FiZİko-kimyasal özelliklerin belirlenmesinde kullanilan yöntemler
BÖLÜM B: TOKSİSİTE VE DİĞER SAĞLIK ETKİLERİNİN TAYİNİ İÇİN YÖNTEMLER
Yüklə 5,29 Mb.
|
BÖLÜM B:TOKSİSİTE VE DİĞER SAĞLIK ETKİLERİNİN TAYİNİ İÇİN YÖNTEMLER
GENEL GİRİŞ A. TEST MADDESİNİN TANIMLANMASI Test maddesinin ana safsızlıkları içeren bileşimi ve kararlılığı içeren ilgili fizikokimyasal özellikleri, toksisite çalışmasına başlanılmadan önce bilinmelidir. Test maddesinin fizikokimyasal özellikleri uygulama yolunun seçimi, her bir özel çalışmanın tasarımı ve test maddesinin elleçlenmesi ve depolanması için önemli bilgi sağlar. Dozun uygulandığı ortamda ve biyolojik örneklerde test maddesinin (mümkünse ana safsızlıkları da içeren) nitel ve nicel olarak belirlenmesi için analitik yöntemin geliştirilmesi çalışmadan önce gerçekleştirilmelidir. Tanımlama, fizikokimyasal özellikler, saflık, test maddesinin davranışı ile ilgili tüm bilgiler test raporunda belirtilmelidir. B. BU EKTEKİ YÖNTEMLERDE KULLANILAN TERİMLER İÇİN GENEL TANIMLAR (İ) Akut Toksisite, maddenin tek bir dozunun uygulamasından sonra, belirli bir zamandaki (çoğunlukla 14 gün) gerçekleşen olumsuz etkileri kapsar. (ii) Belirgin Toksisite, test maddesinin uygulanmasını takiben, toksisitenin açık belirtilerini tanımlayan genel bir terimdir. Bu zararların değerlendirilmesi için yeterli olmalı ve uygulanan dozdaki artışın şiddetli toksisite belirtileri ve olası ölüm ile sonuçlanması beklenir. (iii) Doz, uygulanan test maddesi miktarıdır. Doz, ağırlık olarak (gram veya miligram) veya hayvan ağırlığı (örneğin, vücut ağırlığının kilogramı başına miligram) başına test maddesi ağırlığı olarak veya sabit diyet konsantrasyonları (yiyecek kilogramı başına miligram veya ppm) şeklinde ifade edilir. (iv) Ayırt Edici Doz, maddeye bağlı olarak ölüme (insan ölümlerinin içeren) sebep olmadan uygulanabilen, dört sabitlenmiş dozdan en yüksek olanıdır. (v) Doz miktarı, dozu, dozun sıklığını, dozun uygulanma süresini de kapsayan genel bir terimdir. (vi) LD50 (Ortalama öldürücü doz), Doz uygulanan hayvanların %50’ sinin ölümüne sebep olması beklenen, istatistiksel olarak türetilmiş tek bir dozdur. LD50 değeri, test hayvanının birim ağırlığı (kilogram başına miligram) başına test maddesinin ağırlığı olarak ifade edilir. (vii) LC50 (Ortalama öldürücü konsantrasyon), maruz kalma esnasında veya sabitlenmiş maruz kalma süresi içinde hayvanların % 50’ sinin ölümüne sebep olması beklenen, istatistiksel olarak türetilmiş bir konsantrasyondur. LC50 değeri standart hava hacmi (Litre başına miligram) başına test maddesinin ağırlığı olarak ifade edilir. (viii) NOAEL, Olumsuz Etki Gözlenmeyen Seviye’nin kısaltmasıdır (No Observed Adverse Effect Level, NOAEL). Uygulama ile ilgili olumsuz bulguların gözlenmediği en yüksek doz veya maruz kalma seviyesidir. (ix) Tekrarlı doz/subkronik Toksisite, hayat sürelerinin kısa bir bölümünde bir kimyasal maddeye maruz kalan veya bir kimyasal maddenin günlük tekrarlanan dozlarına maruz bırakılan deney hayvanlarında ortaya çıkan olumsuz etkileri kapsar. (x) İzin Verilebilen En Yüksek Doz (Maximum Tolerated Dose, MTD), kullanıldığı testte, toksisite belirtilerini ortaya çıkarmak için, hayati derecede büyük etkilere yol açmadan uygulanan en yüksek dozdur. (xi) Deri Tahrişi, test maddesinin uygulanmasını takiben, deride iltihaba bağlı değişikliklerin oluşmasıdır. (xii) Göz Tahrişi, gözün ön yüzeyine test maddesinin uygulanmasını takiben, gözde meydana gelen değişikliklerdir. (xiii) Deri hassasiyeti (Alerjik temas deri iltihabı), bağışıklık sistemi vasıtasıyla maddeye karşı deride ortaya çıkan reaksiyonlar. (xiv) Deri aşınması, test maddesinin 3 dakikadan 4 saate kadar sürebilen deri uygulamalarını takiben, deride ortaya çıkan tersinmez hasarlardır. (xv) Toksikokinetik, test maddesinin absorpsiyonu, dağılması, metabolizması ve atılması ile ilgili çalışmalardır. (xvi) Absorpsiyon, uygulanan test maddesinin kan dolaşımına karışmasıdır. (xvii) Eliminasyon, uygulanan maddenin ve/veya metabolitlerinin vücuttan uzaklaştırılmasıdır. (xviii) Dağılım, absorplanan test maddesinin ve/veya metabolitlerinin vücut içine nüfuz etmesidir. (xix) Metabolizma, uygulanan test maddesinin enzimatik ya da enzimatik olmayan reaksiyonlarla yapısal olarak değişikliğe uğraması işlemleridir.
Akut toksik etkiler ve maddenin organ veya sistem üzerindeki toksisitesi, tek bir dozu takiben kullanılan çok çeşitli toksisite testleri (Yöntem B.1 – B.5) ile değerlendirilebilir ve toksik etkinin ön belirtileri elde edilebilir. Maddenin toksisitesine bağlı olarak limit test veya tam bir LD50 testi düşünülebilir. Ancak solunum çalışmaları için belirlenmiş bir limit test yoktur çünkü tek bir solunum maruz kalması limit değeri henüz bulunmamıştır. Yöntemlerde hayvan kaybını en aza indirmek için olabildiğince az hayvan kullanılmasına özen gösterilmelidir (Örneğin, sabitlenmiş doz yöntemi (Yöntem B.1 bis) ve akut toksik sınıf (Yöntem B.1 tris) için). Seviye 1 testinde, bir ikinci tür çalışması ilk çalışmadan elde edilen yorumlar için tamamlayıcı olabilir. Bu durumda, standart bir test yöntemi kullanılabilir veya yöntem daha düşük hayvan sayılarına uygun hale getirilebilir. Tekrarlı doz toksisite testi (Yöntem B.7, B.8 ve B.9) tekrarlanan maruz kalmadan kaynaklanan toksik etkilerin değerlendirilmesini içerir. Mümkün olabildiğince çok bilgi elde edilebilmesi için hayvanların klinik olarak gözlemlenmesi önemlidir. Bu testler, toksik dozların, hedef organlar üzerindeki toksisite etkilerinin açıklığa kavuşturulması hususunda yardımcı olabilir. Uzun dönemli çalışmalarda, bu bakış açılarının daha derinlemesine araştırılması gerekli olabilir (Yöntemler B.26 – B.30 ve B.33).
Mutajenite, hücreye veya organizmaya ait genetik materyalin yapısı ve miktarında birinden diğerine geçebilen kalıcı değişikliklerin oluşmasıdır. Bu değişiklikler, ‘mutasyonlar’, tek bir geni, gen bölümlerini, bir gen bloğunu veya tüm kromozomu içerebilir. Tüm kromozomlar üzerindeki etkiler yapısal ve/veya sayısal olabilir. Temel grup bilgisi için, maddenin mutajenik aktivitesi, bakterideki gen mutasyonları (Yöntem B.13/14) ve memeli hücrelerindeki yapısal kromozom sapmaları (Yöntem B.10) için in vitro çalışmaları ile değerlendirilir. Kabul edilebilir olanlar, canlı dokuda (in vivo) yürütülen çalışmalardır. Mikroçekirdek testleri (Yöntem B.12) veya kemik iliği hücrelerinin metafaz analizi (Yöntem B.11) gibi yöntemler örnek gösterilebilir. Fakat herhangi aksi bir etki yokluğunda (kontraendikasyon) in vitro yöntemler çok tercih edilir. Mutajenitenin incelenmesi ve kanser oluşumlarının önceden izlenebilmesi için ek çalışmalar daha yüksek üretim hacimleri ve/veya risk değerlendirilmesi için gereklidir ve bunlar temel gruptan elde edilen sonuçları doğrulamak; temel grupta çalışılmamış uç noktaları incelemek; canlı doku içerisindeki (in vivo) çalışmaları başlatmak veya devam ettirmek gibi farklı amaçlarla kullanılabilir. Bu amaçla, yöntem B.15’ den B.25’ e kadar olan yöntemler, hem in vivo hem de in vitro çalışmaları içerirler hem de biyolojik sınır noktaların genişletilmiş aralığını içerirler. Bu testler, temel grup çalışmalarında kullanılan bakterilerden daha karmaşık organizmalarda diğer uç noktaları ve mutasyonlar üzerinde bilgi sağlar. Genel ilke olarak, daha ileri mutajenite çalışmaları programı dikkate alındığında, maddenin mutajenite ve/veya kanserojenlik potansiyeli ile ilgili anlamlı ek bilgi sağlayacak şekilde tasarlanmalıdır. Özgün vakalarda uygun olabilecek fiili çalışmalar, maddenin kimyasal ve fiziksel özelliklerini, ilk bakteriyel sitogenetik analiz sonuçlarını, maddenin metabolik profilini, diğer toksisite çalışmalarının sonuçlarını ve maddenin bilinen kullanım şekillerini de içeren birçok faktöre bağlı olacaktır. Testlerin seçimi için değişmez nitelikte bir program, dikkat gerektiren çeşitli faktörlerin gözlenmesi açısından uygun değildir. Test stratejileri için bazı genel ilkeler Maddelerin Envanteri, Bildirimi ve Risk Değerlendirmesi Usul ve Esaslarıyla ilgili Yönetmelik tarafından ortaya konulur, fakat risk değerlendirmesi için, açık test stratejileri, yinede esnek ve uygun, özgün duruma göre uyarlanabilen, yönetmelikte bulunabilir. Daha ileri araştırmalar için yöntemler genetik uç nokta ilkeleri temel alınarak, aşağıdaki şekilde gruplandırılmışlardır: Gen (nokta) mutasyonlarını incelemek için yapılan çalışmalar a) Ökaryotik mikroorganizmalar kullanılarak yapılan ileri ve geri mutasyon çalışmaları (Saccharomyces cerevisiae) (Yöntem B.15), b) Memeli hücrelerindeki ileri yöndeki mutasyonu incelemek için in vitro çalışmalar (Yöntem B.17), c) Drosophila melanogaster’ deki cinsiyete bağlı çekinik öldürücü analiz, (Yöntem B.2) d) In vivo somatik hücre mutasyon analizi, fare benek testi, (Yöntem B.24) Kromozomların normal durumlardan sapmalarını inceleme çalışmaları a) Memelilerdeki in vivo sitogenetik çalışmalar; ilk değerlendirmede (Yöntem B.11) dahil edilmemişse, kemik iliği hücrelerinin in vivo metafaz analizi dikkate alınmalıdır. Ayrıca, in vivo eşey hücre sitogenetikleri incelenebilir (Yöntem B.23), b) İlk değerlendirmede dahil edilmemişse, memeli hücrelerindeki in vitro sitogenetik çalışmalar (Yöntem B.10), c) Kemirgenlerdeki baskın öldürücü çalışmalar (Yöntem B.22), d) Fare kalıtımsal yer değiştirme testi (Yöntem B.25), Genotoksik etkiler- DNA üzerindeki etkiler. Mutajenisite ile ilişkilendirilmeyen ve genetik materyal üzerindeki zararlı etkiler olarak tanımlanan genotoksiklik, doğrudan mutasyon kanıtı olmadan DNA’ya verilmiş zararlar ile belirtilebilir. Ökaryotik mikroorganizmaları ya da memeli hücrelerini kullanan aşağıdaki yöntemler bu tür araştırma için uygun olabilir.
Kanserojenlik potansiyelinin araştırılması için alternatif yöntemler Hücre kültürlerinde maddenin malignant (kötü huylu tümör) dönüşümü ile ilgili olduğu düşünülen morfolojik ve davranışsal etkiler tetiklemesini ölçebilen ve memeli hücre dönüşüm analizleri mevcuttur (Yöntem B.21). Değişik hücre türleri ve dönüşüm ölçütleri kullanılabilir. Memelilerde kalıtımsal etkiler için risk değerlendirilmesi Genlerde oluşan nokta mutasyonlarla oluşan kalıtımsal etkileri, örneğin ilk jenerasyonda eşey hücresinin (germ-cell) mutasyonunu ölçmek için fareye özgü lokus testi (Bu ekte verilmemiştir), ya da kromozomal bozukluklar için (fare kalıtımsal yer değiştirme testi gibi) (Yöntem B.25), ölçebilecek yöntemler mevcuttur. Bu gibi yöntemler, maddenin insan sağlığına olası genetik risklerin tahmininde kullanılabilir ancak bu testlerdeki karmaşıklar açısından bakıldığında ve özellikle özgül lokus testi için çok fazla sayıda hayvana ihtiyaç olduğu, göz önüne alınırsa testler yürütülmeden önce güçlü bir doğrulamaya ihtiyaç vardır.
Kimyasallar, tahmin edilen etki mekanizmasına göre genotoksik ve genotoksik olmayan kanserojenler olarak sınıflandırılabilir. Maddenin genotoksik potansiyeli hakkındaki ön tarama bilgileri mutajeniklik/ genotoksiklik çalışmalarında elde edilebilir. İlave bilgiler tekrarlı doz, subkronik yada kronik toksisite testlerinden elde edilebilir. Tekrarlı doz toksisite testleri, Yöntem B.7 ve daha uzun tekrarlı doz çalışmaları, tekrarlı doz testlerinde gözlenen histopatolojik değişiklerini ilgili dokularda hiperplazya gibi, değerlendirilmesini içerir. Bu çalışmalar ve toksikokinetik çalışmalar, bu özelliklerinin belirlenmesi için daha ileri araştırmaya ihtiyaç duyan kanserojenik potansiyeldeki kimyasalların kanserojenlik testinde (Yöntem B.32) ya da bileşik kronik toksisite/kanserojenite (Yöntem B.33) testinde tanımlanmasına yardım edebilir.
Üreme sistemine toksisite, ‘doğurganlık üzerine etki’ olarak tanımlanan, dişi ya da erkeğin üreme işlevlerinin azalması yada normal embriyonik gelişimde ve emzirme dönemini de içeren ve ‘gelişimsel toksisite’ olarak tanımlanan veya, döller üzerinde kalıtımsal olmayan zararlı etkilerin tetiklenmesi gibi farklı yollarla belirlenebilir. Gelişimsel toksisite testinin bir parçası olarak normal embriyonik gelişim çalışmaları için test yöntemi (Yöntem B.31) birincil olarak oral (ağız) yoldan alım ile uygulanır. Alternatif olarak test maddesinin fiziksel özelliklerine bağlı olarak, diğer yollar da kullanılabilir. Böyle hallerde test yöntemi 28 günlük test yönteminin uygun elemanlarını dikkate alarak uygun bir şekilde adapte edilmelidir. Üçüncü jenerasyon üreme testi gerektiğinde, iki jenerasyon üreme testi için açıklanan yöntem ( Yöntem B.35), üçüncü jenerasyonu kapsayacak şekilde genişletilebilir. B.V. Nörotoksisite Nörotoksisite, merkezi ya da çevresel sinir sisteminde yapısal ya da biyokimyasal değişiklikler ya da fonksiyonel değişimler gibi farklı yollarla belirlenebilir. Nörotoksisitenin birincil işareti akut toksisite testlerinden elde edilebilir. Tekrarlı doz toksisite testi, Yöntem B.7, nörotoksikolojik etkilerin değerlendirilmesini içerir ve mümkün olan en fazla bilgiyi elde edebilmek için hayvanlar hakkındaki klinik gözlemlere önem verilir. Yöntem, bu özelliğin daha derinlemesine araştırılmasına ihtiyaç duyan nörotoksik potansiyeldeki hayvanları tanımlamaya yardım etmelidir. Ek olarak, diğer toksisite çalışmalarında belirlenemeyen maddelerin özgül toksisite potansiyellerini de dikkate almak önemlidir. Örneğin bazı fosforlu organik bileşiklerin geciktirilmiş nörotoksisiteye neden olduğu gözlenmiştir ve bunlar test yöntemi B.37 ve B.38’de tekli yada çoklu dozlara maruz kalma izlenerek belirlenebilir.
İmmüntoksisite, immünbaskılama ve/veya aşırı duyarlılık ya da uyarılmış kendiliğinden immünite ile sonuçlanan immün sistem cevaplarının güçlendirilmesi gibi farklı yollarla belirlenebilir. Tekrarlı doz toksisite testi, Yöntem B7, immunotoksik etkilerin değerlendirilmesini içerir. Yöntem immüntoksik potansiyeldeki ve bu özelliklerinin belirlenmesi için daha derinlemesine testler gereken kimyasalları tanımlamakta yardımcı olacaktır. B.VII Toksikokinetik Toksikokinetik çalışmalar, toksisite verilerinin yorumlanması ve değerlendirilmesine yardımcı olur. Bu çalışmalar, test edilen kimyasalın toksisitesine ilişkin özel durumlarını açıklamak amacıyla geliştirilmiştir ve sonuçlar ileri toksisite testlerinin tasarımına yardımcı olur. Bütün değişkenlerin tüm hallerde belirlenmesi öngörülmemiştir. Sadece nadir durumlarda toksikokinetik çalışmaların tüm aşamaları gerekli olabilir (emilim, atılım, dağılım ve metabolizma). Belli bileşikler için, bu dizilimdeki değişiklikler önerilebilir yada tek doz çalışması yeterli olabilir.(Yöntem B.36). Kimyasal yapı(SAR) hakkında bilgi ya da fizikokimyasal özellikler, istenilen uygulama yolu ve metabolik ve dokusal dağılım olasılıkları aracılığıyla, absorbsiyon (emilim) karakteristikleri hakkında bir belirti sağlayabilir. Ayrıca daha önceki toksisite ve toksisokinetik çalışmalarda toksikokinetik parametreler bulunabilir.
Deney hayvanı odalarındaki çevresel koşullar ya da duvarlar test türlerine uygun olmalıdır. Sıçanlar, fareler ve gine domuzu (guinepig) için uygun koşullar, %30 ila %70 bağıl nemde 22ºC ±3ºC dir. Tavşanlar için sıcaklık %30 ila %70 bağıl nemde 20ºC ±3ºC olmalıdır. Bazı deneysel teknikler sıcaklık etkilerine özel olarak duyarlıdır ve bu hallerde uygun koşulların ayrıntıları, test yönteminin açıklamasında verilir. Tüm toksik etki araştırmalarında, sıcaklık ve nem izlenmeli, kaydedilmeli ve çalışmanın son raporunda verilmelidir. Işıklandırma yapay olmalıdır ve 12 saat aydınlık 12 saat karanlık olacak sırada olmalıdır. Işıklandırma şablonu çalışmanın son raporunda belirtilmelidir. Test yönteminde aksi belirtilmedikçe, hayvanlar ayrı ayrı barındırılmalı ya da küçük aynı cinsiyetten gruplar halinde kafeslenmelidir ve bu hallerde kafes başına hayvan sayısı beş’i geçmemelidir. Hayvan deneylerinin raporunda, kullanılan kafesin cinsini ve maruz kalma sırasında ve sonrasında gözlem evresinde her bir kafesteki hayvan sayısını belirtmek önemlidir.
Beslenme programı, test edilen türlerin besin gereksinmelerini karşılayacak özellikte olmalıdır. Test maddeleri hayvanların besinleri ile veriliyorsa, besin,test maddesi ve besin bileşenleri arasındaki etkileşim nedeniyle azalabilir. Bu tür bir tepkimenin olabilirliği testin sonuçları yorumlanırken göz önüne alınmalıdır. Yerleşik laboratuvar beslenme rejimleri, sınırsız su kaynağı ile birlikte kullanılmalıdır. Beslenme rejiminin seçimi bu metot aracılığı ile verildiğinde, uygun karışmayı sağlama gereksiniminden etkilenebilir. Toksisiteyi etkileyen besin kirleticileri birbirini etkileyen konsantrasyonlarda bulunmamalıdır. Ç. ALTERNATİF TESTLER Ülkemizin bilimsel hedeflerinden biri, mevcut hayvan testleri, daha az hayvan kullanılan, daha az acıya yol açan veya hayvanların tümünün kullanılmasından kaçınılan, mevcut hayvan testlerindeki bilgilerle aynı seviyede bilgi sağlayan alternatif tekniklerin geliştirilmesi ve geçerliliklerini sağlamaktır. Bu tür yöntemler, elde edilebilir olduğunda, zarar belirlemesi ve gerçek(iç) zararlar için sınıflandırılması ve etiketlenmesi için değerlendirilmelidir. D.DEĞERLENDİRME VE YORUM Testler değerlendirildiklerinde ve yorumlandıklarında, hayvanlarda veya in vitro olarak yapılan çalışmaların sonuçlarının doğrudan insana uyarlanmasındaki sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Bu sebeple insanlardaki olumsuz etkilerine dair kanıt varsa, test sonuçlarının doğrulanmasında kullanılabilir. E. KAYNAKLAR Bu yöntemlerin pek çoğu OECD Test Dokümanı Programı çerçevesinde geliştirilmiştir ve karşılıklı kabul edilebilir veri sağlayabilmek için İyi Laboratuvar Uygulamaları ilkelerine göre uygulanmalıdır. İlave bilgiler OECD rehber dokümanından ve başka diğer kaynaklardan temin edilebilir. Yüklə 5,29 Mb. Dostları ilə paylaş:
|