Lékařská fakulta, Masarykova Univerzita

XI. Dodatky
XI-1. Dodatek 1 – Geny postižené různými mechanismy kancerogeneze
Tabulka XI-1: Mechanismy karcinogeneze u HCC umožňující detekci rizika jeho vzniku

Stresor	Mechanismus	Výsledek
HBV infekce	Inzerce HBV DNA	Chromozomální instabilita
	Inzerce HBV DNA do specifických míst	Porucha regulace exprese vlastních genů buňky – ß-receptor kyseliny retinové, A-cyklinu a mevalonát syntázy – dnes známo až 15 genů
	Exprese virových proteinů jako např. Hbx	Modulace buněčného cyklu, vazba na p53 s inaktivací p53 indukované apoptózy
aflatoxin B1 expozice	Transformace AFB1 na aktivní metabolity v játrech	DNA adukty
		reakce AFB1 epoxidu s guaninem v DNA – GC-TA konverze vedoucí k záměně R-S na kodonu 249.
vinyl chlorid	K-ras-2 mutace ve 33%	Spíše angiosarkom než HCC,
adenom	Bialelická mutace transkripčního faktoru 1(TCF1) kódující jaterní nukleární faktor 1α (HNF1 α) v 60% adenomů	Inaktivace TCF1
nespecifické faktory	Chromozomální aberace a) Delece chromozomálních ramínek 17p, 8p, 16q, 16p, 4q, 9p, 13q, 1p, 6q b) Inzerce 1q, 7q, 8q, 17q vedoucí k inaktivaci tumor supresorových genů	Defekt tumorsupresoru p53 (17p) Retinoblastom 1 (13q) Axis inhibitor protein 1 (16p) CDKN2A (9p) IGF2R (6q)
*CDKN2A – 2A inhibitor cyklin-dependentní kinázy

Tabulka XI-2: Geny spolupodílející se na HNPCC

gen	chromozóm	% nádorů s mutací	Typ genu
hMSH2	2p15-16	70%	MMS
hMLH1	3p21		MMS
hPMS1	2q31		MMS
hPMS2	7q22		MMS
hMSH6/GTBP			MMS
myc	8	2	onkogen
K-ras	12	50	onkogen
p53	17	nad 70	tumorsupresor
DCC	18	nad 70	tumorsupresor
APC	5q21	nad 70	tumorsupresor

XI-2. Dodatek 2 – Antigeny produkované nádorovými buňkami
Tabulka XI-3: Rodina adhezivních molekul

Imunoglubuliny (dle genů které spolukódují Ig	N-CAM (Myelin protein 0), ICAM (1-4), VCAM-1, PE-CAM, L1-CAM
Kadheriny	Desmoglein, (T,E,P,N)-kadheriny
Selektiny	(E, L, P)- selektiny
Integriny	LFA-1, integrin 2, integriny 1-8, Makrofág-1 antigen, VLA-4, IIb/IIIa glykoprotein destiček
Ostatní	CEA, 5T4, CD22, CD24, CD44, CD146, CD164

Tabulka XI-4: Antigeny ve zvýšené míře exprimované nádorem uvolňované do séra

Skupina	Konkrétní antigeny	Poznámky
fetální antigeny	CEA, 5T4, AFP, HCG, CA 72-4 , CA19-9	V dospělosti je exprimují prakticky jen nádorové buňky, CEA a 5T4 jsou užívány k cílené molekulární diagnostice nebo léčbě., CA 19-9 je identický s antigenem Lewisova faktoru krvinek. Lewis negativní pacienti tento antigen nebudou nikdy exprimovat nádorem (až 10%).
enzymy zvýšeného metabolismu	tymidinkináza, MMP,	Reakcí na MMP je zvýšená syntéza TIMP, které lze také detekovat. Výše koreluje s agresivitou nádoru.
Odpadní produkty zvýšeného metabolismu	TPS, TPA, CYFRA 21-1	degradační produkty cytokeratinů – typické pro karcinomy (epitely). Zvýšená obnova epitelů vede k jejich zvýšené hladině
hormony, růstové působky	VEGF,	vysoká hladina je negativní prediktor průběhu

XI-3. Dodatek 3 – Regulace metaloproteináz a angiogeneze
Tabulka XI-5: cesty regulace MMP (tečkovaná čára znamená inhibici) (PAI – Plasmin activator inhibitor, uPA- urokinázový plasmin activator,)

Pozitivní efekt		Negativní efekt
IL-1, TNF, PDGF, Forbol	MMP geny	TGF , Retionoidy Heparin Kortikosteroidy
	TRANSKRIPCE
TNF aktivace	ZYMOGENY	TIMP geny
PAI-1, PAI-2	Pro-stromelazin Pro-gelatináza A Pro-gelatináza B Pro-kolagenáza
uPA, Plasmin MTMMP	AKTIVACE	TIMP 1, 2, 3, 4
	AKTIVNÍ ENZYMY
Pozitivní zpětná vazba	Stromelazin Gelatináza A Gelatináza B Kolagenáza	TIMP 1,2 Tetracykliny Antracykliny Syntetické inhibitory
	PROTEOLÝZA
Extracelulární matrix		LMW peptidy

Tabulka XI-6: regulace angiogeneze

Pozitivní regulátory	Negativní regulátory
Fibroblast growth faktory	Thrombospondin-1
Placentální growth faktor	Angiostatin
Vascular endothelial growth faktor	Interferon-
Transforming growth faktory	16 kDa fragment prolaktinu
Angiogenin	Destičkový faktor 4
G-CSF	Genistein
PDEGF	Placentární proliferin-related protein
Interleukin-8	TGF -  ???

XI-4. Dodatek 4 – Protokol testování cytostatik in vitro
Vlastní provedení testu začíná homogenizací tkáně. Tkáň je rozdrcena na sterilním kovovém sítku, nanesena na Lymphoprep a centrifugací jsou separovány homogenizované buňky od erytrocytů, nebuněčného materiálu a nezhomogenizovaných částí tkáně. Buňky jsou odebrány, opakovaně promyty a přeneseny do média. Jako vhodné kultivační médium bylo vybráno: RPMI 1640 (Gibco BRL) obohacené o 10 – 15 % bovinní fetální sérum, 1% roztok penicilinu a streptomycinu a 40 g/ml gentamycinu. Celá práce probíhá ve sterilním laminární boxu, všechny nástroje, plastik a roztoky jsou sterilní, případně určené pro jednorázové použití.

Kultivace buněčných explantátů a jejich inkubace s cytostatiky: Připravené homogenizované buňky v kultivačním médiu jsou naředěny na koncentraci 10⁶ buněk na 1ml a alikvotovány do jamek 96-jamkové ELISA-destičky. Ve dvou řadách je na destičce ponecháno médium bez buněk. Toto médium slouží jednak jako kontrola sterility , ale hlavně při závěrečném měření absorbance poskytuje referenční hodnotu (blank). V dalších dvou řadách je médium s buňkami, ke kterým se nepřidává žádné cytostatikum. Toto slouží jako kontrola viability buněk a je takto získána referenční hodnota, ke které se potom vztahují hodnoty rezistence. A konečně dále následují řady, do kterých se k buňkám přidávají cytostatika. Spektrum cytostatik a jejich přesné koncentrace jsou voleny v panelech podle typu nádoru, případně individuálně podle historie léčby nebo podle konkrétního požadavku klinika. Takto připravené buňky jsou kultivovány 72 hodin v inkubátoru ve 37 °C v 5 % CO₂.

MTT test: Pro měření buněčné proliferace a viability bylo vyvinuto několik typů tetrazoliových solí, např. MTT, XTT, MTS a WST-1. Všechny tyto soli jsou buněčnými dehydrogenázami štěpeny na formazany, a proto jsou pro stanovení stejně využitelné. Nicméně se liší některými svými vlastnostmi jako např. stabilitou a dále rozpustností svých produktů. Jako vhodný substrát jsme pro test viability/proliferace vybrali WST-1. Je stabilnější ve srovnání s XTT a MTS a jeho formazanové produkty jsou rozpustné ve vodě, na rozdíl od produktů MTT, které se musí rozpouštět v DMSO, což celý postup komplikuje a vyžaduje další přístrojové vybavení (např. centrifugu s rotorem na ELISA destičky). Vlastní test se provádí tak, že WST-1 se přidává k inkubovaným buňkám a ty jsou inkubovány další 2 hodiny ve 37 °C v 5 % atmosféře CO₂. Následuje měření absorbance na přístroji ELISA reader při vlnové délce 420 až 480 nm (s maximem kolem 440 nm), kdy jako referenční je použita hodnota absorbance naměřená v kultivačním médiu bez buněk. Výsledky měření absorbance jsou potom statisticky zpracovány, a to pomocí softwaru „Chemorezist“ (laskavě poskytnuto Doc. RNDr. L.Duškem, CSc. a Mgr. B. Regnerem z Centra informatiky a analýz UOC, LF MU Brno).

XI-5. Dodatek 5 – Možnosti Gene silencingu
Tabulka XI-7: Možné postupy silencingu genů využitelné klinicky. (Scherer 2003)

Postup	Výhody	Nevýhody
Protismyslové oligodeoxyribonukleové kyseliny (ODN), antisense DNA	Mohou být modifikovány, aby se zvýšila specificita a účinnost Mohou být cíleny do intronů Jednoduchá příprava	Mohou spustit interferonovou odpověď Vážou se na proteiny Dají se podávat pouze exogenně Mají i necílené účinky
Ribozymy - jsou RNA molekuly s katalytickou funkcí a mohou mít více aktivit. Jsou tvořeny v buňce během transkripce nebo do ní mohou být vpraveny experimentálně	Mohou rozeznat SNP. Mohou být použity pro korekci defektů Lze připojit sekvenci pro změnu cílové RNA. Jednoduchá katalytická doména Mohou být cíleny do intronů či buněčných organel	Potřebují GUC triplet, což limituje výběr potenciálních cílů Vážou se na proteiny
DNAzymy – analog Ribozymů	Levná výroba, dobré katalytické vlastnosti. Mohou být modifikovány pro systémové podávání	Pouze exogenní aktivita Mají i necílené účinky
RNAi (siRNA, shRNA), shRNA je tvořená „vlásenkou“ sense-loop-antisense, která je v buňce štěpena siRNA duplexy	Účinné i v nízkých koncentracích Obchází interferonovou odpověď Mohou být podány různými způsoby Možnost tkáňové specificity Pravděpodobně nejsou toxické Dlouhodobý efekt	Nemohou utlumit jaderné RNA Nemohou být cíleny do intronů Nemohou být jednoduše optimalizovány Někdy mají nespecifické účinky, které však lze omezit vhodným návrhem siRNA sekvencí
miRNA (microRNA) - malé (~22 nukleotidů) nekódující RNA molekuly, které buňky přirozeně používají k negativní regulaci genové exprese na posttranskripční úrovni.	Jestliže se setká se zcela komplementární sekvencí, může se miRNA molekula chovat jako siRNA a spustit degradaci komplementárních řetězců. Jinak přirozeně regulují genovou expresi na úrovni translace.