140
Birinci reaksiya zamanı alınan məhsul (dinitrofenil-peptid)
turş mühitdə
hidroliz edildikdən sonra xromatoqrafiya üsulu ilə aminturşu fraksiyalarına
ayrılır; polipeptid zəncirinin N-terminal hissəsində yerləşən aminturşu qalı-
ğının DNF ilə birləşməsi digər aminturşulardan rənginin sarılığına görə
fərqlənir. Bu fraksiyanı ayırıb, aminturşunun növünü müəyyənləşdirirlər.
Aparılan tədqiqat zamanı bir neçə növ DNF-aminturşu törəməsinin alınması
tədqiq edilən zülal molekulunun bir neçə növ polipeptid zəncirinin
birləşməsindən ibarət olduğunu göstərir.
Peptid zəncirindəki N-terminal aminturşunu müəyyənləşdirmək üçün
Edmanın f e n i l t i o h i d a n t o i n üsulundan daha geniş istifadə edilir.
Çünki, bu üsul həssaslıq dərəcəsinə və mərhələlərlə təkrar edilməsinin
mümkünlüyünə görə, Sengerin DNFB üsulundan üstündür. Bu üsul
fenilizotiosianatın peptid zənciri ilə spesifik
reaksiya verməsi prinsipinə
əsaslanır: reaktiv peptid zəncirinin uc hissəsində yerləşən və sərbəst amin
qrupuna malik olan aminturşu qalığı ilə birləşir:
Reaksiyanın məhsuluna otaq temperaturu şəraitində turşu vasitəsilə təsir
edildikdə N-terminal hissədə yerləşən aminturşu ilə fenilizotiosianatın
birləşməsi peptid zəncirindən ayrılır və feniltiohidantoin adlanan tsiklik
birləşməyə çevrilir, peptid isə 1 aminturşu qalığı qədər qısalır:
feniltiokarbamil- feniltiohidantoin
peptid
]
[
141
Polipeptid zəncirini Edman üsulu ilə deqradasiyaya
uğratmaq üçün çox
vaxt xüsusi avtomatik cihazdan istifadə edilir. Əlverişli şərait olduqda bu cihaz
vasitəsilə çoxmərhələli reaksiya apararaq, peptid zəncirindən ardıcıl yerləşmiş
40-50 aminturşunu ayırmaq mümkündür. Hər bir mərhələdən sonra turş
mühitdə hidroliz vasitəsilə əmələ gələn feniltiohidantoin fraksiyası nazik qatlı
və ya qazlı-mayeli xromatoqrafiya üsulu vasitəsilə ayrılmalı və onun tərkibin-
dən ayrılıb sərbəst hala keçən aminturşunun növü müəyyənləşdirilməlidir. Bu
təyinatı dəfələrlə təkrar etməklə, polipeptid zəncirində aminturşuların hansı
ardıcıllıqla yerləşdiyini (N-terminal hissədən başlamaqla) aydınlaşdırırlar.
N-terminal aminturşuları müəyyənləşdirmək məqsədilə istifadə edilən
həssas tədqiqat üsullarından biri də dansilxlorid (1-dimetilamin-naftalin-5-
sulfonilxlorid) vasitəsilə aparılan sınaqdır. Dansilxloridin aminturşularla qarşı-
lıqlı təsiri nəticəsində əmələ gələn birləşmələri güclü flüoressensiyaedici xassə-
ləri sayəsində, hətta ən cüzi qatılıqda olduqda da aşkara çıxarmaq mümkündür.
Dansilxlorid sınağından çox vaxt Edmanın deqredasiya
üsulu ilə birlikdə
istifadə edilir. Yəni bu iki metod bir-birilə növbələşdirilir: fenilizotiosianatın
təsirindən sonra peptid molekulunun qalan hissəsinə dansilxloridlə təsir gös
-
tərilir, sonra isə peptid zəncirindəki növbəti aminturşu qalığının təbiəti
aydınlaşdırılır.
N-terminal aminturşunu təyin etmək üçün kimyəvi üsullardan başqa,
proteolitik fermentlərdən də istifadə etmək olar. Bu məqsədlə tədqiqat aparı-
larkən proteolitik fermentlərin təsir spesifikliyi, yəni
seçici surətdə hidrolizə
uğratdığı peptid rabitələrinin növü nəzərə alınmalıdır (cədvəl 4.9). Məsələn,
leysinaminpeptidaza peptid zəncirinə sərbəst amin qrupu olan tərəfdən hidro-
litik təsir göstərir. Bu ferment peptid zəncirində yerləşən və NH
2
qrupları sər-
bəst olan leysin qalıqlarının karboksil qrupu vasitəsilə yaratdığı peptid rabitə-
sini digər aminturşuların birləşmələrinə nisbətən sürətlə hidroliz edir. Lakin
onun təsiri ilə prolindən başqa, bütün aminturşuların peptid rabitələri, ardıcıl
növbələşdirilməklə, parçalanır. Leysinaminpeptidazanın
təsiri nəticəsində
aminturşu qalıqları peptid zəncirindən növbə ilə (bir-bir) ayrılır. Yəni əgər
peptid zəncirinin amin qrupu sərbəst olan tərəfində aminturşuların düzülüşünü
H
2
N-A,B,C,Ç.... kimi işarə etsək, leysinaminpeptidazanın təsiri zamanı mole-
kuldan əvvəl A, sonra B, daha sonra isə C, Ç hərfləri ilə işarə edilən
aminturşular ayrıla bilir. Buna görə, fermentativ katalizin bütün mərhələlərində
sərbəst hala keçmiş A aminturşusunun miqdarı B-dən, B aminturşusunun
142
miqdarı C-dən, C aminturşusunun miqdarı isə Ç-dən artıq olacaqdır. Buna
əsaslanaraq, aminturşuların hansı sürətlə ayrılmasını aydınlaşdırmaqla, onların
peptid zəncirindəki ardıcıllığı haqqında nəticə çıxarmaq olar.
Yuxarıda təsvir edilən kimyəvi və fermentativ üsullar yalnız yeganə peptid
zəncirinin və ya eyni peptid zəncirlərinə malik olan zülal molekullarının
tədqiqi zamanı düzgün nəticə verə bilər. Bir sıra zülalların
tərkibində peptid
zəncirlərinin sayı ilə sərbəst şəkildə olan amin qruplarının sayı bir-birinə
bərabər olur. Lakin sərbəst amin qruplarına malik olmayan zülallar da vardır
(məsələn, sitoxrom C-nin apoferment hissəsi, ovalbumin və s.). Bu zülalların
bəzilərinin başlanğıc hissəsində yerləşən amin qrupları asetilləşmiş vəziyyətdə
olur. Bəzi zülallarda isə molekulun uc hissəsində piroqlutamin (pirrolidon-
karbon) turşusu yerləşir. Adı çəkilən birləşmə molekulunun başlanğıc hissə-
sində qlutamin turşusu olan zülalların tərkibində, onların sintezindən sonrakı
dövrdə əmələ gəlir. Bu zaman əvvəlcə qlutamin
turşusunun ikinci karboksil
qrupu ammonyakla reaksiyaya girir; nəticədə qlutamin turşusu qalığı qlutamin
qalığına (qlutamin turşusunun amidi) çevrilir; bundan sonra qlutaminin
-amin
azotu molekuldan ayrılır,
-amin qrupu ilə karbonil qrupu arasında rabitə
yaranır; beləliklə, zülal molekulunun uc hissəsində piroqlutamin turşusu qalığı
əmələ gəlir.
Dostları ilə paylaş: