ve nötrofil kemotaksisini engelleyici pnömolizin enzimi nedeniyle hızlı seyirli, tedavisi güç kornea enfeksiyonlarına ve çocukluk döneminde preseptal selülite yol açabilmektedir. Daha az sıklıkla göz enfeksiyonlarından sorumlu tutulan S. pyogenes ise sahip olduğu M proteinleri, streptolizin, C5a peptidaz ve hyalüronidaz enzimleri ile
Enterokoklar Gastrointestinal ve genitoüriner sistemde bulunan ve Gram pozitif kok özelliği taşıyan entereokok suşları, çift veya kısa zincirler halinde gözlemlenirler. Plazmid değişimi yoluyla hızla antibiyotik direnci kazanan E. faecalis suşları endoftalmi nedenlerinin önemli nedenleri arasındadır. Gram Pozitif Basiller Oküler enfeksiyonlara neden olan Gram pozitif özellikte olan bakterilerden Corynebacterium diphteriae akut membranöz konjonktivit etkenidir. Yaymalarda palisad oluşumu gösterir. Diğer difteroid suşları göz yüzeyinde bulunurlar ve enfeksiyon oluşturmazlar. Anaerobik özellikte olan ve postoperatif endoftalmi nedenlerinden biri olan Proprionibacterium acnes suşları, mikroskopi altında boncuk düzeni gösterebilen ince ve eğik yapıda görüntü sergilerler. Hareketli özellikte olan ve spor oluşturan bir başka Gram (+) özellikte olan Bacillus cereus ise sahip olduğu toksinler aracılığıyla hızlı seyirli posttravmatik endoftalmi yapan etkenler arasındadır. Gram Pozitif Diğer Bakteriler Mikobakteriler, mikroskopik olarak düz veya haif kıvrımlı, zayıf Gram (+) boyanma özelliği gösteren hareketsiz, aerob bakterilerdir. Mecburi hücre içi büyüme özelliği gösteren patojenlerdir. Hücre duvarlarında bulunan yüksek miktardaki mikolik asitler nedeniyle Mikobakteriler, hücre boyanması sırasında kullanılan asidik veya alkol yapısındaki renk soldurucu boyalara direnç göstermekte ve geleneksel Gram boyaması ile tanınmaları zorluk arzetmektedir. Mikobakteriyel suşların mikroskopik olarak tanınması için Ziehl-Neelsen boyaması önerilmektedir. Yavaş büyüyen M tuberculosis, enfeksiyöz posterior üveit nedenleri arasında yer almakta, bunun yanında daha hızlı büyüme özelliği gösteren M fortuitum ve M chelonei refraktif cerrrahi sonrasında ortaya çıkan keratite, sklerite, kanalikülite, üveite ve endoftalmiye neden olabilmektedir. Gram Negatif Koklar Hiperakut konjonktivit nedeni olan Neisseria gonorrhoeae göz enfeksiyonlarında nadiren rol oynayan patojenik bir bakteridir. Yaymalarda nötrofil hücreleri içinde kahve çekirdeği şeklinde Gram (-) diplokok olarak izlenirler. Yüzeylerinde bulunan tip IV pili oluşumları sayesinde epiteli hasarı olmayan kornea dokusundan geçebilmekte ve stromada erime ve kornea perforasyonu oluşturabilmektedir. Gram Negatif Basiller En ağır seyirli göz enfeksiyon nedenlerinden biri olan Pseudomonas aeruginosa, nemli ve sulu ortamlarda serbest olarak bulunan, mikroskopi altında ince Gram (-) özelliği olan hareketli aerobik bakterilerdir. P. aeruginosa fırsatçı bir organizmadır ve doğal savunma özellikleri bozulmuş gözlerde tedavisi güç enfeksiyonlara yol açar. Distile edilmiş su dahil her ortamda hayatta kalabilmesi ve tıbbi cihazlar üzerinde kolonize olabilmesi özelliği dikkat çekicidir. Biyofilm oluşturarak konak savunmasından korunabilmekte ve ekzotoksin A ve proteaz salgılayarak konak hücrelerinde hasar ve ölüme neden olurlar. P. aeruginosa özellikle kontakt lens kullanımı ile ilişkili keratit olgularından alınan spesimen incelemelerinde akılda tutulması gereken bir etkendir. Enterobacteriaceae ailesi içinde bulunan boyutları 1-5 ^m arasında olan Gram (-) boyanma özellikli basiller arasında Escherichia coli, Klebsiella, Serratia ve Enterobacter önemli keratit etkenleri arasında bulunurken, Salmonella typhi nadir görülen ancak çoğunlukla tam görme kaybı ile sonuçlanan endojen endoftalmiye sebebiyet vermektedir. Enterobacteriaceae ailesi içinde bulunan farklı suşların patogenetik özellikleri arasında pili, adhezin, sitolizin ve toksinler bulunmaktadır. Hemofilus suşları, kokobasil veya basil görünümünde olan, üst solunum yolları ve ağız mukozasında yaşayan Gram (-) özellikte bakterilerdir. Kapsülü önemli bir virülans etkeni olan H. influenzae B, çocukluk dönemi konjonktivit ve preseptal selülitlerine, bunun yanında bleb enfeksiyonlarına yol açabilmektedir. Klamidya Mecburi hüçre içi paraziti olan Klamidya ailesinin üyeleri, gözde yenidoğan konjonktiviti, erişkin inklüzyon konjonktiviti ve trahoma yol açabilmekte, bu patojenler mikroskopik olarak Giemsa boyası kullanılarak görüntülenebilmektedir. Giemsa boyası DNA'nın fosfat gruplarına bağlanma özelliği gösterir ve adenin-timidin bağlarının yoğun olduğu bölgelere bağlanır. Klamidyanın hücre içinde oluşturduğu elementer cisimcikler, ışık mikroskopisi ile hücre sitoplazması içinde hücresel inklüzyonlar (birikinti) şeklinde izlenebilmektedir. Ayrıca Klamidya, Gram boyaması ile gram negatif özellikte izlenir. Spiroketler Treponema pallidum, posterior üveit, panüveit veya anterior üveite neden olabilen, ışık mikroskopisi ile görülmesi ince boyutları nedeniyle zor olan Gram (-) kıvrımlı şekilli bir spirokettr. Taze spesimenlerde görülebilmesi için karanlık saha mikroskopisi gerekir. Karanlık saha mikroskopisinde, mikroskopun objektif merceğine ulaşabilecek saçılmadan gelen ışık demetleri filtrelenerek, inceleme sahasında olan spiroketlerden kaynaklanan kontrast farklanması incelenir. Ayrıca spiroketlerin doku spesimenlerinde gösterilmesi için Dieterle boyası kullanılabilmektedir. Treponema suşlarının elektron mkiroskopisi ile görüntülenebilen kıvrımlı görüntüsü, periplazmik boşluğunda bulunan endoflagella yapılarından kaynaklanmaktadır. Mantarlar Mantarlar, uç vererek yayılan ve sporlar aracılığıyla çoğalan ökaryotik canlılardır. Kitin ve polisakkaridlerden zengin katı hücre duvarları vardır. Oküler enfeksiyonlara yol açan filamentöz ve maya tipi mantarlar ışık mikroskopisi ile farklı boyama yöntemleri kullanılarak gösterilebilir. Mantar yapılarınn doğrudan gözlemlenmesi için 3 değişik hazırlama yöntemi önerilmektedir. Bunlar dokudan alınan ıslak örneklerin fiksasyon yapılmadan potasyum hidroksit ve laktofenol pamuk mavisi ile boyanması, Gram boyası ve başta Gomori methenamin gümüş, kalsiflorür beyaz ve periyodik asit Schiff olmak üzere özel mantar boyalarıdır. Filamentöz Mantarlar Fusarium suşları (F solani ve F oxysporum) ve Aspergillus, immünosupresyon ve travma zemininde ağır seyirli keratitlere yol açabilen, mikroskop altında uzun dal şeklinde uzanımlar gösteren, 3-6 ^m kalınlığında, septalı, tübüler hif yapısında çok hücreli fırsatçı patojenlerdir. Bu mantarların varlığı özellikle toprak teması ile sonuçlanan oküler travmalar sonrasında ortaya çıkan keratitlerde akılda tutulmalıdır. Mikroskopik olarak septalı hifler, konidiafolar, makrokonidia ve mikrokonidia yapıları izlenir. Aspergillus suşları için veziküler görünüm tipiktir. Mucor ve Rhizopus gibi orbital oküler mikozis yapan etkenler Mucoraceae ailesinin üyesidirler ve mikroskop altında septasız filamentöz yapılar olarak izlenir. Bu suşlar, bağışıklık sistemi baskılanmış veya diabetes mellitus hastalığı zemininde gelişen orbital enfeksiyonlardan alınan spesimenlerde akılda tutulmalıdır. Bu suşların geniş tabanlı (6 15 ^m) septasız veya belli belirsiz septalı hifleri ve dallanma gösteren sporanjiyosporları dikkati çeker. Mayalar
Yüklə 2,98 Mb. Dostları ilə paylaş:
|